顺铂联合胞嘧啶脱氨酶自杀基因对直肠癌细胞杀伤作用的研究

目的探讨顺铂联合胞嘧啶脱氨酶(CD)自杀基因对直肠腺癌细胞8348的杀伤作用。方法以绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因,观察在顺铂作用下GFP基因对8348细胞的转染效率;用克隆形成试验观察顺铂对CD基因转染效率的影响;同时用四甲基偶氮唑盐(MTT)试验检测顺铂联合CD/5-氟胞嘧啶(5-FC)对8348细胞的杀伤作用。结果顺铂提高质粒对8348细胞的转染效率26倍。对腺癌细胞的杀伤效率:单纯转染CD基因组为14.9%;IC50的氟尿嘧啶(5-FU)联合CD基因组为54.9%;IC50的顺铂联合CD基因组为88.5%,与其他两组相比,对癌细胞杀伤效率明显增强(P<0.01)。结论顺铂联合CD自杀基因能更有效地杀伤直肠腺癌细胞,可成为治疗直肠癌术后复发及转移的一种有效的方法。     

腺病毒介导的双自杀基因对直肠癌细胞的杀伤作用

目的 探讨直肠癌的基因治疗方法。方法 用重组腺病毒介导外源胞嘧啶脱氨酶（CD）基因、单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV－tk）基因转移到人直肠癌细胞系HR－8348,通过细胞集落形成实验、细胞存活率测定（MTT法）,检测、分析CD和HSV－tk双自杀基因系统对肿瘤细胞的作用。结果 重组腺病毒介导的CD和HSV－tk自杀基因可在HR－8348细胞高效表达。用腺病毒穿梭质粒pAdCMV-Linkl(CD tk)、Linkl(-)、pAdCMV-Linkl(CD)、pAdCMV-Kinkl(tk）重组腺病毒感染HR－8348细胞,不加5－氟胞嘧啶（5－FC）、环氧鸟苷（GCV）,各组肿瘤细胞的集落形成和存活率的差异无显著性意义（P＞0．05）。应用5－FC、GCV后,pAdCMV-Linkl(CD tk)转染组细胞集落形成和存活率显著低于对照组pAdCMV-Link（－）转染组（P＜0．01）,也低于pAdCMV-Linkl(CD)、pAdCMV-Linkl(tk）转染组（P＜0．05）。CD和5－FC、HSV－tk和GCV系统联合使用较单一自杀基因系统对HR－8348直肠癌细胞的集落形成、细胞生长有更显著的抑制作用,对肿瘤细胞有更强的杀伤能力和“旁观者效应”。结论 CD和HSV－tk双自杀基因联合作为肿瘤基因治疗的一种手段和方法,较单一自杀基因具有更强的抗肿瘤作用。     

双自杀基因重组腺病毒对肺癌细胞的杀伤作用

目的构建含CD／UPRT双自杀基因的重组腺病毒Ad—CD／UPRT，观察其对人肺腺癌细胞的杀伤作用。方法用0～100感染复数的重组腺病毒转染肺腺癌A549细胞后加入（0～1000）mg／L的5-氟胞嘧啶（5-FC），MTT法检测杀伤效率；将转基因细胞与未转基因细胞按不同比例混合，观察旁观者效应。结果Ad-CD／UPRT转染A549后对细胞生长有显著的抑制作用，细胞杀伤效率随腺病毒滴度及5-FC浓度的增加而增强；转基因细胞占混合细胞10％以上，即可观察到明显的旁观者效应。结论Ad—CD／UPRT联合5-FC对肺腺癌A549细胞有显著杀伤作用。     

腺病毒载体介导的双自杀基因对人胆管癌细胞QBC939的体外杀伤实验

目的观察腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶/单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(CD/TK)双自杀基因对人胆管癌细胞 QBC939的体外杀伤作用。方法 CD/TK 克隆入穿梭载体成为 pAdtrack-CMV-CD/TK,与骨架载体 pAdeasy-1在细菌内同源重组为 pAd-CD/TK,经 PacⅠ酶切,293细胞包装、扩增、纯化后,体外转染人胆管癌细胞 QBC939,并给予前药5-FC 或 GCV,观察其体外杀伤效果。结果含 CD/TK 基因的重组腺病毒鉴定正确,扩增纯化后,病毒滴度为1×10~(11)颗粒/ml。重组腺病毒对 QBC939细胞在感染倍数(m.o.i)为100时的转染效率为90%,在 m.o.i50感染时,0.1mmool/L的5-FC 及10 μmol/L 的 GCV 对 QBC939细胞的杀伤率为80%,明显高于单用5-FC 与 GCV 的效应。结论双自杀基因以腺病毒为载体对人胆管癌细胞转染效率高,体外杀伤效应明显。腺病毒介导的双自杀基因治疗有望成为治疗胆管癌的有效方法。     

辐射联合脂质体介导的胞嘧啶脱氨基酶/5-氟胞嘧啶系统体外抑杀人胰腺癌细胞的研究

目的探讨辐射联合脂质体介导的胞嘧啶脱氨基酶(CD)/5-氟胞嘧啶(5-FC)系统对胰腺癌的协同治疗作用。方法在脂质体介导下,将CD基因导入人胰腺癌PC3细胞,经G418筛选出稳定表达的克隆。用RT-PCR法鉴定CD基因的整合及表达;MTT法检测给入前药5-FC后细胞的存活率及其旁观者效应;细胞克隆形成实验检测钴-60(~(60)Co)体外照射传代培养后细胞的辐射敏感性。结果 CD基因在转染了CD基因细胞中获得了稳定表达;5-FC对转染CD基因细胞具有较强的杀伤及旁观者杀伤效应(P0.05),联合辐射能进一步增强这一杀伤效应(P0.05);5-FC处理过的转染了CD基因的PC3细胞对辐射的敏感性明显提高(P0.05),临床相关剂量(2 Gy)照射时转染CD基因细胞的放射增敏比达到1.5。结论 CD/5-FC系统对转染了CD基因的细胞具有明显的辐射增敏效应,联合应用辐射和CD/5-FC系统能显著增强CD/5-FC系统对PC3细胞的杀伤作用。     

胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶系统治疗胰腺癌体内实验研究

目的探讨胞嘧啶脱氨酶(CD)基因对胰腺癌的杀伤作用机制。方法 应用细菌内同源重组法构建含CD基因的腺病毒载体,将Patu8988、SW1990胰腺癌细胞皮下接种BALB/C裸鼠建立胰腺癌的移植瘤模型,重组CD腺病毒液以1010 pfu/ml原位注射入肿瘤,每周2次,24 h后腹腔给予前药5-氟胞嘧啶(5-FC),连续4周。结果 CD基因原位转导的裸鼠移植瘤生长明显受抑。Patu8988移植瘤治疗组肿瘤重量为(587.7±107.8)mg,SW1990移植瘤组治疗组肿瘤重量为(597.6±159.4)mg,对照组重量为(2 042.4±608.0)mg(P<0.01)。结论重组CD基因的腺病毒载体对胰腺癌不仅转染效果强,加用前药5-FC后,可直接或通过旁观者效应抑制移植瘤的生长。     

腺病毒载体介导的胞嘧啶脱氨酶和胸苷激酶融合基因体外抑瘤效果的观察

目的：构建重组腺病毒载体，观察自杀基因对不同大肠癌细胞系的细胞毒作用。方法：利用重组腺病毒载体介导的胞嘧啶脱氨酶（CD）、单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk)融合基因感染人结肠腺癌细胞系LoVo、HCT－8和直肠腺癌细胞系HR－8348，通过细胞集落形成实验、细胞存活率测定（MTT法），检测和分析HSV－tk／丙氧鸟苷（GCV）、CD／5－氟胞嘧啶（5－FC）双自杀基因系统对肿瘤细胞的杀伤作用和旁观者效应的大小。结果：Western Blot检测分析融合基因的表达，显示重组腺病毒介导的双自然基因可以在3种肿瘤细胞中表达。不加5－FC和GCV时，各转染组和对照组肿瘤细胞集落形成分别为：94、93、95；96、94，比较差异无显著性（P＞0．05）。在5－FC（80．0mg/L）和GCV（0．8mg/L)浓度下3种肿瘤细胞存活率降至2．1％、4．3％和3．2％，与不同前药相比差异有显著性（P＜0．01）。感染细胞在混合细胞中比例仅仅占5％时，就能获得明显的旁观者效应，细胞杀伤率分别升至22．2％、34．8％和40．4％。结论：CD、TK融合基因联合联合双前药治疗能取得显著的抗肿瘤作用。     

双自杀基因体系对胆囊癌细胞体内外杀伤作用的研究

目的　研究联合应用双自杀基因对胆囊癌细胞的杀伤作用。方法　将GBC SD/CD tk细胞和GBC SD细胞分别接种于裸鼠皮下 ,观察前体药物应用前后肿瘤体积的变化。将CD和HSV tk自杀基因转染胆囊癌细胞GBC SD ,MTT法观察 5 氟胞嘧啶或 /和丙氧鸟苷的杀伤作用。结果　单独应用 5 氟胞嘧啶或丙氧鸟苷均能对转染阳性的胆囊癌细胞GBC SD/CD tk产生明显的杀伤效应 ,联合应用可以产生更大的杀伤作用 ,旁观者效应明显 ;GBC SD/CD tk和GBC SD细胞分别接种裸鼠后成瘤性无明显差别 ,转染组的杀伤作用明显 ,体内局部旁观者效应明显。结论　双自杀基因的应用对胆囊癌细胞具有明显的杀伤作用 ,其旁观者效应明显。     

双启动子引导自杀基因靶向杀伤5-FU耐药肿瘤细胞的研究

目的：探讨胸苷酸合成酶（TS）基因启动子和p16基因启动子引导胸苷激酶（TK）自杀基因靶向杀伤5－FU耐药肿瘤细胞的作用。方法：构建TS、p16双启动子重组表达载体,将TK基因插入TS、p16启动子之间,转染耐药人直肠癌细胞系HR－8348、外周血单个核细胞。通过克隆形成实验、细胞存活率测定和裸鼠移植瘤治疗实验,观察双启动了引导TK基因特异杀伤肿瘤细胞的作用。结果：将TS、p16双启动子重组质粒载体转入耐药HR－8348细胞,检测TS、TK基因表达阳性,TK基因与TS表达一致。转染组和对照组肿瘤细胞集落形成分别为：9／300、92／300。转染组瘤细胞集落形成率明显降低（t=33.885,P＜0．01）,癌细胞生长抑制率显著提高。对裸鼠移植瘤的生长抑制率为74．5％。在转染的外周血单个核细胞,p16表达阳性,TS、TK表达阴性。转染双启动子重组质粒对正常外周血单个核细胞无损伤作用。结论：TS和p16双启动子可引导TK基因靶向性杀伤5－FU耐药肿瘤细胞,保护肌体正常细胞,提高自杀基因治疗的安全性。     

腺病毒载体介导的自杀基因对MFC小鼠前胃癌细胞的体外杀伤作用

提高转基因效率,建立高效自杀基因杀伤胃癌肿瘤细胞的方法。方法：首先构建含CD基因的重组腺病毒载体并对载体进行包装、收获病毒上清并纯化。将重组病毒液转染MFC胃癌细胞进行体外抑瘤实验。结果：含CD基因的重组腺病毒载体经酶切鉴定选出：包装纯化后,检测病毒浓度为1.2×1012颗粒/ml。体外实验中,转CD基因的MFC细胞在5-FC作用下生长明显受抑(P<0.01,n＝9)。结论：腺病毒载体转导的CD基因提高了转染效率,为大量杀伤胃癌细胞奠定了基础。     

重组腺病毒介导CD自杀基因联合野生型p53基因对直肠癌细胞的杀伤作用

目的 观察重组腺病毒介导胞嘧啶氨酶（ＣＤ）基因和人野生型ｐ５３基因共转染对直肠癌细胞的杀伤作用。方法 用携带ＣＤ／ｐ５３、ＣＤ、ｐ５３基因腺病毒感染直肠癌细胞ＳＷ８３７,计数瘤细胞集落数,采用四唑蓝比色（ＭＴＴ法）检测瘤细胞存活率。于６０只裸鼠移植瘤内注射重组腺病毒、磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）,测定肿瘤生长抑制率。结果 用ＣＤ／ｐ５３、ＣＤ、ｐ５３重组腺病毒感染ＳＷ８３７细胞,加５－ＦＣ后细胞集落形成分别为：６、３８、６９。裸鼠移植肿瘤生长抑制率分别为７８．６％、５６．５％、２２．３％。ＣＤ／ｐ５３重组腺病毒感染组肿瘤细胞集落形成和存活率下降最显著（Ｐ〈０．０１）,对肿瘤的抑制作用明显。结论 ＣＤ自杀基因与野生型ｐ５３基因共转染对肿瘤细胞有更强的杀伤作用。     

脂质体转染CD基因联合放射线对人直肠癌荷瘤裸鼠体内抗癌作用的研究

目的　探讨脂质体反复转染CD基因联合放射线对人直肠癌细胞荷瘤鼠体内的抗癌效果 ,为临床治疗直肠癌提供理论依据。方法　构建PXJ4 1/CD载体并进行测序证实 ,制备人直肠癌细胞荷瘤鼠 ,待瘤体长至长径达 0 5cm后 ,设实验组应用脂质体于治疗的当日及第 4、8、12天反复转染 ,于当日起 2Gy/day连续照射患肢 15d ,第 3天起 5 FC 80 0mg/kg/day腹腔注射共 12d ,另设单纯放射组、单纯CD/ 5 FC治疗组、空白对照组 ,观察荷瘤裸鼠的肿瘤生长曲线 ,瘤体积抑制率和瘤重抑制率。结果　荷瘤裸鼠肿瘤生长曲线显示 :实验组肿瘤生长曲线平缓 ,治疗效果显著 ,瘤体积抑制率平均为 81 5 % ,瘤重抑制率平均为 78 7% ,与其它 3组比较差异有显著性意义 (χ2 =2 87 86 ,P <0 0 1)。病理学检查示肿瘤细胞较对照组明显减少。结论　脂质体反复转染CD基因联合放射线治疗直肠癌荷瘤鼠 ,二者可产生协同作用 ,比单纯放疗或单纯CD/ 5 FC有更显著的抗癌疗效     

FasL基因表达对缺氧状态下直肠癌细胞增殖凋亡的影响

目的探讨直肠癌侵袭转移过程中FasL基因表达对细胞增殖凋亡的影响。方法采用北京军区总医院普通外科实验室构建的4组不同侵袭力的人直肠癌HR-8348细胞亚型HR-8348B、HR-8348L、HR-8348F和HR-8348As,并用化学缺氧法构建上述4组细胞的缺氧12h模型,以Western印迹法验证各组细胞内FasL蛋白的表达水平和缺氧状态下细胞内FasL蛋白的表达,流式细胞仪测定细胞周期分布并计算细胞增殖指数,四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定细胞增殖能力改变并计算细胞抑制率,末端标记法（TUNEL）测定细胞凋亡状况。结果Western印迹显示FasL蛋白于40000处显色。常氧条件下HR-8348F细胞内FasL的表达水平显著高于HR-8348B、HR-8348L和HR-8348As（F=361.149。P〈0.01）;缺氧12h时各组细胞均生长良好,形态较常氧状态皱缩;HR-834F,细胞内FasL的表达水平仍显著高于其他3组（F=278.766,P〈0.01）,但其自身常氧与缺氧状态下FasL的水平差异无统计学意义（t=1.762,P〉0.05）。缺氧12h后各组细胞增殖均受到抑制,HR-8348F细胞的增殖指数（60.43±3.72）显著高于HR-8348B（40.01±3.30）、HR-8348L（41.30±4.06）和HR-8348As（35.87±4.39）（F=39.477,P〈0.01）,增殖抑制率（17.30±1.98）和凋亡指数（13.10±1.04）显著低于HR-8348B（33.70±4.33和21.60±1.31）、HR-8348L（34.20±3.92和20.10±1.15）、HR-8348As（38.00±4.55和23.90±1.23）细胞（F分别为28.811和76.462,P〈0.01）。结论缺氧环境中,直肠癌细胞FasL表达增强可导致细胞增殖加速、凋亡减少和侵袭能力增强。促进细胞对微环境缺氧的耐受。     

胞嘧啶脱氨酶基因、单纯疱疹病毒胸苷激酶基因治疗裸鼠肝门部胆管癌皮下移植瘤的研究

目的　观察胞嘧啶脱氨酶基因 (CD)、单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (HSV tk)共表达对裸鼠人肝门部胆管癌皮下移植瘤的治疗作用。方法　用转染有双自杀基因的包装细胞PA3 17产生的病毒上清 ,感染裸鼠肝门部胆管癌皮下移植瘤 ,给予前体药物 5 氟胞嘧啶 (5 FC) 5 0 0mg/kg体重和 /或无环鸟苷 (GCV ) 10 0mg/kg体重后 ,1次 /d ,共 10d ,观察肿瘤的生长情况。 结果　双自杀基因在裸鼠肝门部胆管癌皮下移植瘤中稳定表达 ,转基因组肿瘤的生长明显受到抑制 (P <0 .0 1) ;CD tK / 5 FC GCV组、CD/ 5 FC组、tK/GCV组抑瘤率分别为 88.3 1%、63 .5 2 %、65 .0 5 %。双自杀基因组与单自杀基因比较差异有显著性 (P <0 .0 5 )。结论　双自杀基因可明显抑制裸鼠肝门部胆管癌皮下移植瘤生长 ,较单一自杀基因有更强的抗肿瘤作用     

HSV-tk/CD融合基因杀伤人胆管癌细胞QBC939的体内实验

目的 研究单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）／胞嘧啶脱氨酶（CD）融合基因在动物体内对人胆管癌的杀瘤作用。方法构建人胆管癌的裸鼠皮下移植瘤动物模型,按排序法随机分为4组,每组8只。对照组,每只裸鼠腋部瘤体内注人不含自杀基因的腺病毒液0．1ml,CD基因组、tk基因组和HSV-tk／CD融合基因组,在每只裸鼠腋部瘤体内分别注人CD基因、tk基因及HSV-tk／CD融合基因的重组腺病毒液0．1ml。注射后24h每只裸鼠腹腔内注射5-氟胞嘧啶（5-flurocytosine,5-FC）和丙氧鸟苷（ganciclovir,GCV）,观察肿瘤的生长情况。结果CD基因组、tk基因组及HSV-tk／CD融合基因组肿瘤的生长均受到不同程度的抑制,与对照组比较,抑制率分别为41．2％、55．7％和70．7％,P均〈0．05;病理组织学检查显示,对照组肿瘤生长良好,细胞分裂相多见;其余各组出现不同程度的肿瘤坏死,这种现象以HSV-tk／CD融合基因组最为明显。结论HSv-tk／CD融合自杀基因在胆管癌细胞体内也具有较强的杀瘤活性,但作用不够彻底,可能与旁观者效应（bystand ereffect,BSE）的效应强度有关。     

Potential benefits of combining cytosine deaminase/5-fluorocytosine gene therapy and irradiation for prostate cancer: Experimental study

BACKGROUND: The purpose of this study was to investigate the potential of combining cytosine deaminase/5-fluorocytosine (CD/5-FC) gene therapy and radiation therapy (either external beam radiation or radioimmunotherapy [RIT]), for the treatment of prostate cancer. METHODS: Tumor xenografts of CD-transduced LNCaP cells grown in the testes of severe combined immunodeficiency (SCID) mice were used to evaluate antitumor effect. The mice were injected intraperitoneally with 500 mg/kg of 5-FC, or with 5, 15 or 30 mg/kg of 5-fluorouracil (5-FU), for 9 days. The tumors were treated with fractionated radiation at a dose of 1 or 3 Gy/day for 3 days, or I-131 labelled anti-prostate specific antigen (anti-PSA) monoclonal antibody (mAb) administration at a subtherapeutic dose of 20 or 80 micro Ci. Intratumoral and serum concentrations of 5-FU were measured using high performance liquid chromatography. RESULTS: Mice treated with CD/5-FC gene therapy presented a significant tumor growth inhibition comparable to that obtained with 15 mg/kg, 5-FU systemic administration without marked weight loss. Treatment with CD/5-FC gene therapy resulted in higher tumor but lower serum concentrations of 5-FU than treatment with systemic 5-FU chemotherapy. An additive antitumor effect was obtained when CD/5-FC therapy was combined with 1 Gy irradiation, which by itself did not produce a significant antitumor effect. However, the efficacy of CD/5-FC therapy was not enhanced when combined with RIT, probably due to poor accumulation of the mAb as the tumor/blood ratio never exceeded 1. CONCLUSION: These findings indicate that CD/5-FC gene therapy for prostate cancer may function with enhanced antitumor effect when combined with external beam radiation. However, combining CD/5-FC gene therapy and RIT using an anti-PSA mAb may not be effective because of insufficient accumulation of the mAb at the target tumors.     

Combined antitumor effects of an adenoviral cytosine deaminase/thymidine kinase fusion gene in rat C6 glioma

OBJECTIVE: In this study, we investigated the feasibility of a double-suicide gene/prodrug therapy, involving direct introduction of the herpes simplex virus Type 1 thymidine kinase (TK) gene and the Escherichia coli cytosine deaminase (CD) gene, via a recombinant adenoviral vector, and ganciclovir (GCV) and/or 5-fluorocytosine (5-FC) treatment, in a rat C6 glioma model. METHODS: Efficient gene transfer and transduction of C6 glioma cells via a recombinant adenovirus were evaluated by infecting cells with adenovirus bearing the beta-galactosidase gene and then staining cells with X-5-bromo-4-chloro-3-indolyl-13-D-galactoside. CD/TK expression in cells infected with adenovirus bearing the CD/TK gene (ad-CD/TK) was examined by immunoblotting analysis. For in vitro cytotoxicity experiments, the cells were infected with ad-CD/TK or ad-deltaE1 (as a control). After the addition of a variety of concentrations of GCV and 5-FC, either separately or in combination, cell viability was determined by staining the cells with crystal violet solution 6 days after infection. For in vivo antitumor experiments, 1x10(5) cells were stereotactically injected into the right caudate-putamen of female Wistar rat brains. At 3 days after implantation, 1x10(8) plaque-forming units of ad-CD/TK or ad-deltaE1 (as a control) were stereotactically injected into the tumors and GCV (25 mg/kg) and 5-FC (250 mg/kg), alone or in combination, were intraperitoneally administered. Animals were then killed, and tumor volumes were measured by determining the tumor area in every fifth section, using a light microscope. RESULTS: C6 glioma cells were efficiently transduced with recombinant adenoviral vector at multiplicities of infection of 200 or more. In vitro cytotoxicity of GCV and/or 5-FC, either alone or in combination, was exclusively observed in the cells transduced with ad-CD/TK. Obvious cytotoxicity (>50% inhibition) was observed in the presence of 5-FC at concentrations greater than 30 microg/ml or GCV at concentrations greater than 0.3 microg/ml at a multiplicity of infection of 100. Additionally, cytotoxicity in the presence of both GCV and 5-FC was greater than that after single-prodrug treatments, indicating additive effects of the prodrug treatments. In in vivo experiments, the tumor volumes of the rats treated with GCV or 5-FC alone after ad-CD/TK injection (59.1+/-4.6 and 57.4+/-7.1 mm3, respectively) were significantly smaller than that of the control rats (157+/-8.9 mm3, P<0.05). Furthermore, the tumor volume of the rats treated with GCV and 5-FC in combination was 14.7+/-1.8 mm3. CONCLUSION: These results demonstrated the efficient transduction of C6 glioma cells with a recombinant adenovirus and the additive effects of CD/TK fusion gene/GCV/5-FC treatment, compared with single-gene therapy with the TK or CD gene. Therefore, our data suggest that the direct administration of a double-suicide gene/prodrug therapy has great potential in the treatment of brain tumors.