趋化因子受体4在神经胶质瘤中的表达及血管生成中的作用

目的:探讨趋化因子受体4(chemokine receptor 4,CXCR4)在神经胶质瘤中的表达及在血管生成中的作用?方法:通过免疫组化法检测正常或神经胶质瘤患者的瘤体组织标本CXCR4?血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达,其结果做方差分析及相关性分析;采用ELISA观察CXCR4的配体基质细胞衍生因子-1(stromal derived factor-1,SDF-1)对U87胶质瘤细胞系VEGF分泌的影响;同时利用多种处理方式(对照组?SDF-1处理组?CXCR4拮抗剂AMD3100处理组?CXCR4 RNA干扰处理组)作用于U87后,取其条件培养上清与人脐静脉内皮细胞系(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)共培养,比较小管样结构(tubule-like structure,TLS)生成数量的变化?结果:神经胶质瘤中CXCR4?VEGF的表达量随着肿瘤恶性度的升高而增加,且二者呈线性正相关(P < 0.01)?ELISA实验表明SDF-1可通过CXCR4促进VEGF的分泌(P < 0.01)?成管实验提示CXCR4与胶质瘤血管生成相关?结论:CXCR4与神经胶质瘤恶性度相关,且其配体SDF-1可通过CXCR4影响VEGF的表达,将CXCR4拮抗或干扰明显影响胶质瘤血管增生,提示CXCR4可能为神经胶质瘤的治疗提供相应靶点和思路?     

在人恶性胶质瘤原代培养细胞甲酰化肽受体FPR的表达和功能意义

目的 观测甲酰化肽受体(formylpeptide receptor,FPR)在人恶性胶质瘤原代培养瘤细胞的表达和功能活性.方法 组织块培养和胰酶消化法分离、培养人恶性胶质瘤细胞并进行鉴定,分别采用间接免疫荧光染色结合激光共聚焦扫描、台盼蓝排染实验结合细胞计数、酶联免疫夹心吸附分析(ELISA)等方法观测培养细胞FPR的表达和定位、FPR配体fMLF活化FPR后细胞增殖以及分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的变化.结果 部分胶质瘤原代培养细胞可见FPR表达,主要呈线性荧光信号定位于细胞膜;FPR阳性细胞对fMLF的刺激具有反应性,表现为细胞增殖速率加快,VEGF分泌量显著增加.结论 部分人恶性胶质瘤细胞存在功能性FPR表达,并可促进瘤细胞增殖和VEGF的产生,在胶质瘤发展及血管生成过程中可能起重要作用.     

激活人胶质瘤细胞CXCR4受体对血管内皮生长因子表达的影响

近年的研究发现,趋化因子基质细胞衍生因子(stromal cell-derived factor1,SDF1)受体CXCR4在胶质瘤细胞中有表达,但其具体作用和机制及其治疗学意义尚不清楚。本研究旨在通过检测3种胶质瘤细胞系的CXCR4表达及其介导的胶质瘤细胞趋化运动、胞内游离Ca^2 流动和调节血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达,从而探讨CXCR4的功能活性及其在血管生成中的作用。     

CXCR4在胶质瘤血管内皮细胞和ECV304细胞中的表达及其意义

目的检测人胶质瘤血管内皮细胞以及体外培养的血管内皮样细胞系ECV304趋化因子受体CXCR4的表达,观察其配体SDF-1对血管内皮样细胞迁移的影响,以探讨趋化因子受体CXCR4在肿瘤血管生成中的可能作用及其机制.方法通过免疫组化方法检测人胶质瘤血管内皮细胞CXCR4蛋白的表达,采用RT-PCR、免疫细胞化学方法检测血管内皮样细胞系ECV304上CXCR4 mRNA和CXCR4蛋白的表达,并采用48孔趋化板观察SDF-1诱导体外培养血管内皮样细胞的迁移作用.结果在胶质瘤血管内皮细胞和血管内皮样细胞系ECV304上均检测到趋化因子受体CXCR4的表达,体外实验显示SDF-1能诱导血管内皮样细胞发生明显的迁移.在30、50 ng/ml的实验浓度范围内,诱导血管内皮样细胞的迁移作用呈明显量效关系.结论胶质瘤血管内皮细胞和血管内皮样细胞系ECV304上存在CXCR4表达,CXCR4激活能诱导内皮细胞的迁移.     

半胱氨酰白三烯受体激动剂和拮抗剂对大鼠胶质瘤C6细胞分化的作用

目的:探讨半胱氨酰白三烯受体在大鼠胶质瘤C6细胞的分化中的作用。方法:以激动剂LTD4、CysLT1受体拮抗剂孟鲁司特以及分化诱导剂forskolin处理C6细胞,观察细胞形态及GFAP蛋白表达变化。结果:Forskolin(10μmol/L)可诱导C6细胞形态变化及GFAP蛋白表达(细胞分化),而LTD4(0.1～100 nmol/L)不能诱导这些变化;单用孟鲁斯特(1μmol/L)无明显作用,但与LTD4(100 nmol/L)合用可诱导C6细胞分化。结论:CysLT2受体可能参与调节大鼠胶质瘤C6细胞的分化。     

诺帝对人恶性胶质瘤细胞甲酰化肽受体表达及其活化后促增殖和血管生成因子产生的影响

目的观测自行研制的脂氧化酶抑制剂诺帝（Nordy）对人恶性胶质瘤细胞系U87中甲酰化肽受体（FPR）的表达和激活后功能活性的影响。方法采用间接免疫荧光标记、激光共聚焦扫描显微术观测诺帝对U87系人恶性胶质瘤细胞FPR表达的影响;FPR激动剂N-甲酰化的甲硫酰-亮氨酸-苯丙氨酰胺（fMLF）激活FPR后加入诺帝,实验分为以下3组：①对照组,②fMLF刺激组,③诺帝处理组,分别采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法、逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）和双抗夹心酶联免疫吸附法（ELISA）检测诺帝对FPR活化后引起的细胞增殖及细胞分泌血管内皮生长因子（VEGF）和白细胞介素8（IL-8）的作用。结果诺帝（100μmol／L）明显抑制U87细胞FPR受体的表达,同时对FPR激动剂fMLF（100nmol／L）诱导的U87细胞增殖和血管生成因子VEGF、IL-8 mRNA表达和蛋白的分泌具有明显的抑制作用。对照组U87细胞分泌一定量的VEGF和IL-8,分别为（4．14±0．28）ng／ml和（4．03±0．59）ng／ml;fMLF作用于U87细胞36h后,VEGF和IL-8蛋白水平均显著高于对照组（P〈0．05）,分别为（6．46±0．33）ng／ml和（7．54±0．73）ng／ml;诺帝作用于U87细胞12h后加入fMLF共同处理36h后,VEGF和IL-8蛋白水平分别为（3．59±0．33）ng／ml和（3．13±0．48）ng／ml,均显著低于对照组（P〈0．05）。结论诺帝对人恶性胶质瘤细胞的FPR表达和该受体活化后的促瘤细胞增殖及促血管生成因子VEGF、IL-8 mRNA表达和蛋白的分泌具有抑制作用,提示诺帝具有抑制肿瘤生长和抗血管生成的作用。     

CXCR4、VEGF在血管母细胞瘤血管生成中的表达及意义

目的 探讨中枢神经系统血管母细胞瘤中基质细胞衍生因子-1(SDF-1)受体CXCR4和血管内皮生长因子(VEGF)的表达水平及其与肿瘤血管生成的相互作用及关系.方法 通过免疫组化SP法检测40例中枢神经系统血管母细胞瘤CXCR4及VEGF的表达.以CD34单克隆抗体标记瘤组织血管内皮细胞并测定微血管密度(MVD).结果 CXCR4、VEGF在血管母细胞瘤中阳性表达率分别为95%(38/40)、85%(34/40),其表达强度高于正常脑组织(P<0.001).CXCR4主要定位于肿瘤基质细胞的细胞核,VEGF主要定位于肿瘤基质细胞和血管内皮细胞胞浆.CXCR4与VEGF的表达呈正相关(r=0.704,P<0.001).MVD与CXCR4、VEGF的表达状态有关.VHL病相关性和散发性、囊性和实性血管母细胞瘤中CXCR4、VEGF和MVD的差异均无统计学意义(P0.05).结论 CXCR4及VEGF在血管母细胞瘤血管生成中有协同作用.     

去甲二氢愈创木酸对VEGF及其受体KDR基因表达影响的研究

目的：探讨去甲二氢愈创木酸（NDGA）对血管生成因子（VEGF）及其相应受体KDR基因表达状况的影响及其意义。方法：采用免疫组化、原位杂交及图像分析等技术方法观测NDGA作用下人恶性胶质瘤细胞系SHG－44细胞VEGF基因、人脐静脉内皮细胞系ECV－304细胞VEGF的相应受体KDR基因表达的变化。结果:①100μmol/L的NDGA处理胶质瘤细胞1－3d ,引起VEGF蛋白及mRNA表达水平的降低;②100μmol/L的NDGA处理内皮细胞1－3d,受体KDR的蛋白表达也呈下降趋势,且KDR基因表达的降 低较胶质瘤细胞VEGF的降低更为明显。结论：NDGA对胶质瘤细胞VEGF的表达有抑制作用,NDGA也抑制了内皮细胞KDR的表达,此抑制作用可能是NDGA抗血管生成的重要分子基础。     

地塞米松对cAMP诱导胶质瘤细胞分化的影响

目的:探讨地塞米松对环腺苷酸(cAMP)诱导C6胶质瘤细胞分化的影响。方法:应用地塞米松和RU486单独或共同与cAMP作用于C6胶质瘤细胞,通过Western blotting检测胶质细胞分化标志蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达变化,光镜观察细胞形态学变化;通过Western blotting和细胞免疫荧光观察CREB磷酸化水平。结果:地塞米松与cAMP共作用于C6胶质瘤细胞48h,抑制GFAP表达和细胞形态改变;糖皮质受体抑制剂RU486逆转地塞米松的作用;地塞米松抑制cAMP诱导的CREB磷酸化。结论:地塞米松通过抑制CREB磷酸化逆转cAMP诱导的胶质细胞分化。     

下调CXCR4表达对胶质瘤干细胞侵袭能力和VEGF分泌量的影响

目的 观察下调胶质瘤干细胞CXCR4表达后对其侵袭能力和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)分泌量的影响.方法 采用间接免疫荧光标记观测U87细胞及其颅内移植瘤标本中胶质瘤干细胞标记物CD133和CXCR4共表达情况;分别从稳定转染CXCR4小干扰RNA质粒的U87细胞和稳定转染阴性对照质粒的U87细胞中培养出胶质瘤干细胞球,并对其进行鉴定,观察两者CXCR4的表达情况;通过Transwell小室比较两者的侵袭能力;采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测两者细胞培养上清内VEGF的含量.结果 U87细胞及其移植瘤中均可检测到CXCR4与CD133共表达,下调胶质瘤干细胞CXCR4表达后,胶质瘤干细胞的体外侵袭能力明显下降[干扰组:(17.0±5.8),对照组:(71.5±8.7),P＜0.05],VEGF分泌明显减少[干扰组:24 h(690±24)pg/ml,48 h(1 504±53)pg/ml;对照组:24 h(850±25)pg/ml,48 h(2 001±150)pg/ml,P＜0.05].结论 胶质瘤干细胞表达CXCR4,下调其表达可抑制胶质瘤干细胞的侵袭和促血管生成能力,提示CXCR4可能成为针对胶质瘤干细胞进行治疗的靶点.     

趋化因子受体CXCR6在乳腺癌细胞系中的表达及其意义

目的 探讨趋化因子受体（CXCR6）在不同侵袭性乳腺癌细胞系和正常乳腺上皮细胞株的表达及干扰表达后与癌细胞恶性表型的关系。 方法 采用Real time-PCR和Western blot分别检测不同侵袭性乳腺癌细胞系（SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231）和正常乳腺上皮细胞（MCF-10A）中CXCR6 mRNA和蛋白质的表达;采用慢病毒RNA干扰技术沉默MDA-MB-231乳腺癌细胞系中CXCR6的表达,并利用噻唑蓝（MTT）实验、Transwell小室、Real time-PCR〔检测血管内皮生长因子（VEGF）表达〕研究CXCR6在MDA-MB-231乳腺癌细胞中的作用。 结果 正常乳腺上皮细胞MCF-10A中CXCR6表达最低,不同侵袭性的乳腺癌细胞系中CXCR6的表达不同,高侵袭性乳腺癌细胞MDA-MB-231明显较低侵袭性乳腺癌细胞SK-BR-3和MCF-7表达高(PVEGF表达水平降低(P均<0.05)。 结论 CXCR6在乳腺癌细胞株中的表达水平与细胞的侵袭性有关,干预癌细胞中的CXCR6表达将可能降低癌细胞的体外恶性生物学行为。     

星形细胞肿瘤SDF-1和CXCR4的表达及其与血管生成的关系

目的 观测趋化因子间质细胞衍生因子-1(SDF-1)和CXCR4肿瘤中的分布特点及其与血管生成的关系.方法 间接免疫荧光双标记胶质瘤组织中的SDF-1、CXCR4、CD34蛋白,应用激光共聚焦扫描显微术观测30例不同病理分级的星形细胞肿瘤.结果 SDF-1和CXCR4表达随着肿瘤级别的增高而增强.主要分布于血管内皮细胞、肿瘤间质,在血管周围的表达量最强.结论 SDF-1、CXCR4的表达强度与肿瘤分级相关.肿瘤血管周围荧光最强,表明其在肿瘤血管生成中起重要作用.     

CXCR4 shRNA对胶质瘤细胞U251增殖和侵袭能力的影响

目的 探讨CXCR4 shRNA对胶质瘤细胞U251体外增殖和侵袭能力的影响,为CXCR4 shRNA治疗胶质瘤提供实验依据. 方法 用脂质体LipofectimineTM2000将CXCR4-shRNA转染U251细胞,MTT实验检测转染细胞的增殖,Transwell侵袭实验检测转染细胞的迁移和侵袭能力. 结果 与转染非特异的pGPU6/GFP/NC组和未转染组比较,转染CXCR4-shRNA载体pGPU6/GFP/Rac 1-421组的U251细胞CXCR4 mRNA显著降低(P＜0.05),并且细胞体外增殖能力减弱(P＜0.05),侵袭到滤膜底面的细胞数为36.67±9.76,分别低于对应的pGPU6/GFP/NC组和未转染组(P＜0.05). 结论 CXCR4 shRNA载体pGPU6/GFP/Rac1-421可下调U251细胞CXCR4的表达,抑制U251细胞的增殖和迁移侵袭能力,提示CXCR4在胶质瘤发展过程中具有重要作用.     

Klf4基因在人神经胶质瘤细胞U251中的稳定表达

目的:建立稳定表达Klf4基因的神经胶质瘤细胞U251 ,为探讨该基因在神经胶质瘤细胞中的功能奠定基础.方法:以低表达Klf4基因的人胶质瘤细胞系U251为材料,以Klf4基因转染U251细胞系,G418筛选,获取G418抗性单克隆进行培养,扩增后分别用免疫荧光技术、免役印迹技术(Western blot)验证获得的表达细胞株.结果:经转染和G418筛选后,荧光显微镜下见有明显表达Klf4基因的细胞,Western blot检测到转染基因Klf4后细胞KLF4蛋白的表达增高,而作为对照的转空载体的细胞Klf4的表达较低.结论:该方法成功建立了稳定转染基因Klf4的人胶质瘤U251细胞系,为进一步探讨该基因在肿瘤细胞的功能奠定了一定基础.     

CXCL12-CXCR4轴促进胶质母细胞瘤前神经间质转化

［摘要］目的: 探讨CXC趋化因子配体12-CXC趋化因子受体4(CXC chemokine ligand 12 CXC chemokine receptor 4,CXCL12-CXCR4)轴对脑胶质母细胞瘤前神经间质转化的作用。方法: 分析TCGA GBM基因数据库中CXCR4 mRNA在不同胶质瘤分子分型肿瘤组织中的水平差异及其对肿瘤患者生存率的影响;人胶质瘤LN428、U87MG细胞经不同浓度CXCL12 (0、20、40、60、80、100 ng/mL)及20 μmol/L普乐沙福(选择性CXCR4拮抗剂)预处理48 h,免疫印迹实验检测细胞内OLIG2、E-钙黏蛋白、YKL-40、N钙-黏蛋白和波形蛋白表达水平;Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,CCK8法和克隆形成实验检测肿瘤细胞增殖能力。结果： TCGA GBM数据库分析结果显示,与健康者相比,胶质瘤患者CXCR4 mRNA表达显著增高,且与患者生存率呈负相关;间质型胶质母细胞瘤组织标本中CXCR4 mRNA水平显著高于前神经型胶质母细胞瘤(P均＜0.05)。与对照组相比,CXCL12组细胞间质型相关蛋白YKL-40、N-钙黏蛋白、波形蛋白表达水平显著升高,而前神经型相关蛋白OLIG2、E-钙黏蛋白表达水平显著降低,人胶质瘤LN428、U87MG细胞迁移和侵袭能力、增殖能力显著增强(P均＜0.05);给予普乐沙福处理后,与CXCL12组相比,人胶质瘤LN428、U87MG细胞迁移和侵袭能力、增殖能力显著降低,且间质型相关指标蛋白表达显著降低,前神经型相关指标蛋白表达显著升高(P均＜0.05)。结论： CXCL12-CXCR4轴具有促进胶质母细胞瘤前神经间质转化,及迁移和侵袭、增殖的作用。     

膀胱癌细胞在不同生长环境中癌干细胞相关标志物CD44、CXCR4表达情况的初步研究

目的 观察癌干细胞相关标志物CD44、CXCR4在不同环境下膀胱癌细胞的变化情况,为人体膀胱癌干细胞的进一步研究提供前期数据与背景资料.方法 采用免疫组织化学与流式细胞术等技术,对体外培养、皮下移植瘤以及裸鼠淋巴结转移模型等不同的生长微环境的膀胱癌5637细胞系癌干细胞相关标志物CD44、CXCR4的表达进行检测.结果 在体外培养环境中,膀胱癌5637的细胞膜蛋白CD44呈阳性表达,而CXCR4呈弱阳性表达;膀胱癌裸鼠移植瘤中CD44、CXCR4均呈阳性表达.与体外培养体系比较,流式细胞术检测发现膀胱癌细胞中5637的CD44阳性表达水平无显著变化,而CXCR4阳性表达水平显著高于体外培养体系（P＆lt;0.01）;在裸鼠淋巴结转移模型中,转移淋巴结均有CD44、CXCR4阳性表达.结论 膀胱癌细胞中部分癌干细胞相关标志物的变化受体内外不同环境变化的调控,也提示膀胱癌5637细胞系存在有癌干细胞.     

脑胶质瘤细胞中TRAIL受体的表达

目的:研究TRAIL受体（TRAIL-R）在脑胶质瘤细胞中的表达。方法:应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法对43例脑胶质瘤组织标本、6例正常脑组织及U251胶质瘤细胞株的TRAIL-RI-R4的mRNA表达进行检测。结果:43例脑胶质瘤中有32例同时表达TRAIL-R1-B3（74.4％）,未检测到TRAIL-R4的表达;U251细胞株中仅检测到TRAIL-R2、TRAIL-R3的表达。结论:脑胶质瘤细胞中TRAIL-R1～R3普遍表达,“诱骗”受体模式可能受其它因素的影响与调控,TRAIL-R4在脑胶质瘤的细胞凋亡调控中可能不起重要作用。     

脂质体介导B7基因在C6胶质瘤细胞中表达的实验研究

目的 通过脂质体介导基因转移方法,将含B7基因的重组逆转录病毒表达质粒导入C6细胞中。使之能有效的表达B7分子,探索胶质瘤免疫基因治疗的新方法。方法 用脂质体将pLXSN—B7重组表达质粒导入Wistar大鼠胶质瘤细胞系C6中,经G418筛选出阳性克隆。通过PCR、狭缝杂交及B7单克隆抗体免疫荧光方法检测B7基因在C6细胞中的整合、转录及表达情况。结果 PCR可从B7基因转导的C6细胞(C6pLXSN-B7)基因组中扩增出0．8 kb的B7基因片断;以B7为探针狭缝杂交显示C6pLXSN—B7细胞中有B7基因的转录;以抗-B7单克隆抗体进行的免疫荧光检测显示C6pLXSN—B7细胞表面有B7分子的表达,而对照组肿瘤细胞(C6pLXSN、C6)则无B7分子的表达。结论 脂质体介导B7基因转移方法可将B7基因完整整合到C6细胞基因组中并使之能稳定、有效的表达。