交联温度对京尼平交联胶原／壳聚糖组织工程支架的影响

[目的]通过研究材料的孔径、交联度、溶胀率、降解率、细胞毒性及组织相容性的变化,探讨交联温度对京尼平交联胶原/壳聚糖支架的影响.[方法]采用冷冻干燥法制备胶原/壳聚糖复合多孔支架,分别于4℃、20℃、36℃条件下,在0.5%京尼平水溶液中交联24 h.以未交联的胶原/壳聚糖复合多孔支架作为对照,评价所得支架的孔径、交联度、溶胀率、降解率、细胞毒性及组织相容性特点.[结果]随交联温度升高,支架的交联度明显增大,溶胀率和降解率逐渐减小.4℃组支架交联度47.88%土6.4%,溶胀率为721%±46%,4周后降解3.95%±6.4%;20℃组支架交联度67.69%±3.6%,溶胀率为662%±72%,4周降解0.91%±5.9%;36℃组支架交联度70.32%±5.7%,溶胀率为635%±27%,4周降解0.66%±7.3%,三组上述观察指标均优于未交联组(P/0.01).[结论]京尼平交联可以显著降低胶原/壳聚糖支架的降解率和溶胀率,且对支架结构和生物相容性无明显影响.交联温度增加可以提高支架的交联度和抗降解能力,较快获得具有良好生物相容性和降解率的组织工程支架.     

壳聚糖-藻酸盐多通道支架材料细胞相容性研究

[目的]通过体外细胞毒性试验,细胞与支架材料复合培养实验和体内植入试验,评价壳聚糖-藻酸盐支架材料的细胞相容性。[方法]通过冷冻干燥法制备具有纵行、平行排列通道的壳聚糖-藻酸盐支架材料。将大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow derived stromalcell,BMSCs)与其浸提液培养,采用MTT法检测培养1、3、5d时支架材料的细胞毒性。在体外将BMSCs与壳聚糖-藻酸盐支架材料复合培养3、5、7d后行扫描电镜检测,并将其植入急性脊髓半横断损伤模型中,6周后行免疫荧光检测BMSCs在材料中的生长与分化情况。[结果]MTT法检测示壳聚糖-藻酸盐支架材料的细胞毒性为0-1级。扫描电镜观察细胞在支架材料复合培养3d后即可粘附于支架材料表面,细胞呈一定方向排列。术后6周,Neurofilament200、NSE免疫荧光检测证实,支架材料内有大量BMSCs存活,部分向神经元样细胞分化。[结论]壳聚糖-藻酸盐支架具有良好的细胞相容性,有望成为一种较理想的神经组织工程支架材料。     

脱细胞软骨基质三维支架的制备及特性研究

[目的]探索脱细胞软骨基质三维多孔支架的制备及其应用于关节软骨组织工程的可行性。[方法]新鲜牛膝关节软骨粉碎后,梯度离心法获取软骨微粒,采用改进的Courtman改良法处理细胞后,再冷冻干燥,制备脱细胞软骨基质三维多孔支架。然后,采用京尼平对三维支架进行交联,再次冷冻干燥后,对支架材料进行大体、组织学染色及扫描电镜观察,分别测定支架的孔隙率、溶胀率、降解率。最后,分离培养兔骨髓基质细胞(BMSCs),采用MTT法检测BMSCs在支架材料上的生长、增殖情况,以柱形图表示。[结果]大体观察显示支架呈疏松多孔状,京尼平交联后整体呈深蓝色。组织学观察显示支架材料无软骨细胞碎片残留,HE染色、甲苯胺兰染色观察均未见软骨细胞残留。测量示支架孔隙率为90%,溶胀率为(1314±337)%,降解率2周为(13.69±7.3)%,4周为(25.99±8.9)%。MTT法显示细胞在支架上生长良好,与对照组DMEM培养液吸光度值比较,差异无统计学意义(P0.05),提示支架无细胞毒性。扫描电镜显示支架内孔洞较明显,BMSCs通过细胞突起黏附于支架表面,黏附良好,能较好地在其上生长。[结论]经改进的Courtman改良法处理的软骨基质三维多孔支架脱细胞更彻底,保留了软骨的天然细胞外基质成分,天然交联剂京尼平交联后支架的细胞相容性好,抗降解性得到了提高,是一种适用于软骨组织工程的良好载体。     

软骨细胞外基质/壳聚糖复合多孔支架和骨髓间充质干细胞构建组织工程软骨

[目的]探讨软骨细胞外基质和壳聚糖制备复合多孔支架,同时并对小鼠骨髓间充质干细胞构建组织工程软骨的可行性进行观察.[方法]以猪关节软骨细胞外基质和壳聚糖为原料,采用冷冻干燥法制备软骨细胞外基质/壳聚糖复合多孔支架.通过扣描电镜观察材料内部结构及孔径大小,液体位移法测定材料的孔隙率,MTT方法检测支架浸提液毒性.将小鼠的骨髓间充质干细胞(BMSCs)分离培养并用TGF-β1成软骨诱导后,与材料复合培养,扫描电镜观察细胞在材料上的生长粘附情况.[结果]软骨细胞外基质/壳聚精复合支架具有疏松多孔结构,孔径大小(159±36)μm,孔隙率为90.5%±2.3%,复合支架中的软骨细胞外基质成分甲苯胺蓝染色、番红O染色均呈阳性,MTT结果显示支架无细胞毒性.诱导的骨髓间充质干细胞在支架表面生长良好.[结论]软骨细胞外基质/壳聚糖复合材料具有合适的孔径和孔隙率,生物相容性良好,是组织工程软骨的良好支架载体.     

去甲二氢愈创木酸交联猪去细胞脊髓支架及其相关特性研究

目的 :观察去甲二氢愈创木酸(nordihydroguaiaretic acid,NDGA)交联猪去细胞脊髓支架的结构及性能。方法:取成年猪胸段脊髓,采用2次冻融化学萃取法对脊髓行去细胞处理,再用2.5g/L NDGA溶液进行交联处理。在体视显微镜及扫描电镜下分别观察猪去细胞脊髓支架及NDGA交联猪去细胞脊髓支架的结构。采用Instrong生物力学测试仪检测正常猪脊髓(正常组)、猪去细胞脊髓支架(未交联支架组)及NDGA交联猪去细胞脊髓支架(交联支架组)的极限抗拉强度和弹性模量。取第4代SD大鼠星形胶质细胞分别与未交联支架和NDGA交联支架联合培养,采用CCK8法检测细胞生长率,评价支架的细胞毒性。将未交联支架和交联支架分别包埋至SD大鼠背部皮下,在1、2、4周取出检测其包埋后的降解率,并取包埋4周的组织行HE染色,评价支架的生物相容性。结果:正常组脊髓组织为圆柱状,呈乳白色,横切面可见灰质与白质分界明显;未交联支架基本保持原组织外形,呈白色半透明状,白质与灰质无明显分界;交联支架质地稍变硬,呈棕黄色。扫描电镜显示未交联支架与交联支架内的基质纤维保存完好,相互交织成网状三维结构,内部孔洞连通。未交联支架的抗拉强度及弹性模量较正常组显著性下降(P0.05);交联支架抗拉强度和弹性模量较未交联支架显著性增强,两组比较有统计学差异(P0.05),但仍低于正常组(P0.05)。星形胶质细胞在交联支架及未交联支架中均生长良好,共培养时间越久,OD值越大,两组相同时间点OD值比较无统计学差异(P0.05)。相同时间点交联组在体内降解率明显低于未交联组(P0.05)。包埋4周后未交联组支架HE染色可见炎症细胞及成纤维细胞浸润,并且有肉芽组织聚集在内部孔隙中;交联组支架炎症细胞明显减少,且可见新生血管状结构。结论:NDGA交联猪去细胞脊髓支架与未交联猪去细胞脊髓支架比较三维结构未见明显改变,但生物力学性能和体内抗降解能力显著性增强,生物相容性提高,且无明显细胞毒性,可作脊髓损伤修复的支架材料。     

壳聚糖与Ⅰ型胶原复合制作新型人工神经支架材料及其性能研究

目的 探讨以壳聚糖复合Ⅰ型胶原蛋白结合冷冻干燥技术制备新型人工神经支架材料.方法 将壳聚糖与Ⅰ型胶原蛋白分别溶于0.05 mol/L的醋酸溶液中,利用冷冻干燥技术制备新型人工神经支架材料,并以紫外线照射的方法使其交联.经扫描电镜观察内部结构的排列规律及走行,比较其与周围神经的异同,测量其孔径大小、计算孔隙率等指标.观察在0.01 mol/L磷酸盐缓冲液中30 d体外降解率.并对材料进行力学及细胞毒性实验.结果 构建的材料为均匀圆柱状,内部为孔径均匀且平行排列的微观结构,其微孔直径为60-130μm,孔隙率为83.30%,体外降解率为16.95%,具有较好的力学性能与周阡司组织无毒性反应.结论 使用壳聚糖复合Ⅰ型胶原蛋白结合冷冻干燥技术,制备出具有良好三维空间构型的新型人工神经支架材料,其牛物相容性良好,具有应用潜力.     

鱼鳔膜的制备及其理化特性的研究

目的采用交联技术制备鱼鳔膜材料,检测其理化性能及细胞毒性。方法取鱼鳔经脱细胞处理后随机分为两组,交联组采用碳二亚胺[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide,EDC]/N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)法交联处理后,行表面制孔及冻干处理;未交联组仅行表面制孔及冻干处理。观测两组材料理化性能,包括扫描电镜观察微观结构,电子万能材料试验机测试力学性能(拉伸强度及断裂伸长率),接触角测量仪检测材料亲水性,乙醇浸润法测定材料孔隙率,体外降解性能及热稳定性检测,以及红外光谱分析支架成分。取小鼠成纤维细胞L929与两组材料浸提液培养,细胞检测试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)测定细胞毒性。结果扫描电镜观测两组支架均具有多孔结构,且表面粗糙。与未交联组相比,交联组材料拉伸强度明显增高、断裂伸长率降低、孔隙率增大,差异有统计学意义(P0.05);接触角差异无统计学意义(P0.05)。两组材料降解趋势一致,最初7 d内降解较快,之后趋于平缓;各时间点交联组降解率低于未交联组,差异均有统计学意义(P0.05)。差示扫描量热法检测显示,交联组材料变性温度为(75.2±1.3)℃,高于未交联组的(68.5±0.4)℃,差异有统计学意义(t=4.586,P=0.002)。红外光谱分析,与未交联组相比,交联组生成了酰胺键中新的C=O键和N-H键,并且未引入其他新的基团。CCK-8法检测示,交联组及未交联组A值与阳性对照组比较,差异均无统计学意义(P0.05)。结论经EDC/NHS法交联处理获得的鱼鳔膜材料具有优良的理化性能,无细胞毒性,有望作为硬膜修复材料。     

不同浓度配比的壳聚糖-胶原复合材料对细胞亲和性的影响

目的评价不同浓度配比的壳聚糖-胶原支架材料对细胞亲和性的影响,并观察在细胞-支架复合物培养过程中支架材料的物理性质变化情况。方法采用第3代正常人皮肤成纤维细胞作为种子细胞,进行体外培养和扩增至足够数量后,分别种植于100%胶原(实验组1)、70%胶原(壳聚糖∶胶原=3∶7,实验组2)、50%胶原(壳聚糖∶胶原=5∶5,实验组3)、30%胶原(壳聚糖∶胶原=7∶3,实验组4)四种不同浓度配比的壳聚糖-胶原复合支架材料上,培养7d,通过光镜、电镜等观察和比较细胞在支架上的黏附情况、增殖活力和生长形态,以及材料物理强度的变化情况。结果不同浓度的各组壳聚糖-胶原支架材料上,细胞均能黏附、生长良好,其中实验组2的多孔支架材料上细胞增殖更接近单纯胶原材料(实验组1),且材料收缩降解速度明显低于其他2组。结论不同浓度配比的壳聚糖-胶原支架材料中,壳聚糖∶胶原=3∶7的复合支架材料具有良好的三维空间结构和细胞相容性,且材料形变相对较小。     

新型脱细胞骨基质-壳聚糖复合支架的生物相容性研究

[目的]评价新型脱细胞骨基质-壳聚糖(ABECM/CS)骨组织工程复合多孔支架的生物相容性和安全性,为临床应用提供实验依据.[方法]采用联合脱细胞方法对猪股骨进行处理后制备脱细胞骨基质/壳聚糖骨组织工程复合支架.分离、培养兔骨髓间充质干细胞传代后进行实验.采用MTT法观察材料浸提液于1、3、5、7d时进行细胞毒性实验观察细胞的活性;将材料浸提液与稀释血混合离心后观察红细胞溶血情况,检测OD值计算相对溶血率;将材料浸提液经静脉注入兔体内进行热原实验,在规定时间内观察兔体温变化.[结果]细胞毒性实验显示,培养1、3、5、7d后各时间段内三组OD值两两比较(P＞0.05)无显著差异,表明材料无毒性.在溶血实验中观察实验材料的溶血率为3.0％,在标准值溶血率5％范围内,提示无溶血现象发生.热原实验结果显示每只兔体温升高均低于0.6℃,且3只兔体温升高总度数低于1.4℃,符合热原检测规定,复合材料无致热作用.[结论]经联合脱细胞处理制备的ABECM/CS复合支架无细胞毒性、无溶血反应、无热原性,具有良好的生物相容性和安全性,可作为构建组织工程骨的支架载体材料.     

壳聚糖-同种异体骨粉复合多孔支架修复大鼠骨缺损的实验研究

目的探索壳聚糖-同种异体骨粉复合多孔支架材料修复骨缺损以及作为骨组织工程支架材料的可行性。方法取壳聚糖与脱钙处理后的SD大鼠同种异体骨粉,按质量比1∶5比例混合后,通过冷冻干燥技术制备复合多孔支架材料,以单纯壳聚糖制备的支架作为对照。大体观察两种支架,乙醇替代法测量孔隙率,扫描电镜测量孔径。于40只SD大鼠双侧股骨内上髁制备直径为3.5 mm的孔,左侧孔内植入复合多孔支架(实验组),右侧植入单纯壳聚糖支架(对照组)。术后2、4、8、12周取材行大体观察、组织学及免疫学化学染色观察。结果经冷冻干燥制备的复合多孔支架色泽微黄,质地较脆,易折断;支架孔隙孔径以200~300μm为主,孔隙率为76.8%±1.1%,与单纯壳聚糖支架(78.4%±1.4%)比较,差异无统计学意义(t=—2.10,P=0.09)。支架植入大鼠体内后,大体及组织学观察示,随时间延长可见新生骨逐渐填充缺损区,且实验组明显多于对照组;术后4、8、12周实验组单位视野成骨面积均显著大于对照组,比较差异有统计学意义(P0.05)。免疫组织化学染色观察示,实验组各时间点均见骨保护素阳性表达,且阳性表达量均显著高于对照组,比较差异有统计学意义(P0.05)。结论壳聚糖-同种异体骨粉复合多孔支架材料具有适宜孔隙率和良好成骨活性,可有效修复大鼠骨缺损,其成骨量及成骨速度优于单纯壳聚糖支架,有望作为骨组织工程支架材料。     

软骨细胞外基质与壳聚糖复合制备组织工程软骨支架及其性能研究

 目的 探讨采用壳聚糖与脱细胞软骨基质复合制备组织工程软骨支架的可行性,检测其理化性能和细胞相容性。方法 取天然人软骨粉碎.取 100 nm~5μm 软骨微丝,脱细胞处理后制备为质量浓度 1%悬液.与质量浓度 2%壳聚糖醋酸溶液按 1颐1(重量比)充分搅拌混合,冷冻干燥制备复合支架。对支架交联,并进行组织学、扫描电镜、孔隙率及吸水性测定、生物力学评估, MTT法分析支架浸提液毒性。分离培养犬软骨细胞.种植到支架上.倒置显微镜、电镜观察细胞在支架的生长、分化情况。结果 组织学显示支架中无细胞碎片残留.II型胶原免疫组化染色阳性。扫描电镜显示支架内孔洞相互连通似海绵状.孔径为(136.2±34.9)μm.孔隙率为 81.4%±3.5%.吸水性约为 1525.7±129.3%。支架纵向弹性模量为(1.940±0.335)MPa。 MTT法显示不同浓度支架浸提液与对照培养液吸光度值比较.差异无统计学意义(P>0.05)。倒置显微镜观察.细胞在支架上粘附良好.扫描电镜下细胞在支架上均匀分布.呈圆形或椭圆形.有基质分泌。结论 软骨细胞外基质和壳聚糖复合制备的仿生三维多孔双相支架.具有较高的孔隙率和吸水性.良好的生物力学特性.无毒.生物相容性良好.是组织工程软骨的良好支架载体。     

聚乙烯醇/壳聚糖复合纳米纤维支架构建及降解行为研究

目的 制备能够模拟皮肤ECM生理结构的聚乙烯醇(PVA)/壳聚糖复合纳米纤维支架,并研究其体内外降解行为。 方法 (1)利用静电纺丝技术分别构建PVA纳米纤维支架和PVA/壳聚糖复合纳米纤维支架,采用戊二醛蒸气法对2种支架样本分别进行交联,于扫描电镜下观察2种支架的形貌。(2)体外降解实验：分别裁取2种支架样本(2 cm ×2 cm)置于PBS中,37.0℃水浴温育3、7、14 d取出,干燥,真空条件下喷金后于扫描电镜下观察支架形貌变化。(3)体内降解实验：将48只Wistar大鼠按随机数字表法分为2组,其一为PVA组,大鼠脊柱两侧对称区域（4处）皮下埋植PVA纳米纤维支架;另一为PVA/壳聚糖组,大鼠脊柱两侧对称区域（4处）皮下埋植PVA/壳聚糖复合纳米纤维支架。每组24只大鼠。术后3、7、14、28 d,分别取各组6只大鼠埋植样本,HE染色行组织形态学观察。 结果 (1)交联后PVA纳米纤维支架和PVA/壳聚糖复合纳米纤维支架的纤维表面光滑,纤维直径分布均匀(200 ～300 nm),具有较高的孔隙率。(2)体外降解实验结果显示：温育3、7、14 d,PVA纳米纤维支架的纤维分别呈现溶胀、溶解、融合的形貌变化;而PVA/壳聚糖复合纳米纤维支架的纤维则分别呈现溶胀、溶解断裂、消失的形貌变化。(3)体内降解实验结果显示：术后3、7、14、28 d,2组纤维支架结构均分别呈现松散、边界不清、大部分被降解及最终消失的形貌学变化。 结论 采用静电纺丝技术可成功制备PVA/壳聚糖复合纳米纤维支架,交联后的该支架具有与组织重构相适宜的降解行为。     

Alginate and chitosan polyion complex hybrid fibers for scaffolds in ligament and tendon tissue engineering

Selecting the material for a scaffold is critically important for the success of tissue engineering. To simplify complicated biosynthetic matrices and achieve a novel class of potential materials, a model of polyion complex fibers was prepared from alginate and chitosan. In the current in vitro study, we thought that alginate-based chitosan hybrid biomaterials could provide excellent supports for fibroblast adhesion. In the current study, alginate polymer fiber (alginate group) and alginate-based chitosan hybrid polymer fibers (alginate with 0.05% chitosan, alginate-chitosan 0.05% group; alginate with 0.1% chitosan, alginate-chitosan 0.1% group) were originally prepared. We investigated the adhesion behavior of rabbit tendon fibroblast onto alginate polymer fibers versus the adhesion of the fibroblast onto alginate-based chitosan hybrid polymer fibers. Furthermore, mechanical properties and synthesis of the extracellular matrix were investigated. Mechanically, the novel fiber has considerable tensile strength of more than 200MPa. We demonstrated that the alginate-based chitosan hybrid polymer fibers showed much improved adhesion capacity with fibroblast compared with alginate polymer fiber. Additionally, morphologic studies revealed the dense fiber of the type I collagen produced by the fibroblast in the hybrid polymer fibers. We concluded that an alginate-based chitosan hybrid polymer fiber has considerable potential as a desirable biomaterial scaffold for tendon and ligament tissue engineering.     

壳聚糖与Ⅱ型胶原复合制作组织工程软骨支架及其性能研究

目的探讨采用壳聚糖与Ⅱ型胶原复合制作新型组织工程软骨三维多孔支架的方法,并对其理化性能进行检测. 方法将精制88%脱乙酰度壳聚糖溶于0.2 mol/L醋酸溶液制成2%溶液,高纯度猪Ⅱ型胶原溶于0.5 mol/L醋酸溶液制成1%溶液,两者按4∶1(重量比)充分搅拌混合,采用冷冻干燥法制成壳聚糖与Ⅱ型胶原复合支架.采用碳化二亚胺/ N-羟基琥珀酰亚胺对支架进行交联,力学测定比较支架交联前后的强度变化,扫描电镜观察其超微结构,于2、4、6和8周经溶菌酶体外降解实验测定其体外降解性. 结果制备的复合支架成形良好,交联后其力学强度明显增加.扫描电镜显示壳聚糖与Ⅱ型胶原成分在支架内分布均匀,支架内孔洞相互连通似海绵状,孔径100～250 μm.各时间段复合支架体外降解较单纯壳聚糖支架快. 结论壳聚糖与Ⅱ型胶原复合成功地制作成了三维多孔复合支架.其理化性能及体外降解测定,可以作为支架载体,应用于组织工程软骨的构建.     

纳米结构PCL—b—PLLA材料特性及其与犬软骨细胞的生物相容性研究

目的探讨具有纳米结构的聚己内酯／左旋聚乳酸共聚物（PCL—b—PLIJA）作为半月板组织工程支架的可行性，及其与犬软骨细胞的体外生物相容性。方法开环聚合制备PCL-b-PLLA，液-液相分离技术制备纳米结构PCL—b—PLLA支架，固-液相分离技术制备PCL—b—PLLA支架，扫描电镜（SEM）观察材料结构；测定纳米结构支架体外降解率及力学强度。分离培养犬软骨细胞，取第3代软骨细胞接种于纳米结构PCL—b—PLIA（实验组）、PCL—b—PLLA（对照组）支架材料上进行三维培养6d，SEM观察软骨细胞的形态、粘附、生长状况；细胞支架复合培养3、6、12d后，Hoechst33258荧光法检测复合物中细胞DNA含量、BCA法测定蛋白质含量。结果实验组支架材料相对分子量150kD，压缩强度为72．6KPa，孔隙率为93％。SEM示实验组支架表面为多孔状，孔壁为纤维网状连接。其降解率起初始较慢，8周后降解速率明显加快。软骨细胞在实验组支架上粘附、增殖优于对照组。随时间延长细胞在支架材料上DNA和蛋白质含量逐渐增加，实验组DNA和蛋白质含量均明显高于对照组（P〈0．01，P〈0．05）。结论具有纳米结构的PCL-b—PILA支架具有良好的生物力学性能及可降解性，可显著促进细胞粘附、增殖及合成代谢，有望成为一种较为理想的半月板组织工程支架材料。     

Effects of a chitosan scaffold containing TGF-beta1 encapsulated chitosan microspheres on in vitro chondrocyte culture

The objectives of this study were (1) to develop a three-dimensional chitosan scaffold in combination with transforming growth factor-beta1 (TGF-beta1)-loaded chitosan microspheres and (2) to evaluate the effect of the TGF-beta1 release on the chondrogenic potential of rabbit chondrocytes in the scaffolds. TGF-beta1 was loaded into chitosan microspheres using an emulsion-crosslinking method, resulting in spherical shapes with a size ranging from 0.3 to 1.5 microm. Controlled release of TGF-beta1, as measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), was observed with chitosan microspheres over 7 days. Chitosan solutions (2% and 3%) were fabricated into two types of scaffolds with different pore morphologies and mechanical properties using a freeze-drying technique, with the result that scaffold with higher concentrations showed smaller pores and lower porosity, leading to a much stronger scaffold. The TGF-beta1 microspheres were incorporated into the scaffolds at a concentration of 10 ng TGF-beta1/scaffold and then chondrocytes seeded into each scaffold and incubated in vitro for 2 weeks. The 2% chitosan scaffolds showed higher cell attachment levels than the 3% chitosan scaffolds (P < 0.01), regardless of the TGF-beta1 microspheres. Both the proliferation rate and glycosaminoglycan (GAG) production were significantly higher for scaffolds incorporating TGF-beta1 microspheres than for the control scaffolds without microspheres 10 days after incubation. Extracellular matrix staining by Safranin O and immunohistochemistry for type II collagen both significantly increased in scaffolds containing TGF-beta1 microspheres. These results suggest that the TGF-beta1 microsphere incorporated in scaffolds have the potential to enhance cartilage formation.     

骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球复合组织工程支架修复兔股骨髁部骨缺损的实验研究

目的 探讨重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)壳聚糖缓释微球复合聚乳酸-聚羟乙酸/磷酸三钙(PLGA/TCP)支架修复骨缺损的可行性和有效性.方法 取健康成年新西兰大白兔45只,在40只实验动物股骨髁部制备0.6 cm×1.0 cm骨缺损.实验分4组:A组:缺损组,B组:用PLGA/TCP空白支架修复骨缺损,C组:用等量rhBMP-2复合PLGA/TCP支架修复骨缺损,D组:用rhBMP-2壳聚糖微球复合PLGA/TCP支架修复骨缺损,每组10只动物.另5只动物为正常对照组(E组).应用X线、Micro-CT和组织病理学等方法检测术后4、12 周各实验组骨缺损修复效果.结果 术后4周X线片示:A组无新骨形成.B组有少量新生骨影像形成,C、D组骨缺损部位均有新骨影像形成.术后12周,Micro-CT结果显示:D组骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数目等指标均优于B组和C组,差异均有统计学意义(P<0.05),A组末检测到上述指标.术后4剧,D组可见大量骨组织形成,有部分成熟的骨小梁,PLGA/TCP支架大部分被降解.吸收.术后12周,D组支架和微球完全降解.骨缺损被成熟骨取代;B、C、D组骨长入率分别为5.78%±1.21%、37.26%±6.45%、74.25%±8.91%,3组之间比较差异均有统计学意义(P<0.05).结论 复合rhBMP-2壳聚糖微球的PLGA/TCP支架具有良好的骨缺损修复效果,临床应用前景较好.     

新型脱细胞软骨基质三维多孔支架的制备

目的 探讨脱细胞软骨基质三维多孔支架的制备方法以及将其应用于关节软骨组织工程的可行性. 方法 取天然人软骨粉碎后,采用梯度离心法取100 nm～5μm软骨微丝,脱细胞处理后制备为质量体积比为3%的悬液,采用冷冻冻干法制备脱细胞软骨基质三维多孔支架.254nm紫外线和碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺对支架进行交联.冷冻冻干后,对支架材料进行组织学及扫描电镜观察,测定支架孔径和孔隙率、吸水率,并采用MTT法分析支架浸提液毒性.分离培养犬BMSCs,用TGF-β1成软骨诱导后种植至支架,倒置显微镜、电镜观察细胞在支架上的生长、分化情况. 结果 组织学观察显示,三维多孔支架中无软骨细胞碎片残留,甲苯胺蓝染色、番红O染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均呈阳性.扫描电镜显示支架内孔洞相互连通,孔径为(155±34)μm,孔隙率为91.3%±2.0%,吸水率为2 451%±155%.MTT法显示不同浓度支架浸提液与对照DMEM培养液吸光度值比较,差异无统计学意义(P＞0.05),支架无细胞毒性.倒置显微镜观察,细胞在支架上黏附良好;扫描电镜下细胞在支架上均匀分布,细胞呈圆形或椭圆形,并有基质分泌. 结论 制备的脱细胞软骨基质三维多孔支架去细胞彻底,保留了软骨ECM主要成分,无毒,具备合适的孔径和孔隙率,生物相容性良好,是软骨组织工程良好的支架载体.     

应用3D生物打印的软骨支架修复关节软骨缺损

目的通过多喷头3D生物打印机制作软骨支架,按压配方式将支架植入关节软骨缺损区,修复动物模型的关节软骨缺损并观察效果。方法在软骨细胞外基质(extracellular matrix,ECM)中加入适量的丝素蛋白(silk fibrion,SF),并加入交联剂聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)和骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)来配制生物墨水;用流变仪评估生物墨水的流变性能;使用傅立叶红外变换光谱鉴定生物墨水的蛋白质二级结构;利用装载有软骨生物墨水的加压喷头,打印厚2 mm,直径6 mm的组织工程支架;使用拉力机测量了组织工程支架的压缩模量;通过干失重法评估各个支架降解速率;CCK8及活死细胞染色评价支架上细胞的活力及增殖情况;实时荧光定量PCR评估体外培养28 d后支架上细胞软骨分化情况;按照自体软骨移植术的方式通过压配原理将支架嵌入动物关节软骨缺损区修复关节软骨缺损;用组织学染色及生化检测鉴定3个月后软骨修复效果。结果生物墨水均表现出剪切稀化的流动特性。含有丝素蛋白的生物墨水酰胺Ⅰ区吸收峰移至1623~1627 cm-1处。随着丝素蛋白含量增加,生物墨水的机械强度和降解性能提高,10%和15%打印支架等压缩模量分别达到(19.96±5.66)kpa和(26.87±10.68)kpa。各个生物墨水均无细胞明显细胞毒性。实时定量PCR表明,当丝素蛋白的含量达到10%~15%时,组织块中的骨髓间充质干细胞成软骨分化能力更强。体内研究:3个月后10%和15%的丝素蛋白生物支架sGAG/DNA含量分别为(0.25±0.01)μg/ng和(0.24±0.02)μg/ng,胶原/DNA含量分别为(17.71±0.83)ng/ng和(16.69±2.39)ng/ng,高浓度丝素蛋白打印的组织工程软骨能更好地修复关节软骨缺损。结论在含有10%和15%丝素蛋白生物墨水的3D生物打印支架中,骨髓间充质干细胞的软骨分化和细胞外基质(胶原蛋白和糖胺聚糖)的分泌均优于其他两种支架。不同支架的干细胞成软骨分化能力和细胞外基质分泌的变化,以及对关节软骨缺损的修复效果是由于支架力学性能的差异所致,并可以通过改变丝素蛋白的浓度优化。