HSA/IL1ra融合蛋白的纯化及生物学活性研究

目的：纯化HSA/IL1ra融合蛋白并对其生物学活性进行检测。方法：采用亲和层析及离子交换层析分离纯化HSA/IL1ra融合蛋白,检测其对IL1引起的对A375 S2的杀伤保护作用。结果：获得的HSA/IL1ra融合蛋白HPLC纯度在98%以上,并且具有与天然IL1ra相似的、对IL1杀伤A375 S2细胞的保护作用。结论：获得高纯度的HSA/IL1ra融合蛋白并且具有相应的生物学活性。     

HSA/IL1ra融合蛋白的纯化及生物学活性研究

目的:纯化HSA/IL1ra融合蛋白并对其生物学活性进行检测.方法:采用亲和层析及离子交换层析分离纯化HSA/IL1ra融合蛋白,检测其对IL1引起的对A375 S2的杀伤保护作用.结果:获得的HSA/IL1ra融合蛋白HPLC纯度在98%以上,并且具有与天然IL1ra相似的、对IL1杀伤A375 S2细胞的保护作用.结论:获得高纯度的HSA/IL1ra融合蛋白并且具有相应的生物学活性.     

幽门螺杆菌HspA-UreB融合蛋白包涵体的纯化及活性鉴定

目的：建立一种有效的纯化幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位-尿素酶B亚单位(HspA-UreB)融合蛋白包涵体的方法。 方法：基因工程重组大肠杆菌BL21(pET-HU27)诱导表达的HspA-UreB融合蛋白包涵体经洗涤、变性、复性,在A¨KTA FPLC上运用HiTrap Chelating HP分离纯化,用SDS-PAGE和Bradford法检测目的蛋白的纯度和含量,用Western blotting对纯化后蛋白进行免疫学活性鉴定。 结果：纯化后HspA-UreB融合蛋白的纯度＞90%,含量达0.25 g•L^-1,并可以被HspA-UreB融合蛋白免疫小鼠血清识别。 结论：成功地建立了从包涵体中纯化高纯度HspA-UreB融合蛋白的方法。     

热休克蛋白融合蛋白对人树突状细胞分化成熟的刺激作用

目的：研究热休克蛋白融合蛋白对人树突状细胞分化成熟的刺激作用。 方法：采用GM-CSF和IL-4将人外周血单核细胞诱导成未成熟树突状细胞,然后用热休克蛋白融合蛋白刺激其分化成熟,以单核细胞条件培养液（MCM）和模拟的单核细胞条件培养液（MCM mimic）为对照。以流式细胞仪检测树突状细胞表面分子的表达情况。 结果：热休克蛋白融合蛋白可以刺激树突状细胞表面表达CD40、CD80、CD86和HLA-A2分子。结论：热休克蛋白融合蛋白可诱导人树突状细胞分化成熟。     

Tat47-57-HBcAg融合基因表达载体的构建及融合蛋白的表达鉴定

目的：探讨融合蛋白Tat47-57-HBcAg原核表达的可行性,并分析其表达形式,为研究其功能提供理论基础。方法：合成Tat47-57编码序列,PCR技术扩增HBcAg基因,通过重叠延伸PCR片段拼接法,将Tat47-57编码序列和HBcAg基因拼接,将融合基因克隆到pET28原核表达载体中。挑选测序正确的构建质粒转化大肠埃希菌Rosetta-gami^TM2（DE3）,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导融合蛋白表达,表达产物超声破壁,十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析融合蛋白的表达形式,Western印迹鉴定。结果：Tat47-57-HBcAg融合蛋白在大肠埃希菌中主要以可溶性形式过度表达,Western印迹分析表明Tat47-57-HBcAg融合蛋白可与HBcAg单克隆抗体反应。结论：融合蛋白Tat47-57-HBcAg以可溶性形式在原核表达系统中高效表达,并能特异性的被HBcAg单克隆抗体所识别。     

TAT-EGFP融合蛋白的表达及在PC12细胞的转导活性

目的:构建pET28a-TAT-EGFP重组子,观察表达的融合蛋白TAT-EGFP在细胞内的转导活性.方法:人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后再连接EGFP基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子.转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达,组氨酸亲和层析柱纯化.将融合蛋白加入培养的PC12细胞,观察荧光进入细胞的情况.结果:成功地构建了高表达pET28a-TAT-EGFP重组子,纯化了分子质量约为29 ku的融合蛋白TAT-EGFP,并在体外培养的PC12细胞中证实TAT-EGFP融合蛋白穿透生物膜的能力.结论:通过对TAT-EGFP融合蛋白的表达纯化及活性分析,证实了TAT的蛋白转导作用,为肽类及生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用提供了理论基础.     

重组腺病毒介导的HBV核心蛋白和hEDN融合蛋白基因在小鼠肝脏的表达

目的：使HBc-hEDN基因重组腺病毒载体(AdHBc-hEDN)及其对照载体AdhEDN在小鼠肝脏获得表达．方法：将体外扩增获得的高滴度AdHBc-hEDN和AdhEDN经尾静脉注射感染小鼠，并用免疫组化的方法检测AdHBc-hEDN和AdhEDN在小鼠肝脏中的表达．结果：重组腺病毒AdHBc-hEDN和AdhEDN在小鼠肝脏均获得了阳性表达．结论：HBc-hEDN基因重组腺病毒裁体在正常小鼠肝脏的成功表达为其在乙型肝炎小动物模型体内的抗病毒功能研究奠定了良好的基础．     

人sBAFF-DT388融合蛋白在大肠杆菌中的表达及其活性研究

目的 制备人B淋巴细胞刺激因子-白喉毒素融合蛋白(hsBAFF DT388),探讨其靶向B细胞活性。方法 根据优化合成的hsBAFF DT388基因序列设计引物,PCR扩增目的基因并插入克隆载体pMD19-T,采用菌落PCR、酶谱分析及DNA测序鉴定阳性克隆,重组克隆载体经双酶切后插入表达载体pColdⅡ,并鉴定重组表达载体。重组菌株经ITPG诱导,SDS-PAGE分析及Western blot鉴定,经Ni2+ NTA层析柱纯化,检测重组蛋白的生物学活性。结果 获得hsBAFF-DT388高效表达菌株,目的蛋白占菌体总蛋白的40%左右。重组蛋白与BAFF受体阳性细胞特异性结合并对人B细胞系Hmy2.CIR具有靶向细胞毒作用。结论 成功构建hsBAFF DT388表达载体,获得具有靶向B细胞活性的重组蛋白,为其在B细胞恶性肿瘤及自身免疫性疾病治疗中的应用研究奠定基础。     

BCR/ABL-OD结构域重组蛋白的表达和纯化

目的：制备BCR／ABL-0D结构域-HIS的重组蛋白．方法：用RT-PCR方法扩增BCR／ABL-0D结构域的基因片段,测序正确后将其克隆入原核表达载体pET16b中,并进行酶切鉴定,鉴定正确后转化大肠杆菌B121,构建表达His-OD融合蛋白的菌株．经IPTG诱导表达后,镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)琼脂糖进行亲和层析纯化,用SDS-PAGE对该融合蛋白的表达产率及蛋白纯度进行了分析．结果：获得了His-OD重组融合蛋白,纯度在95%以上,产物得率约75％．结论：成功制备高纯度His-OD融合蛋白,为进一步研究OD结构域的生物学功能奠定了基础。     

蓖麻毒素A链与绿色荧光蛋白基因的融合表达和活性测定

目的:表达蓖麻毒素A链(RTA)与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白 (GFP-RTA),用于蓖麻毒素A链在细胞内的转运机理研究.方法:采用PCR法从重组质粒pKK233.2-RTA中扩增出蓖麻毒素A链基因,然而将其插入真核表达质粒pEGFPC1,构成GFP-RTA融合基因;GFP-RTA经PCR扩增,与T载体连接,用内切酶从T-GFP-RTA中切下GFP-RTA片段,插入原核表达质粒pET-28a( );在BL21(DE3)中表达GFP-RTA融合蛋白,通过金属螯合和层析纯化,MTT法检测融合蛋白的细胞毒性.结果:测序发现插入的融合基因全长序列完全正确,SDS-PAGE鉴定表达产物分子量正确;经诱导表达后,菌体产生绿色荧光,MTT法表明该融合蛋白呈现与RTA相似的细胞毒性.结论:从大肠杆菌表达的蓖麻毒素A链与绿色荧光蛋白的融合蛋白,具有蓖麻毒素A链和绿色荧光蛋白的生物学活性,可用于蓖麻毒素A链在细胞内的转运途径研究.     

逆转录病毒介导的HSV-TK基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用逆转录病毒介导的HSV-TK基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用

目的：探讨逆转录病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用。方法 应用PA317细胞包装的逆转录病毒介导的HSV-TK基因系统,在体外以逆转录病毒上清感染法将TK基因导入MKN28人胃癌细胞,并初步观察更昔洛韦（GCV）对转染TK基因的MKN28胃癌细胞的杀伤作用。结果：TK基因可成功转导入MKN28细胞,且对细胞的生长状态无明显影响。但对GCV的敏感性却显增加;同时还观察到显的“旁观效应”。结论：逆转录病毒介导的HSV-TK系统对人胃癌细胞有较高的转染效率,GCV对转染阳性的胃癌细胞有显的杀伤作用。