诱导后上清液在BMSCs向神经元样细胞分化中的作用

目的:研究体外使用SHH、Ra、Fn组成的诱导体系诱导骨髓间充质细胞后的上清液对BMSCs向神经细胞分化的作用。方法:从健康志愿者髂骨处抽取骨髓4mL,体外分离、培养、扩增后用400ng/LSHH、0.5μmolRa和5μmolFn组成的诱导体系进行诱导,取诱导后12,24h的诱导液上清分别作用于BMSCs。7d后使用倒置显微镜和免疫组织化学方法观察诱导前后细胞的变化。结果:诱导7d之后各组均有部分细胞胞体收缩、伸长突起,表现为神经细胞的形态。12h组同SHH+Ra+Fn组NSE、MAP-2阳性细胞比例差异无显著(P>0.05)。12h组分化率高于24h组(P<0.05)。结论:12h后诱导液上清可以有效地诱导BMSCs向神经细胞分化。     

高浓度他克莫司抑制人骨髓间质干细胞增殖及向成骨细胞分化(英文)

目的探讨他克莫司(FK506)对人骨髓间质干细胞(hBMSCs)增殖及向成骨细胞分化的影响。方法 FK506 0.001~5μmo.lL-1处理hBMSCs细胞中,雌二醇0.01μmol·L-1或咖啡因100μmol·L-1为阳性对照组,作用24 h后用BrdU掺入法检测细胞增殖,在促成骨细胞分化液中作用8 d后用比色法检测碱性磷酸酶(ALP)活性,作用12 d后用邻甲酚酞络合法检测钙沉积量;通过检测磷酸盐释放量间接反映钙调神经磷酸酶(CaN)活性,Western印迹法检测核心结合因子α1亚基(Cbfα1)表达。结果与DMSO对照组相比,FK506 0.001~0.01μmol.L-1促进细胞增殖,但对ALP活性及钙沉积量无影响;FK506 0.5~5μmo·lL-1则呈浓度依赖性地抑制细胞增殖,显著抑制ALP活性及减少钙沉积量(P<0.05)。此外,FK5060.1~5μmo·lL-1呈浓度依赖性地降低CaN活性,与相同浓度FK506呈浓度依赖性地下调Cbfα1的表达效应相一致。结论高浓度FK506可通过CaN/Cbfα1通路抑制hBMSCs增殖及向成骨细胞成骨分化。     

非病毒载体携带Cbfa1诱导成人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的研究

目的:观察核心结合因子a1(Cbfa1)对成人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)向成骨细胞定向分化的诱导作用。方法:经密度梯度离心法和贴壁筛选法获得hBMSCs。非病毒载体FuGene HD携带Cbfa1转染hBMSCs后7、14d,经Real-time PCR分析hBMSCs成骨细胞标志基因表达,包括Cbfa1、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC)、骨桥蛋白(OPN)和Ⅰ型胶原;培养1、2和3周,ALP染色、钙结节染色检测成骨分化。结果:培养的hBMSCs阳性表达CD73,阴性表达CD34。第3代细胞增殖曲线呈"S"形,符合对数生长曲线。Cbfa1转染hBMSCs表现出与成骨细胞相似的形态,成骨细胞标志基因ALP、OC、OPN和Ⅰ型胶原的表达均明显上调,ALP染色阳性,并且有明显的钙结节形成。结论:非病毒载体携带Cbfa1转染hBMSCs可诱导其向成骨细胞分化。     

DHA促NGF诱导的PC12细胞分化与BMPs通路关系的研究

目的探讨DHA对神经生长因子NGF诱导PC12细胞的分化作用及其对BMP通路的影响。方法分别用100μg·L-1NGF和100μg·L-1NGF+10μmol·L-1DHA处理PC12细胞,并在3、6、9 d进行免疫荧光染色,观察细胞突起长度和突起数目的变化;气相色谱法分析3、6、9 d NGF+DHA组与NGF组PC12细胞的DHA含量;Western blot法检测NGF+DHA组与NGF组中BMP4、BMP7、BMPR-Ⅱ和pSmad 1/5/8蛋白的表达。结果 NGF+DHA处理组与NGF组相比,突起数目和突起长度明显增多和增长(P<0.01);胞内的DHA含量明显增加(P<0.01);BMP4、BMP7、BMPR-Ⅱ和p-Smad 1/5/8蛋白的表达升高(P<0.05)。结论 DHA能促进NGF诱导的PC12细胞分化,其机制可能与上调BMPs蛋白表达有关。     

人骨髓基质干细胞体外分离培养的优化及定向分化的调控

目的 通过改进人骨髓基质干细胞（hBMSCs）的体外培养和定向诱导为神经细胞的方法,以获得纯化hBMSCs以及阳性率更高的神经细胞。方法 采用Percoll-Paque液（1．073g／m1）分离hBMSCs,Mensen Cult培养基体外培养扩增,流式细胞仪检测纯化率。至P3代加入特定组合诱导剂进行定向诱导分化,观察hBMSCs分化为神经细胞的形态学变化,免疫组化和免疫荧光检测特异性神经元烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性细胞数。结果Mensen Cult培养hBMSCs的扩增速度快,纯化率高;在加入特定诱导剂后细胞出现胞体收缩、突起伸出等神经细胞的形态改变,NSE、NF、GFAP均有不同程度阳性率。结论 Mensen Cult是一种较为优秀的hBMSCs体外培养基,而且我们使用的诱导配方效果确切。     

雷洛昔芬通过促进一氧化氮释放诱导脂肪干细胞向成骨细胞分化

目的探讨雷洛昔芬诱导脂肪干细胞向成骨细胞分化作用及其机制。方法从大鼠体内提取分离脂肪干细胞,并进行多向分化能力鉴定。在成骨诱导培养液中加入不同浓度雷洛昔芬(0、0.01、0.1、1μmol.L-1)、非选择性一氧化氮合成酶抑制剂L-硝基精氨酸甲酯(L-NAME(1 mmol.L-1))、雷洛昔芬(1μmol.L-1)+L-NAME(1 mmol.L-1),在共同条件培养14～28 d,测定各项成骨细胞形成指标。结果雷洛昔芬(0.01～1μmol.L-1)能明显提高脂肪干细胞胞质一氧化氮的释放和成骨细胞分化标志基因(碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白2和Ⅰ型胶原)的表达以及矿化结节的生成,L-NAME可以拮抗雷洛昔芬引起的胞质一氧化氮的释放,并同时抑制雷洛昔芬诱导脂肪干细胞向成骨分化的作用。结论雷洛昔芬可以促进胞质一氧化氮释放,从而诱导脂肪干细胞向成骨细胞分化。     

神经生长因子对醋酸铅毒性拮抗效应的研究

目的 :研究神经生长因子 (NGF 2 .5S)对不同浓度的醋酸铅神经毒性拮抗效应 ,观察细胞分化以及细胞形态的影响 ,同时进行了醋酸铅的毒性试验和细胞分化的比较。方法 :利用大鼠胚胎中脑神经细胞作原代微团培养。观察不同浓度 ( 0 .0 0 1～ 5 0 μmol/L)醋酸铅对中脑细胞生长发育的影响。 结果 :染毒组的细胞集落数形成率明显降低 ,细胞体积小 ,细胞间神经纤维减少 ,表明醋酸铅可抑制胚胎中脑神经细胞的分化 ,其半数分化抑制浓度为 1 .0 μmol/L ,半数增殖抑制浓度为 2 0 .0 μmol/L ,并显剂量 效应关系。当加入NGF 2 .5S后 ,在同浓度的醋酸铅情况下 ,微团中的集落形成率有明显的增加。结论 :NGF 2 .5S对醋酸铅的神经毒性有一定的拮抗效应。     

果糖二磷酸锌对体外培养新生小鼠大脑皮层神经细胞生长发育的影响

目的 :研究不同剂量果糖二磷酸锌 (ZnFDP)对体外培养新生小鼠大脑皮层神经细胞的生长发育的影响。方法 :采用体外培养的新生小鼠大脑皮层神经细胞 ,在血清培养液中加入低、中、高3种剂量ZnFDP ,使之终浓度分别为2 5、12 5、125μg/ml,通过细胞形态学观察、神经元突起和胞体生长状况的定量比较、不同培养期细胞存活数和培养液中乳酸脱氢酶 (LDH)渗漏量的测定来考察ZnFDP对大脑皮层神经细胞生长发育的影响。结果 :培养48h后与对照组比较 ,中剂量ZnFDP组大脑皮层神经元的突起数目增多 ,突起长度增加 ,胞体长径没有显著性变化 ;低剂量ZnFDP组与对照组比较 ,各项指标没有显著性差别 ;高剂量ZnFDP组则明显抑制神经细胞分化。培养3、7、10d ,中剂量ZnFDP组细胞存活数明显高于对照组 ;培养7、10d ,中剂量ZnFDP组LDH渗漏量明显低于对照组。结论 :适量的ZnFDP能促进大脑皮层神经细胞的生长发育。     

胎鼠脑神经干细胞的分离、培养和鉴定

目的 研究胎鼠脑皮质神经干细胞(NSCs)的分离、培养及鉴定方法。方法 从孕15d胎鼠的大脑皮层和海马区脑组织中获取NSCs,在含有B27、表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维生长因子(bFGF)的DMEM/F12无血清培养液中培养;传代后用5%胎牛血清培养液诱导NSCs分化。结果 体外分离培养的NSCs在无血清培养液中形成大量的神经球。经3-5代传代的细胞生长稳定。经巢蛋白染色鉴定,大部分为阳性细胞,神经细胞球经胎牛血清培养液贴壁培养后可分化为神经元特异烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白和半乳糖脑苷脂表达阳性的细胞。结论 从孕15d胎鼠大脑皮质和海马组织分离出的NSCs具有自我更新能力和多向分化潜能,其在5%胎牛血清培养液中具有向神经元和神经胶质细胞分化的潜能。     

大黄素对体外大鼠骨髓基质细胞向成骨细胞方向分化的影响

目的 :观察大黄素对骨髓基质细胞向成骨细胞方向分化的影响 ,探讨大黄素对干细胞分化方向的调节作用。方法 :用密度梯度离心的方法和传代贴壁筛选的方法相结合 ,分离纯化骨髓基质细胞。对硝基苯磷酸盐法判断是否成功诱导骨髓基质细胞向成骨细胞方向分化 ,碱性磷酸酶染色法、放射免疫测定法观察大黄素对骨髓基质细胞向成骨细胞方向分化的影响。结果 :结合密度梯度离心的方法和传代贴壁筛选的方法 ,分离纯化后可得到成分较为均一的骨髓基质细胞 ,其间存在有间质干细胞 ,经诱导后向成骨细胞方向分化。大黄素可增加大鼠骨髓基质细胞成骨诱导后细胞碱性磷酸酶的含量 ,其中10 -6mol·L-1浓度组作用 7d时效果明显。大黄素在 2 .5× 10 -7～ 10 -5mol·L-1浓度范围内未能增加细胞上清液和细胞裂解液中骨钙素含量。结论 :大黄素能促进骨髓基质细胞向成骨细胞方向分化 ,这一作用主要体现在骨形成过程的早期 ,对矿化期没有促进作用。     

抑制PI3K/Akt信号通路对HER-2/neu诱导的Ishikawa细胞增殖的影响

目的研究抑制磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路对表皮生长因子受体2(HER-2/neu)诱导的雌激素依赖性子宫内膜癌细胞增殖的拮抗作用。方法①表皮生长因子(EGF)处理Ishika-wa细胞株及转染HER-2/neu的Ishikawa细胞株,蛋白印迹法检测转染细胞前后总Akt(t-Akt)及磷酸化Akt(p-Akt)蛋白、环氧化酶(COX)-2蛋白的表达。酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测细胞培养上清液中雌二醇(E2)的含量。②用PI3K/Akt的抑制剂LY294002抑制信号通路,以不同时间(浓度为20μmol/L时,分别作用10,20,40和60min)和不同浓度(5,10,20和40μmol/L)作用30min后,再次检测COX-2的表达水平,ELISA检测E2水平。结果 HER-2/neu可引起子宫内膜癌细胞Akt活化,经EGF刺激后p-Akt/t-Akt比值、COX-2及细胞上清液中E2的表达量在转染组显著高于未转染组(P<0.05)。应用抑制剂抑制PI3K/Akt通路后,转染HER-2/neu的Ishikawa细胞株中COX-2的表达水平低于正常的Ishikawa细胞株,同时细胞上清液中肿瘤E2的含量于转染HER-2/neu的Ishikawa细胞株明显低于正常Ishikawa细胞株(P<0.05);随药物浓度的增加及作用时间的延长,2组细胞COX-2及E2的表达均逐渐减少,且抑制作用与浓度及作用时间呈依赖关系。结论 HER-2/neu可能通过PI3K/Akt通路来诱导COX-2的转录,进而导致雌激素的分泌增多,使子宫内膜癌细胞无限生长。     

Biphasic effect of aspirin on apoptosis of bovine vascular endothelial cells and its molecular mechanism

AIM: To investigate the effect of aspirin on the apoptosis of cultured bovine aortic endothelial cells (BAEC) and the signal pathways involved in this process. METHODS: BAEC were cultured and passaged in Dulbecco's modified Eagle's medium culture medium. Morphologic changes and quantification of apoptotic cells were determined using fluorescence microscope after staining the cells with Hoechst 33258. Cell viability was measured by 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) method. DNA fragmentation was visualized by agarose gel electrophoresis. Phospho-p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) expression was detected by Western blotting. RESULTS: Aspirin at low concentrations from 1X10( -10) mol/L to 1X10( -8) mol/L decreased the apoptosis and p38 MAPK phosphorylation induced by H2O2 in BAEC, while high doses of aspirin (1X10( -7)-1X10( -4) mol/L) induced typical apoptotic changes in BAEC and stimulated the expression of phospho-p38 MAPK in a concentration-dependent manner. SB203580, a specific p38 MAPK inhibitor, blocked such effects. CONCLUSION: Aspirin exhibits a biphasic effect on the apoptosis in BAEC, reducing apoptosis at low concentration and inducing apoptosis at high concentration. p38 MAPK may be an important signal molecule mediating the effects of aspirin.     

高氧对体外培养的人胚肺成纤维细胞的毒性作用

目的研究高氧对体外培养的人胚肺成纤维细胞(HELF)的毒性作用。方法将生长良好的HELF传代后,用无血清培养基培养24h,分别置于空气及体积分数90%O2的细胞培养箱中培养5d,采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力,化学比色法检测细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)及超氧化物歧化酶(SOD)的活性。结果与空气对照组相比,在给予体积分数90%O22d时细胞上清液中LDH含量明显升高,SOD含量则明显减低(P<0.05),且随高氧暴露时间延长,呈现出明显的时间依赖关系(3～5d,P<0.01),细胞大量凋亡。结论体积分数90%O2对体外培养的HELF具有明显的细胞毒性作用,直接引起细胞损伤,加速其凋亡。     

重组人神经生长因子的高效表达和生物活性评价研究

目的利用中国仓鼠卵巢（Chinese Hamster0vary,CH0）细胞真核表达系统,获得高产的人神经生长因子（recombinant human Nerve Growth Factor,rhNGF）表达细胞株并对其分泌的rhNGF生物学活性进行评价。方法设计、合成并构建了携带rhNGF目的基因的GS—DHFR双基因筛选表达载体pDG2．0／NGF。经脂质体转染法将其导入二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞（CHODG44）中,经氨甲喋呤（MTX）和蛋氨酸亚氨基代砜（MSX）两种药物加压筛选和克隆化获得目的细胞株。经过阳离子交换和分子筛纯化,获得rhNGF制品。最后,利用小鼠神经生长因子生物学活性参比品评估纯化制品的生物学活性。结果通过基因合成、载体构建、细胞转染、加压筛选和克隆化等步骤,我们得到了高表达rhNGF的CHO—DG44单克隆细胞株。经过2步法纯化获得了纯度大于98％的精制rhNGF制品。生物学活性分析表明,与市售小鼠NGF产品相比较,我们所表达的rhNGF具有更好的生物学活性。结论成功实现了rhNGF的高水平和高活性表达,为大规模工业化生产重组人神经生长因子奠定了坚实基础。     

Dual activities of human prolidase.

The cDNA encoding human liver prolidase derived from a healthy adult's liver was cloned into the expression vector pPIC9K of Pichia pastoris to construct the recombination expression vector pPIC9K-P. The pPIC9K-P was digested by restriction enzyme Pme I, and then transformed into P. pastoris GS115 by electroporation. Transformants (the insertion recombinant) were induced by methanol to express the recombination protein. The optimal induction conditions (medium pH, methanol concentration and induction time) of the insertion transformant with the highest enzymatic activity were estimated by orthogonal experimental design L9(3(4)). The SDS-PAGE of the recombinant human prolidase (rh-prolidase) in induction medium showed a molecular weight of 73 kDa. The activities of the rh-prolidase and organophosphoric acid anhydrolases (OPAA) were assayed by colorimetric methods. The recombinant enzyme catalyzed the hydrolysis of organophosphorous compound soman as well as the hydrolysis of dipeptide Gly-Pro. Under the optimal induction conditions, the maximal activities of prolidase and OPAA came to 44.1 and 54.8 nmol/min/mg protein respectively in the medium supernatant. The rh-prolidase purified from the supernatant by ion exchange gradient chromatography (DEAE-Sepharose Fast Flow) and gel filtration chromatography (Sephacryl S-200 High Resolution) showed a single band by SDS-PAGE analysis. The purified rh-prolidase could decompose soman via hydrolytic reaction in vitro.     

骨髓间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞前后基因方面及Ca2+浓度变化的研究

目的观察骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)按照Woodbury经典诱导方案将其诱导分化为神经元样细胞前后基因方面及Ca2+浓度的变化。方法分离纯化SD大鼠MSCs进行传代培养,传至第5代时,按照Woodbury经典诱导方案进行诱导,采用免疫组化和Realtime PCR技术检测诱导前后GAP-43、NSE、NF和Nestin的蛋白和mRNA表达的变化,采用激光扫描共聚焦显微镜检测诱导前后细胞内游离钙离子浓度的变化。结果诱导后GAP-43、NSE、NF和Nestin蛋白表达水平均有增高(P<0.05),但GAP-43、NSE、NF和Nestin基因表达改变不显著(P>0.05),更换诱导液后,细胞内荧光强度逐渐增加,到100s达高峰值,其后逐渐减弱,但20 min时细胞荧光强度仍高于诱导前。结论 MSCs诱导分化为神经元样细胞后GAP-43、NSE、NF和Nestin蛋白表达水平均有增高,但基因表达改变不显著,说明Woodbury经典诱导方案可能为转录后水平即蛋白水平的调控,游离钙离子可能对诱导分化有促进作用。     

苦丁茶熊果酸对鼻咽癌细胞药物干预作用时间与浓度选择

目的探讨苦丁茶熊果酸对鼻咽癌细胞干预作用的最适宜时间与浓度。方法从苦丁茶老叶中提取熊果酸并纯化与鉴定,用5,10,20,40,80,100μmol-L-1 6种浓度的熊果酸,持续作用于在培养的鼻咽癌细胞24,48,72,96,120 h后,用MTT法检测鼻咽癌细胞被抑制情况,流式细胞术分析其细胞周期和凋亡率;光学显微镜观察细胞形态学变化。结果 40,80μmol-L-1的苦丁茶熊果酸经过24 h的作用,抑制NCE-2细胞分别为（41.21±0.25）%和（94.11±0.37）%,两者均能阻滞鼻咽癌细胞于G0/G1期;其阻滞率分别为（73.41±0.17）%和（75.26±0.18）%,40μmol-L-1苦丁茶熊果酸作用24 h时,鼻咽癌细胞即出现细胞萎缩,细胞黏附能力下降,一些细胞逐渐发生碎裂而死亡,细胞数量明显变少;作用48 h后细胞萎缩,轮廓改变程度更深,呈现部分细胞悬浮,黏附能力丧失,发生碎裂而死亡细胞增多,贴壁存活的细胞数量更少。结论从苦丁茶提取的熊果酸对鼻咽癌细胞有较强的干预作用,药物干预的最适宜作用浓度为40μmol-L-1,药物干预后形态学观察的最适宜时间为24 h。     

非诺贝特及罗格列酮对高糖培养肾小球系膜细胞p38MAPK信号通路调控影响

目的：探讨非诺贝特及罗格列酮对高糖培养大鼠肾小球系膜细胞（MC）p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信号传导通路的影响。方法：大鼠系膜细胞分别培养在正常糖浓度（5．5mmol／L）、高糖浓度（25mmol／L）、25mmol／L葡萄糖＋非诺贝特（FB）100μmol／L及25mmol／L葡萄糖＋罗格列酮（RG）20μmol／L。ELISA法检测培养细胞上清液Ⅳ型胶原（Col-Ⅳ）、纤维连接蛋白（FN）;Phospho—ELISA法检测胞浆及胞核内p38MAPK和磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）蛋白的表达：以及RT-PCR法检测p38MAPK的mRNA的表达。结果：与正常对照组比较,高糖组MC合成基质蛋白Col-Ⅳ、FN增多;胞浆及胞核内P—p38MAPK的表达增加。非诺贝特及罗格列酮干预能使高糖培养系膜细胞合成Col-Ⅳ、FN显著减少,胞核内p-p38MAPK表达显著下调,但对胞浆内p-p38MAPK的表达则无显著影响。各组总p38MAPK蛋白水平及p38MAPK的mRNA表达则没有明显改变。结论：非诺贝特及罗格列酮能够显著下调高糖培养的Mc核内p38MAPK信号传导通路的活化,进而减少胞外基质合成。