肿节风提取物抑制鼻咽癌细胞增殖的实验研究

目的:探讨肿节风提取物药物血清对体外培养的鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2、TWO3、C666-1细胞增殖的影响, 探讨其作用机制.方法:将SD大鼠30只随机分为3组,实验组(肿节风)、阳性对照组(环磷酰胺)、阴性对照组(生理盐水),每天灌胃2次,间隔4 h,连续3 d,末次给药后1 h采血,分离血清,灭活、过滤制得含药血清.运用MTT法检测作用药物血清后细胞增殖的改变,并用流式细胞仪(FCM)测定细胞周期的改变,同时结合倒置显微镜,观察其诱导鼻咽癌细胞凋亡的作用.结果:肿节风可抑制CNE1、CNE2、TWO3、C666-1细胞的增殖, 其作用具有时间和浓度依赖性;同时可诱导细胞凋亡,改变细胞周期分布,多数细胞阻滞于G1期.结论:体外实验表明,肿节风提取物具有抗鼻咽癌细胞增殖的作用,是一种具有应用前景的诱导肿瘤细胞凋亡的天然药物.     

复方天仙胶囊药物血清体外抑制鼻咽癌细胞增殖的研究

目的探讨复方天仙胶囊药物血清(compound tianxian capsule drug-containing serum,CTC-DS)对体外培养的鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2、TWO3和C666-1细胞增殖的影响,探讨其作用机制。方法将SD大鼠随机分为3组,实验组(灌胃复方天仙胶囊)、阳性对照组(灌胃环磷酰胺)、阴性对照组(灌胃生理盐水),动物给药后采血,提取制备含药血清。运用MTT法检测作用药物血清后细胞增殖的改变,并用流式细胞仪(FCM)测定细胞周期的改变,同时结合倒置显微镜,观察其诱导鼻咽癌细胞凋亡的作用。结果复方天仙胶囊可抑制CNE1、CNE2、TWO3和C666-1细胞的增殖,其作用具有时间和浓度依赖性;同时可诱导细胞凋亡,改变细胞周期分布,多数细胞阻滞于G1期。结论复方天仙胶囊可诱导鼻咽癌细胞凋亡,改变细胞周期分布,从而抑制细胞增殖。     

血卟啉衍生物光动力对两株人鼻咽癌细胞杀伤实验的对比研究

目的 探讨血卟啉衍生物(HpD)光动力学效应(PDT)对体外培养人鼻咽癌细胞株CNE2和C666-1的生物作用.方法 向体外培养的CNE2和C666-1分别加入不同浓度的HpD(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0μg/m)孵育4 h,予波长为630nm的半导体激光进行照射,照射的功率密度为20mW/cm2,照射能量密度分别为2、5、10、20 J/cm2,继续孵育24h,用四唑盐比色法测定细胞存活率.结果 HpD-PDT能有效地杀伤体外培养的人鼻咽癌CNE2和C666-1细胞,其杀伤作用大小与HpD的浓度和激光剂量成正相关(P＜0.01).激光能量为20 J/cm2,HpD的浓度为2.5μg/ml或2.0μg/ml时,其杀伤CNE2、C666-1细胞的作用最明显;HpD-PDT对CNE2和C666-1的半数杀伤度分别为0.7μg/ml、1.2μg/ml,两者存在显著性差异(P＜0.05).相同HpD浓度、激光剂量条件下,C666-1细胞存活率显著高于CNE2(P＜0.05).结论 HpD-PDT对CNE2和C666-1细胞均有杀伤作用,但C666-1细胞对HpD-PDT的敏感性低于CNE2.     

5-氨基乙酰丙酸光动力对两株人鼻咽癌细胞杀伤效应的对比研究

目的 探讨5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,5-ALA)先动力学效应(photodynamic therapy,PDT)对体外培养人鼻咽癌细胞株CNE2和C666-1的生物学作用.方法 对体外培养的CNE2和C666-1分别加入不同浓度的5-ALA(0.01,0.05,0.1,0.25,0.5,1.0,2.0,4.0 mmol/L)孵育4 h,予波长为630 nm的半导体激光进行照射,照射的功率密度为20 mW/cm2,照射能量密度分别为2,5,10,20 J/cm2,继续孵育24 h,用四唑盐(MTT)比色法测定细胞存活率.结果 5-ALA-PDT能有效地杀伤体外培养的人鼻咽癌CNE2和C666-1细胞,其杀伤作用大小与5-ALA的浓度和激光剂量呈正相关(P＜0.01).激光能量为20 J/cm2,5-ALA的浓度为2.5 mmol/L或2.0 mmol/L时,其杀伤CNE2,C666-1细胞的作用最明显;5-ALA-PDT对CNE2和C666-1的半数杀伤度(IC50)分别为0.14,0.32 mmol/L,两者间差异有显著性(P＜0.05).相同5-ALA浓度、激光剂量条件下,C666-1细胞存活率显著高于CNE2(P＜0.05).结论 5-ALA-PDT对CNE2和C666-1细胞均有杀伤作用,但C666-1细胞对5-ALA-PDT的敏感性低于CNE2.     

三氧化二砷对鼻咽癌细胞系表达DNA甲基转移酶的抑制作用

目的 探讨三氧化二砷（As2O3）对鼻咽癌细胞系DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase,DNMT）（DNMT1、DNMT3A及DNMT3B）表达水平的影响。方法 应用8μmol/L As2O3与鼻咽癌细胞系C666-1、CNE1、CNE2和鼻咽上皮永生细胞系NP69细胞分别共同孵育48h,基于细胞计数试剂盒8测定鼻咽癌细胞的增殖情况。应用定量反转录聚合酶链反应和蛋白质印迹检测药物处理前后鼻咽癌细胞及NP69细胞中DNMT mRNA及蛋白表达水平的变化。结果 NP69细胞相对鼻咽癌细胞表达DNMT1和DNMT3A水平最低。经As2O3作用后,鼻咽癌细胞活力下降,形态改变明显;各种细胞表达DNMT的水平变化不完全一致,其中C666-1细胞对3种DNMT的表达水平均显著降低;而CNE1和CNE2细胞中DNMT1及DNMT3B 表达下调,CNE1细胞中DNMT3A的表达显著上调。结论 As2O3可抑制鼻咽癌细胞中DNMT的表达,表明其在一定程度上对鼻咽癌细胞具有去甲基化作用,存在治疗鼻咽癌的潜在价值。     

二甲双胍对人鼻咽癌C666-1细胞的增殖与凋亡作用

目的：探讨二甲双胍对人鼻咽癌C666-1细胞增殖和调亡的作用,并初步研究其作用机制.方法：体外培养人鼻咽癌C666-1细胞,以剂量5,10,20 mM的二甲双胍干预细胞24 h或48 h.采用MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Real-time PCR检测Bax、Bcl-2和Caspase-3表达.结果：二甲双胍抑制C666-1细胞增殖,随剂量增加和干预时间延长,细胞增殖的抑制作用增强（P＜0.05）.二甲双胍诱导C666-1细胞早期凋亡,有剂量效应关系,20 mM的二甲双胍干预细胞24 h,细胞早期凋亡率（12.40±1.01）％,高于对照组的（7.20±0.53）％,差异有统计学意义（P＜0.05）.二甲双胍诱导C666-1细胞Caspase-3表达上调,降低Bcl-2/Bax比值.结论：二甲双胍抑制人鼻咽癌C666-1细胞增殖,诱导其凋亡,其机制可能与调节凋亡相关基因Bax、Bcl-2和Caspase-3的表达有关.     

HRP/IAA酶前药系统抗鼻咽癌的实验研究

目的 体外、原位实验观察HRP/IAA酶前药系统对鼻咽癌C666-1细胞的杀伤效应,以探讨其对鼻咽癌的治疗作用.方法 细胞转染获得稳定表达HRP蛋白的C666-1细胞.MTT法检测不同浓度的IAA对HRP表达阳性的C666-1细胞的杀伤效应.原位基因治疗:取5×106对数生长期的C666-1细胞接种裸鼠右腋下,建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,接种细胞10d后将裸鼠随机分成3组,观察HRP/IAA酶前药系统对移植瘤生长的抑制作用.结果 体外实验中,同一浓度IAA干预后C666-1/HRP(+)组细胞的相对存活率显著低于C666-1/HRP(-)组(P＜0.05),且随着IAA浓度的升高C666-1/HRP(+)组细胞的相对存活率逐渐降低,分别为(15.58±1.12)%、(10.11土1.06)%、(5.21±1.04)%;原位基因治疗实验结果表明IAA组鼻咽癌移植瘤生长受到抑制,体积明显小于空病毒组和生理盐水组(P＜0.05),且肿瘤细胞凋亡显著增多(P＜0.05).结论 HRP/IAA酶前药系统对鼻咽癌C666-1细胞具有杀伤作用,具有抗鼻咽癌的作用.     

奈达铂对不同EBV状态鼻咽癌细胞放射增敏的实验研究

目的 观察奈达铂对人鼻咽癌细胞系CNE2（EBV-）和C666（EBV＋）的抑制作用及放射增敏作用,并探讨其作用机制.方法 不同浓度奈达铂（0～100μg/ml）作用于人鼻咽癌CNE2（EBV-）和C666（EBV＋）细胞,MTS法检测奈达铂的细胞增殖抑制作用,并计算IC50值;以IC5和IC10奈达铂浓度作为增敏剂量,MTS法和克隆形成法检测细胞放射敏感性的变化,流式细胞术检测细胞凋亡百分率及细胞周期的改变.结果 MTS实验奈达铂对CNE2和C666细胞IC50值分别为34.32μg/ml和63.69μg/ml（24h）;增敏实验分为空白对照组、NDP1组（CNE2 0.34μg/ml,C666 0.69μg/ml）和NDP2组（CNE2 0.64μg/ml,C666 1.27μg/ml）,4Gy照射后三组细胞存活率,CNE2细胞为（90.0±0.3）%、（80.2±0.5）%、（53.3±0.7）%（24h）,（76.7±0.1）%、（60.0±0.6）%、（40.0±0.2）%（48h）,（66.7±0.7）%、（40.2±0.4）%、（30.0±0.6）%（72h）;C666细胞为（92.3±0.2）%、（61.5±0.7）%、（50.3±0.3）%（24h）,（77.7±0.2）%、（44.6±0.9）%、（36.2±0.4）%（48h）,（53.8±0.2）%、（34.6±0.3）%、（23.1±0.4）%（72h）;以克隆形成结果拟合存活曲线,CNE2细胞SF2为0.46、0.26、0.14,C666细胞SF2为0.43、0.31、0.20;CNE2和C666细胞SER（SF2）为1.77和1.39（NDP1）,3.29和2.15（NDP2）;照射后三组细胞凋亡率,CNE2为（4.55±0.12）%、（9.02±0.75）%和（14.55±0.45）%,C666细胞为（4.02±0.33）%、（7.11±0.32）%和（10.36±0.58）%;三组细胞G2/M期比例,CNE2为（3.49±0.25）%、（17.55±0.55）%和（32.09±0.48）%,C666为（3.65±0.18）%、（13.75±0.51）%和（30.11±0.77）%;两种细胞系组间比较差异均具统计学意义（P＜0.05）.结论 奈达铂对不同EBV状态的人鼻咽癌CNE2和C666细胞具有放射增敏作用,增敏作用CNE2细胞（EBV-）优于C666细胞（EBV＋）,其增敏机制与增加细胞凋亡、调节G2/M期比例有关.     

人鼻咽癌干细胞微球体培养并鉴定其生物特性

目的：目前分离和鉴定鼻咽癌干细胞的方法仍不成熟。探索鼻咽癌细胞系干细胞微球体培养方法,并对CNE-2细胞微球体是否具有肿瘤干细胞生物特性（干性）进行鉴定。方法人鼻咽癌细胞CNE2、C666-1细胞在含生长因子的无血清培养基（ serum-free medium, SFM）中悬浮培养。流式细胞术、Transwell小室实验、裸鼠成瘤实验、分别检测CNE2贴壁细胞（ CNE2 monolayer, CNE2-MN）及CNE2微球体细胞（ CNE2 sphere cells, CNE2-SC） CD133＋标记细胞比例,体外侵袭能力、体内成瘤能力;CNE2-SC在含血清培养基中贴壁培养观察其分化能力;实时荧光定量PCR分析CNE2-MN及CNE2-SC相关干性基因Bmi-1、Oct4、Twist1RNA的表达。结果2种细胞系均能在特殊配制的SFM中形成可以稳定传代的微球体, SFM新鲜配制、用细胞分离剂Accutase替代胰酶传代以及保持细胞的悬浮状态均有利于微球体的形成和增殖;在含血清培养基中培养能贴壁分化成CNE2-MN而无明显差异;CNE2-SC中CD133＋细胞比例（98．79％）显著高于CNE2-MN（0．98％）,差异有统计学意义（ P＜0．01）;与CNE2-MN相比,CNE2-SC高表达干细胞相关基因Bmi-1、Oct4、Twist1及EMT标志物N-cadherin、Vimentin。 Transwell小室实验示CNE2-SC与CNE2-MN的穿膜细胞数分别为（122±6）个／视野及（36±7）个／视野（P＜0．05）;裸鼠成瘤实验示1×104个CNE2-SC 3周内即能成瘤,成瘤率33．3％,而CNE2-MN不能成瘤,1×105个CNE2-SC与CNE2-MN成瘤体积比为（1．750±0．613）cm3 vs （0．457±0．291）cm3（P＜0．05）,而1×106个以上2种细胞成瘤体积比为（2．332±0．549）cm3 vs （0．669±0．278）cm3（P＜0．01）。结论利用特制SFM悬浮培养法可得到鼻咽癌CNE2-SC,这种微球体富集了肿瘤干细胞,将为后续鼻咽癌干细胞研究打下基础。     

盐酸小檗碱含药血清与血浆抗鼻咽癌CNE-1细胞作用的比较分析

目的盐酸小檗碱体外抗肿瘤等作用活性显著,目前针对其从体外过渡到体内的研究偶见报道,文中研究通过半体内研究方法,比较盐酸小檗碱含药血清、血浆对人鼻咽癌CNE-1细胞的生长抑制及诱导凋亡作用。方法新西兰白兔灌胃给药,分离血清、血浆后,56℃灭活30 min,制成含药血清、血浆,采用反向高效液相色谱法(rerersed phase high performancel iquid chromatography,RP-HPLC)分析盐酸小檗碱含量,采用MTT法比较不同作用时间和剂量对鼻咽癌CNE-1细胞增殖的抑制作用,用Annexin v-FITC流式细胞术观察诱导细胞凋亡情况。结果盐酸小檗碱含药血清、血浆均能够抑制CNE-1细胞增殖,含药血浆的抑制作用强于含药血清,且含药血浆能显著诱导CNE-1细胞凋亡。结论凡是使用血清与血浆均可的实验,应当优先选用含药血浆。     

慢病毒介导的siRNA靶向干扰EIF4G1鼻咽癌稳定细胞株的建立

目的 检测人真核翻译起始因子4G1(EIF4G1)基因在8株鼻咽癌细胞中的差异表达,寻找最高表达的细胞株.构建EIF4G1基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,建立稳定干扰EIF4G1表达的鼻咽癌细胞株,测定干扰效率.方法 应用荧光定量PCR检测EIF4G1 mRNA在鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B、C666-1、CNE1、CNE2、HNE1、HONE1、SUNE1表达水平.构建重组靶向EIF4G1 shRNA慢病毒表达质粒pLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA.用293FT细胞包装后产生的成熟慢病毒颗粒感染5-8F细胞.经杀稻瘟菌素筛选后,建立稳定表达siRNA的5-8F鼻咽癌细胞株.最后荧光定量PCR检测干扰效率.结果 在8个鼻咽癌细胞株中,EIF4G1显示在5-8F细胞株中表达最高.PCR和测序验证pLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA重组质粒构建成功;经293FT细胞病毒包装,感染5-8F细胞后,与阴性对照组和未十扰组相比可明显抑制EIF4G1 mRNA水平EIF4G1表达.结论 成功构建TpLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA慢病毒重组质粒,建立了稳定靶向干扰EIF4G1表达的siRNA5-8F鼻咽癌细胞株.     

5-杂氮-2’-脱氧胞苷对鼻咽癌细胞增殖、凋亡和周期的影响

目的分析5-杂氮-2’-脱氧胞苷（5-aza-2dC）对鼻咽癌细胞株CNEl、CNE2、5-8F、6-10B增殖、凋亡和细胞周期分布的影响。方法用不同浓度5-aza-2dC处理鼻咽癌细胞，MTT实验观察细胞生长曲线，用流式细胞仪检测细胞周期分布情况和凋亡细胞比例。结果5-aza-2dC对4株细胞的增殖均具有抑制作用，CNEl和6-10B细胞的半数抑制剂量低于CNE2和5-8F。药物处理使4株细胞凋亡率呈剂量依赖性增加，CNEl和6-10B细胞对药物敏感性高于CNE2和5-8F。经5-aza-2dC处理后，CNEl、CNE2、6-10B细胞出现不同程度G0／G1期阻滞，而5-8F表现为G0／G1期和G2／M期双期阻滞．CNEl和6-10B细胞对药物敏感性高于CNE2和5-8F。结论5-aza-2dC对CNEl、CNE2、5-8F和6-10B细胞具有抑制增殖、促进凋亡和细胞周期阻滞作用，CNEl和6-10B对药物敏感性高于CNE2和5-8F。     

花生四烯酸通过mTORC1／2通路促进鼻咽癌细胞的增殖

目的研究花生四烯酸（AA）对鼻咽癌细胞增殖的影响及其潜在的分子机制。方法采用CCK．8法检测AA对鼻咽癌细胞系C666．1增殖的影响,以及雷帕霉素（rapamycin,Rap）、PP242与AA共同作用对C666．1细胞增殖的影响。同时采用免疫印迹法检测AA对鼻咽癌C666—1细胞哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路活性的影响,包括下游相关蛋白s6、Akt的表达水平及磷酸化水平,以及mTOR通路抑制剂Rap、PP242与AA共同作用对mTOR信号通路的影响。结果AA可强烈促进C666—1细胞的增殖,mTOR通路抑制剂Rap、PP242均可抑制AA促进C666．1细胞增殖。AA可激活C666．1细胞mTORC1／2下游相关蛋白s6、Akt。使其磷酸化水平升高。mTORC1通路抑制剂Rap可阻断AA对mTORCl的激活,从而降低s6（S235／236）的磷酸化水平,mTORC1／2通路抑制剂PP242可阻断AA对mTORCl／2的激活,从而降低s6（$235／236）和Akt（S473）的磷酸化水平。结论花生四烯酸通过激活mTORC1／2信号通路促进鼻咽癌C666．1细胞系的增殖。     

放射后鼻咽癌细胞株C666-1存活亚克隆高表达miR-181a

目的：：初步分析miR-181a与鼻咽癌细胞系C666-1放射敏感的相关性。方法：首先使用大剂量8 Gy的X射线照射C666-1,挑选三个大的存活亚克隆并命名为 C666-1-R1,C666-1-R2和 C666-1-R3,然后应用MTT等技术分析亚克隆及对照母本C666-1细胞系放射敏感性的差异,最后采用实时荧光定量PCR 法,分析三个存活亚克隆及对照C666-1的miR-181 a表达水平。结果：通过MTT比色法检测细胞增殖：6 Gy照射后,三个亚克隆C666-1-R1,C666-1-R2和C666-1-R3的细胞存活率均高于对照细胞C666-1,尤其C666-1-R2在48、72和96 h的存活率增高均有显著性差异(P<0.05),提示C666-1-R2具有放射抗拒性。另一方面,各亚克隆及对照细胞的 miR-181a 的2-△△Ct值如下：C666-1-R1=0.693,C666-1-R2=0.486,C666-1-R3=0.762,C666-1=1。提示放射后存活的三个亚克隆均高表达 miR-181a,尤其放射抗拒亚克隆C666-1-R2的 miR-181a表达更高。结论：miR-181a与鼻咽癌存活亚克隆的放射抗拒性密切相关。miR-181a可能是评估鼻咽癌放射敏感性的一个新分子,miR-181a 与鼻咽癌放射抗拒的相关性值得深入研究。     

维生素E琥珀酸酯对人鼻咽癌CNE2细胞增殖、凋亡影响的实验研究

目的:探讨维生素E琥珀酸酯(Vitamin E Succinate,VES)在体外对人鼻咽癌CNE2细胞的生长抑制作用.方法:以5,10,20,40 mg/L浓度的VES作用于人鼻咽癌CNE2细胞,使用光镜、透射电镜、MTT法、流式细胞仪观察和检测作用24,48,72 h后细胞形态、增殖、凋亡及细胞周期分布情况.结果:...     

HMGB1对人鼻咽癌细胞株C666-1体外增殖的影响

目的观察高迁移率族蛋白1（HMGB1）对人鼻咽癌细胞株C666-1增殖的影响并探讨其可能的机制。方法用siRNA干扰
鼻咽癌细胞株C666-1 HMGB1基因,CCK-8检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期,Western blot检测cyclin D1,CDK6及相
关通路蛋白表达。用带GFP的HMGB1质粒转染鼻咽癌细胞株C666-1,EDU和CCK-8检测细胞增殖。结果干扰HMGB1的表
达后,细胞增殖明显减慢（P<0.001）;细胞周期分析显示处于G1期细胞比例增多（P<0.001）,S期细胞比例明显下降（P<0.001）;
Western blot结果显示cyclin D1、CDK6的表达下调,STAT3,P-STAT3的表达也下调。过表达HMGB1后,EDU显示处于S期细
胞比例增多（P<0.05）;CCK-8显示细胞增殖明显增快（P<0.001）。结论HMGB1促进人鼻咽癌细胞株C666-1的增殖,可能通过
STAT3信号通路上调cyclin D1、CDK6促进鼻咽癌细胞株C666-1由G1期进入S期从而调控其增殖。
     

鼻咽癌细胞株CNE1、HONE1、C666-1和CNE2的亚致死性损伤修复速度测定

目的 测定CNE1、HONE1、C666-1和CNE2的亚致死性损伤修复速度参数.半修复时间(repair half-time,T1/2).方法 设0s、15S、30s、1h、2h、4h及6h共7个间隔时间,将8Gy照射剂量分为平分为两个4Gy间断照射4株细胞.采用集落形成法得到4株细胞在不同间隔时间两个4Gy照射后的存活分数.拟合细胞存活分数随间隔时间延长的变化曲线,并测算出T1/2.结果 CNE1、HONE1、C666-1和CNE2的T1/2分别为18、22、29和27s.结论 鼻咽癌细胞的亚致死性损伤修复速度较快.提示调强放疗中被延长的分次照射时间(15～45s)可能导致鼻咽癌细胞的辐射死灭效应降低.