Caveolin-1对宫颈癌细胞增殖和迁移能力的影响及其机制

目的探讨Caveolin-1对宫颈癌细胞增殖和迁移能力的影响及其机制。方法体外培养宫颈癌细胞株Hela,将细胞株分为实验组、阴性对照组和正常对照组,实验组为运用质粒转染技术建立过表达的稳定细胞株Hela/Caveolin-1,空载体细胞株Hela/pc DNA3.1作为阴性对照组,正常对照组为未转染的常规培养细胞。采用RT-PCR方法检测3组细胞中Caveolin-1的表达水平,MTT方法检测宫颈癌细胞增殖能力,Transwell细胞侵袭实验测定转染Caveolin-1后宫颈癌细胞的侵袭和迁移能力。结果 RT-PCR方法结果说明,Hela/Caveolin-1实验组中Caveolin-1的表达(5.82±0.19)明显高于阴性对照组(1.19±0.01)和正常对照组(1.32±0.06),且实验组Hela细胞的增殖和迁移能力显著减弱。结论 Caveolin-1与宫颈癌细胞的增殖和迁移能力有关。     

GRIM-19及其靶基因产物STAT3与子宫颈癌的相关性

目的:通过研究干扰素/维甲酸联合应用诱导细胞凋亡相关基因19(GR IM-19)及其靶基因产物转录信号子与激活子3(STAT3)在子宫颈癌组织中的表达情况,探讨GR IM-19及其靶基因产物在子宫颈癌发病中的作用。方法:采用W estern B lotting和RT-PCR方法检测40例子宫颈癌组织和30例正常子宫颈组织中GR IM-19与STAT3及下游基因的表达情况。结果:在子宫颈癌组织中STAT3 mRNA与蛋白均高表达,STAT3下游基因Cyc linB1和Bc l-2L1 mRNA高表达,而GR IM-19mRNA及蛋白表达在癌组织中均明显低于正常组织(P<0.05)。结论:GR IM-19与STAT3在子宫颈癌组织中表达呈负相关,GR IM-19在子宫颈癌组织中的低表达可能与子宫颈癌的发生与发展密切相关。     

转染YAP蛋白对宫颈癌细胞株Hela、SiHa增殖、迁移能力的影响研究

目的探究转染YAP蛋白对宫颈癌细胞株Hela、SiHa增殖、迁移能力的影响。方法对宫颈癌Hela、SiHa细胞株进行培养,建立稳定转染的YAP-shRNA实验组及空载质粒组。采用Real Time-PCR法、Werstern Blot法、MTT实验、Transwell小室实验、流式细胞仪分别检测YAP基因表达、YAP蛋白表达、细胞增殖能力、细胞迁移能力以及细胞周期及凋亡情况。结果 Hela细胞及SiHa细胞中YAP转染组YAP蛋白及YAP mRNA表达水平均明显降低,与空载质粒组比较差异有统计学意义(P0. 05);细胞培养24 h、48 h、72 h后,YAP转染组较空白对照组及空载质粒组细胞吸光度(A)值明显降低,而空转组及未处理组生长曲线接近一致,且随着培养时间延长,其抑制作用越明显(P0. 05); YAP转染组穿孔细胞数较空载质粒组及对照组明显减少(P0. 05); YAP转染组与空载质粒组及对照组比较,G1期细胞比例增加,G2期细胞比例减少,细胞被阻滞于G1期,YAP转染组Hela、Siha细胞凋亡率显著高于空载质粒组及对照组(P0. 05)。结论 YAP蛋白转染可以有效降低宫颈癌细胞株Hela、SiHa中YAP蛋白及YAP mRNA表达水平,抑制宫颈癌细胞株Hela、SiHa增殖、迁移能力,提高Hela、Siha细胞凋亡率,对宫颈癌的治疗有重要的参考价值。     

实时荧光定量PCR检测人宫颈癌细胞赖氨酰氧化酶样-4基因的表达

目的:利用实时荧光定量PCR检测赖氨酰氧化酶样-4(Lysyloxidase-like 4,LOXL4)基因在Hela、ME180、HCC94人宫颈癌细胞中的表达情况.方法:提取3株体外培养宫颈癌细胞株的总RNA,逆转录为cDNA,实时荧光定量PCR扩增,结合内参基因GAPDH及标准曲线比较LOXL4 mRNA在Hela、ME180和HCC94 3株体外培养的人宫颈癌细胞中的表达.结果:LOXL4基因在3株人宫颈癌细胞中均有表达,但表达水平存在统计学差异,以Hela的表达为参照(Ratio=LOXL4/GAPDH=1.00),ME180的表达水平为6.80E-3,HCC94细胞株表达丰度最低为5.62E-4.结论:建立了LOXL4基因在宫颈癌细胞表达的检测平台,为宫颈癌早期诊断及预测预后提供可借鉴的观察指标.     

米非司酮对人宫颈癌Hela细胞及其NF-κBp65蛋白表达的影响

目的:探讨米非司酮(MIF)对人子宫颈癌Hela细胞的凋亡诱导作用。方法:体外培养人子宫颈癌Hela细胞,采用流式细胞术分析不同浓度MIF对Hela细胞的凋亡率及细胞周期分布的影响;采用Westernblot法检测MIF对Hela细胞中NF-κBp65蛋白表达的影响。结果:3个浓度的MIF均能使Hela细胞凋亡率明显增加,使S期、G2/M期细胞比例减少,G0/G1期细胞比例显著增加,且作用呈剂量依赖性;随着MIF浓度的增加,Hela细胞中NF-κBp65蛋白表达水平逐渐下降。结论:MIF可能通过NF-κB信号通路降调NF-κBp65蛋白表达,从而调节细胞周期、诱导Hela细胞凋亡。     

miR-494通过抑制SIRT1表达调节人宫颈癌Hela细胞系增殖和迁移

目的观察宫颈癌组织中miR-494的表达情况及其对宫颈癌细胞系Hela增殖和迁移的影响,并对其相关机制进行初步的分析。方法 RT-PCR方法检测miR-494在宫颈癌组织和宫颈癌细胞系中的表达情况。克隆形成实验检测miR-494对宫颈癌细胞系Hela增殖能力的影响;划痕实验检测miR-494对宫颈癌细胞系Hela迁移能力的影响。Target Scans软件预测miR-494可能的靶基因,并采用荧光素酶报告基因实验验证预测的靶基因。Western blot方法检测miR-494对预测靶基因表达的影响。结果 miR-494在宫颈癌组织和宫颈癌细胞系中的表达较正常组织相比显著降低(P0.01)。转染miR-494可显著抑制Hela细胞的增殖和迁移能力(P0.01),而转染anti-miR-494可增加Hela细胞的增殖和迁移能力(P0.01)。Targetsscan软件预测miR-494可能的靶基因为去乙酰化酶1(sirtuin 1,SIRT1),且得到荧光素报告实验结果证实。Western blot结果显示转染miR-494可显著抑制Hela细胞中SIRT1的表达(P0.01),而转染anti-miR-494可增加Hela细胞中SIRT1的表达(P0.01)。结论 miR-494可通过调节SIRT1的表达而发挥宫颈癌抑制作用。     

GRIM-19对子宫颈癌细胞株HeLa细胞Survivin基因表达的影响

目的:探讨稳定转染GRIM-19对子宫颈癌细胞株HeLa细胞凋亡抑制基因Survivin的表达以及细胞增殖的影响。方法:采用脂质体转染法将GRIM-19重组质粒转染子宫颈癌细胞株HeLa细胞,建立稳定表达GRIM-19的HeLa细胞株,采用RT-PCR检测HeLa细胞转染GRIM-19后mRNA水平表达情况,采用WesternBlot检测稳定转染后GRIM-19与Survivin的表达情况,应用细胞计数法观察各组细胞增殖水平。结果:建立稳定的GRIM-19基因表达的HeLa细胞株,命名为HeLa/G19细胞,对照组细胞命名为HeLa/Con细胞。RT-PCR检测显示GRIM-19mRNA表达明显增加,WesternBlot检测显示GRIM-19的蛋白表达显著升高、Survivin蛋白的表达水平显著降低。细胞计数法实验显示HeLa/GRIM-19细胞增殖较HeLa/Con细胞明显减慢(P<0.05)。结论:GRIM-19可以抑制子宫颈癌细胞Survivin的表达,阻滞细胞的生长,可能是子宫颈癌治疗的新靶点。     

RNA干扰技术沉默Livin基因联合顺铂对宫颈癌Hela细胞凋亡的影响

目的:采用RNA干扰技术阻断Livin基因的表达,并加入不同浓度的顺铂,研究其抑制Hela细胞Livin基因的效果及增强顺铂诱导宫颈癌细胞凋亡的效应。方法:采用脂质体转染法将pGenesil-1-BIRC71、pGenesil-1-BIRC72、pGenesil-1-HK转染宫颈癌Hela细胞,采用荧光定量RT-PCR、Western-blot检测转染前后宫颈癌Hela细胞Livin基因mRNA和蛋白表达的变化,并加入不同浓度的顺铂(3μg/ml、6μg/ml、9.9μg/ml),采用流式细胞术检测不同时间(24 h、48 h)的细胞凋亡率。结果:转染pGenesil-1-BIRC71、pGenesil-1-BIRC72后Hela细胞中Livin mRNA拷贝数明显减少,蛋白质表达水平显著降低;流式细胞术检测24h、48h凋亡率,干扰组细胞显著高于对照组,并随时间延长凋亡率增加;加入顺铂(3μg/ml、6μg/ml、9.9μg/ml)后流式细胞术检测24 h、48 h凋亡率升高,差异有统计学意义(P<0.05),呈时间及剂量依赖性。结论:以Livin基因为靶向的RNA干扰技术可有效地抑制宫颈癌Hela细胞的Livin基因表达,并可增强顺铂诱导凋亡的效应,且具有时间和剂量依赖性。     

肠上皮细胞中性氨基酸载体B0AT1的真核表达及稳定转染体系的建立

目的: 构建可表达人中性氨基酸载体B0AT1基因的真核表达载体,建立重组质粒转染的Hela细胞系,筛选出稳定表达人B0AT1的细胞株. 方法: 提取人正常小肠上皮细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增出B0AT1基因片段,EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后,将其插入至真核表达载体pcDNA3.1中,构建重组表达质粒pcDNA3.1-B0AT1,转化E.coli DH5α菌株感受态细胞,将阳性克隆脂质体法转染Hela细胞,经G418筛选获得稳定表达株,用RT-PCR法检测B0AT1基因的mRNA表达. 结果: 从小肠上皮细胞中成功克隆到人B0AT1基因.酶切和序列测定表明已成功构建真核表达载体pcDNA3.1-B0AT1,将此重组质粒转染的Hela细胞,可稳定表达人B0AT1基因,并筛选出稳定表达B0AT1的Hela细胞系.氨基酸摄取实验证实,转染pcDNA3.1-B0AT1的Hela细胞具有B0AT1基因的生物学活性. 结论: 重组人中性氨基酸载体B0AT1克隆成功,并在Hela细胞中获得稳定表达.     

STAT3信号转导通路调控人宫颈癌Hela细胞增殖、凋亡的机制

目的:探讨信号传导和转录激活因子3(Stat3)通路与人宫颈癌Hela细胞增殖、凋亡的关系,明确以Stat3为靶向的信号传导通路调控Hela细胞增殖、凋亡的分子机制。方法:人宫颈癌Hela细胞用酪氨酸激酶(JAK)抑制剂AG490处理,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖;流式细胞仪(FCM)测细胞凋亡及细胞周期;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测JAK2、Stat3、磷酸化Stat3(p-Stat3)、CyclinD1、Survivin的表达。结果:人宫颈癌Hela细胞中Stat3、p-Stat3、JAK2呈阳性表达。AG490呈时间和剂量依赖的方式抑制Hela细胞的增殖,促进其凋亡(P<0.05)。Western blot检测显示p-Stat3、CyclinD1、Survivin的表达水平随作用剂量的增大而逐渐下降(P<0.05),Stat3的表达未见明显变化(P≥0.05)。结论:Stat3信号转导通路与宫颈癌Hela细胞的增殖、凋亡密切相关,可能通过其下游靶基因蛋白CyclinD1、Survivin发挥作用。阻断Stat3信号通路可能为宫颈癌的防治提供一种新的策略。     

RIM-19的表达对人子宫颈癌细胞移植瘤血管生成的影响

目的:通过裸鼠体内实验探讨GRIM-19对子宫颈癌细胞血管生成的影响。方法:采用western blot检测GRIM-19和VEGF的mRNA和蛋白水平表达情况。将HeLa/Control、HeLa/GRIM-19接种到裸鼠皮下检测荷瘤情况,利用免疫组化法计数微血管密度。结果:HeLa/GRIM-19细胞接种肿瘤生长速度明显减慢(P<0.01)。移植瘤蛋白检测发现GRIM-19表达升高,而VEGF的表达降低。HeLa/Control移植瘤的微血管密度是72±9.3/mm2,而HeLa/GRIM-19的微血管密度为32±4.7/mm2,两者差异有统计学意义(P<0.05)。结论:GRIM-19表达可以抑制子宫颈癌细胞的微血管生成,可能是子宫颈癌治疗的新靶点。     

正常子宫颈组织及子宫颈癌组织中GRIM-19的表达及其与HPV亚型的相关性

目的:探讨GRIM-19在正常子宫颈组织及子宫颈癌组织中的表达及与HPV亚型的相关性。方法:分别采用HybriMax导流杂交技术检测54例子宫颈癌组织中HPV的分型及病毒载量,Western Blot检测子宫颈癌组织中GRIM-19及STAT3蛋白表达的变化。结果:子宫颈癌组织均可检测到高危型HPV,子宫颈癌组织中GRIM-19表达较之正常宫颈组织明显降低,而STAT3表达升高。结论:子宫颈癌组织中GRIM-19表达降低,与HPV分型无相关性。     

周期型马来丝虫基因稳定转染细胞株的建立

摘要:目的　将含周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂（Bm-CPI）基因的重组质粒pcDNA3.1（+）-Bm-CPI转染人宫颈癌细胞（Hela细胞）获得重组质粒稳定转染细胞株,为重组蛋白的获得提供基础。方法　将成功构建的重组质粒pcDNA3.1（+）-Bm-CPI转染Hela细胞,以G418筛选转染细胞,通过RT-PCR和SDS-PAGE鉴定G418筛选后的单克隆抗性细胞株。结果　重组真核表达质粒pcDNA3.1（+）-Bm-CPI转染Hela细胞后,d 14可见G418抗性细胞株开始形成。G418抗性Hela细胞株筛选、扩大培养后RT-PCR扩增出621bp左右的目的条带;SDS-PAGE检测获得了明显的目的条带。结论　实验证实pcDNA3.1（+）-Bm-CPI重组质粒被成功转入Hela细胞,并获得稳定表达;为进一步研究Bm-CPI表达、蛋白纯化和测定其生物学活性奠定了基础。     

抑制 HPV18型 E7蛋白的表达对 Hela细胞生物学特性及 miR-204表达的影响

目的：通过小干扰RNA（ siRNA）抑制宫颈癌Hela细胞中人乳头瘤病毒（ HPV）18型E7的表达,研究E7蛋白对Hela细胞的生物学特性和miR-204表达的影响和关系,探索HPV致癌的分子机制。方法设计合成靶向HPV18型E7基因的siRNA,转染Hela细胞,抑制HPV18-E7的表达;采用RT-PCR和Western blot分别检测Hela细胞中HPV18-E7的mRNA和蛋白水平,用流式细胞术检测Hela细胞的细胞周期和凋亡,通过荧光实时定量PCR检测miR-204的表达水平。结果 pRNAT-HPVE7与两个对照组比较,明显抑制了Hela细胞HPV18-E7的mRNA（ t值分别为2．69、2．46,均P＜0．05）和蛋白（ t值分别为3．93、4．20,均P＜0．05）的表达,细胞周期趋于正常,凋亡率增高（t值分别为－6．87、－6．92,均P＜0．05）,miR-204表达水平也明显升高（t值分别为0．26、0．22,均P＜0．05）。结论抑制HPV18-E7基因的表达能改变Hela细胞的生物学特性和上调miR-204表达。     

ODDD调节HSV-TK/GCV对乏氧环境宫颈癌Hela细胞特异杀伤作用的研究

目的:构建一种由氧依赖降解结构域(oxygen dependent degradation domain,ODDD)调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-TK)基因表达的真核表达载体,观察ODDD能否使HSV-TK/GCV(gancyclo-vir)系统对乏氧环境中的宫颈癌Hela细胞有特异杀伤作用。方法:RT-PCR从Hela细胞中钓取ODDD片段,将PCR产物克隆入荧光报告载体pEGFP-C1,获得质粒pEGFP-ODDD;PCR扩增HSV-TK基因,将其克隆到pEGFP-ODDD和pEGFP-C1的下游,获得重组质粒pEGFP-ODDD-TK及pEGFP-TK。荧光报告载体pEGFP-ODDD转染Hela细胞,24h后应用流式细胞术检测在乏氧(O2浓度为1%)和常氧(O2浓度为21%)环境下细胞中EGFP表达强度。将具有相同转染效率的pEGFP-ODDD-TK和pEGFP-TK的Hela细胞分别予以GCV处理,5天后用MTT法检测GCV对培养细胞的杀伤效果。结果:ODDD序列和HSV-TK序列与预期一致;含有ODDD片段荧光报告载体的Hela细胞在正常氧浓度下EGFP的表达量为11.96%,低于缺氧条件下39.92%;在乏氧环境下,转染pEGFP-ODDD-TK的Hela细胞对GCV的敏感性高于正常氧含量组(P<0.0),而转染pEGFP-TK的Hela细胞在常氧和乏氧环境下对GCV的敏感性差异无统计学意义(P>0.05)。结论:成功地构建了含有ODDD序列调控的HSV-TK真核表达载体,ODDD能特异发挥HSV-TK/GCV系统对乏氧环境Hela细胞的杀伤作用。     

多西他赛联合野生型p53对Hela细胞的抑制作用

目的 探讨多西他赛单用及与野生型p53基因联合应用对宫颈癌Hela细胞的抑制作用.方法 Hela细胞分两组培养,p53转染实验组(p53-Hela组)和空白对照组(Hela组),野生型p53基因表达用逆转录-多聚酶链反应鉴定.多西他赛作用于p53-Hela细胞及Hela细胞,24小时与48小时后形态学观察并使用活细胞计数试剂盒检测吸光度值OD450,计算细胞抑制率.结果 用逆转录-多聚酶链反应法检测到p53-Hela细胞的p53 mRNA表达,与对照组Hela细胞的p53 mRNA表达相比,差异有统计学意义(t=-17.504,P<0.01).多西他赛对p53-Hela及Hela细胞作用时,不同时间都有抑制作用(Fp53-Hela=53.500,P<0.01;FHela=430.225,P<0.01),该抑制作用呈剂量依赖性和时间依赖性.结论 多西他赛单独应用时可对宫颈癌Hela细胞产生抑制作用,与野生型p53基因联用时,其药物抑制作用增强.