苯并(a)芘通过降低突触融合蛋白17和溶酶体关联膜蛋白2表达阻抑人脐静脉内皮细胞自噬流

目的 研究苯并(a)芘(BaP)影响人脐静脉内皮细胞(HUVEC)自噬的机制。方法 HUVEC经BaP(2.5、5、10 μmol/L)处理24 h后,分别采用间接免疫荧光法、Western blot、吖啶橙染色和单丹磺酰尸胺染色等技术方法,检测自噬体及其内容物降解、目标蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)、选择性自噬接头蛋白p62、Beclin-1、自噬相关蛋白5(Atg5)、Atg7、Atg12、组织蛋白酶B(CTSB)、组织蛋白酶D(CTSD)、突触融合蛋白17(STX17)、溶酶体关联膜蛋白2(LAMP2)表达、溶酶体数量与功能,及相关上游关键调控蛋白丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(Akt)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、转录因子EB(TFEB)磷酸化水平。结果 BaP暴露组HUVEC内,检测结果显示:(1)LC3 puncta水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比率增加,自噬起始关键蛋白(Beclin-1、Atg5、Atg7、Atg12)表达升高,Akt蛋白磷酸化则明显降低;(2)p62 puncta和p62蛋白水平明显升高;(3)溶酶体数量增加,并伴随着溶酶体特征性水解酶(CTSB、CTSD)表达升高,相应地ERK、TFEB磷酸化水平增加;(4)调控自噬体与溶酶体融合的关键蛋白STX17与LAMP2降低。结论 BaP通过降低STX17与LAMP2表达水平,阻抑了HUVEC正常的自噬流。     

活性维生素D3改善高糖环境下肾小管上皮细胞自噬溶酶体通路的研究

目的探讨活性维生素D3对高糖环境下肾小管上皮细胞自噬溶酶体通路的影响和机制。方法将人近端小管上皮细胞(HK-2)细胞分为正常对照(Con)组、甘露醇组(Man)、高糖组(HG)、高糖+活性维生素D3组(HG+VD)。Western blot法检测自噬小体(LC3II)、自噬底物(P62)、溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)和组织蛋白酶B(CTSB)、维生素D受体(VDR)及转录因子EB(TFEB)蛋白表达。结果与Con组比较,HG组LC3II、LAMP1、CTSB、VDR、TFEB蛋白表达降低,P62蛋白表达升高(P0.05)。与HG组比较,HG+VD组LC3II、LAMP1、CTSB、VDR、TFEB蛋白表达升高,P62表达降低(P0.05)。结论活性维生素D3可改善高糖环境下肾小管上皮细胞自噬溶酶体通路,其机制可能与调控TFEB相关。     

大鼠库普弗细胞分离培养方法的改良

目的建立一种稳定、高效的大鼠库普弗细胞(KCs)分离培养方法。方法采用大鼠肝脏离体链酶蛋白酶E消化和胶原酶循环灌注消化。低速离心去除肝细胞,Histodenz不连续密度梯度离心和选择性贴壁的方法分离KCs。采用ED2 CD163、兔抗大鼠溶酶体膜相关蛋白2(LAMP2)免疫细胞化学．latex-beads吞噬实验和电镜观察来鉴定 KCs。结果KCs得率为5×107个,活率为98％,经鉴定ED2阳性细胞大于98％,LAMP2阳性细胞大于99％,吞噬试验及电镜观察证明分离所得为KCs。结论改良的分离培养方法稳定、高效,为进一步的研究打下了基础。     

恙虫病东方体目视LAMP现场化检测方法的建立

目的 建立基于"染料-蜡丸"的目视LAMP检测恙螨中恙虫病东方体的方法,为恙虫病的防治提供新工具.方法 选择Ot GroEL基因作为检测靶序列,在线设计并合成LAMP引物.构建rOt-GroEL重组质粒作为阳性对照.建立基于SYBR Green I的"染料-蜡丸"目视LAMP,并联合便携式LAMP仪使其利于现场应用.结...     

以肥厚型心肌病和视力障碍为表现的Danon病1例

正Danon病是一种罕见的X连锁显性遗传性溶酶体病,溶酶体相关膜蛋白-2(lysosome-associated membrane protein-2,LAMP-2)基因突变是Danon病的主要原因。这种基因突变可引起LAMP-2蛋白缺乏使糖原在脑细胞、肌肉细胞及心肌细胞中蓄积~([1-2])。因此,Danon病以肥厚型心肌病、骨骼肌病和智力障碍三联征为主要临床表现~([2-3])。此外,一些较少见的临床表现包括视网膜病~([4])、肝脏疾     

环介导等温扩增技术检测单纯疱疹病毒Ⅰ型的应用

目的建立一种用于检测单纯疱疹病毒-Ⅰ型（HSV-1）的环介导等温扩增技术（LAMP）检测方法。方法用病毒DNA提取试剂盒提取HSV-1基因组DNA。设计4条扩增HSV-1糖蛋白gG基因的LAMP引物,对HSV-DNA进行LAMP,扩增产物进行琼脂糖电泳和酶切鉴定（试验设HSV-2、HPV-6、HPV-11、沙眼衣原体对照和阴性对照）;并对3例临床标本进行LAMP检测。结果 HSV-1 LAMP产物电泳后呈LAMP特征性条带,对照组无扩增条带;扩增产物AvaⅠ酶切片段大小分别为182、140和62 bp,与理论值相符。用HSV-1 LAMP引物扩增3例口唇疱疹标本,2例标本出现LAMP条带,1例标本未扩增出条带。结论建立的LAMP方法简便、高效、快速,可用于HSV-1感染检测。     

应用环介导等温扩增技术检测弓形虫

目的 用环介导等温扩增（LAMP）技术检测弓形虫。 方法　 用酚-氯仿法提取弓形虫速殖子基因组 DNA,设计两对扩增弓形虫 B1基因的 LAMP 引物。以间日疟原虫、恶性疟原虫、卡氏肺孢子虫、日本血吸虫及小鼠白细胞作对照,进行LAMP反应,产物经 SYBR Green I显色及电泳后观察结果,绿色判为阳性,棕色判为阴性。将弓形虫速殖子经倍比稀释为（2～3）×106个/ml至（2～3）×10-1个/ml 等8个浓度,进行LAMP反应,验证该方法的敏感性。 结果 LAMP反应结果显示,弓形虫速殖子检测管经显色后呈绿色,对照组均呈棕色。弓形虫的LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带,对照组均无扩增产物。LAMP技术可检测到的弓形虫速殖子最低浓度为2～3个/ml。 结论 LAMP技术在弓形虫检测中显示出较好的特异性与敏感性。     

法布里病治疗新进展

法布里(Fabry)病是X连锁遗传的溶酶体贮积症,发病率为1∶47.6万～1∶11.7万,其中男性新生儿发病率约为1∶4万。Fabry病在儿童时就可发病,到中年可出现危及生命的并发症。男性半合子发病早,受累重,多死于终末期肾功能衰竭,女性杂合子多于中年伴发左心室肥大。研究显示,     

Danon病临床研究进展

Danon病是一种X连锁显性遗传性溶酶体病,以肥厚型心肌病、骨骼肌病和智力障碍三联征为主要临床表现,其引起的心肌病变与典型的肥厚型心肌病相似.Ⅱ型溶酶体相关膜蛋白是一种高度糖基化的蛋白质,是溶酶体膜的重要组成成份,编码Ⅱ型溶酶体相关膜蛋白的基因突变是导致Danon病的重要病因.现对Danon病的发病机制及其临床特点作一综述.     

12导联心电图对Danon病家系的早期诊断价值

目的:探讨Danon病家系中LAMP2突变基因患者的早期心电图特征。方法:纳入2014年1月就诊于我院的1个Danon病家系,收集所有家系成员的临床资料并绘制遗传图谱。在知情同意及自愿参与的前提下,采用12导联心电图对家系成员进行检查,选择Danon病家系中携带LAMP2突变基因的8例患者作为观察组,5例未携带LAMP2突变基因的正常人作为对照组。结果:8例观察组患者心电图均有异常改变,3例显示有典型的预激综合征表现(PR间期缩短、QRS波群宽大畸形、δ波),5例有非典型的异常改变,其中3例有明显的T波倒置,1例出现δ波并伴有PR间期缩短,1例T波偏低。观察组QT间期和QRS波时限较对照组明显延长,V_1、V_2导联的R波振幅显著高于对照组,差异有统计学意义(均P0.05);T波改变(T波低平、T波倒置、T波双向)的发生率在两组中差异有统计学意义(P0.05)。结论:Danon病患者早期心电图呈特征性改变,V_1、V_2导联的R波振幅明显增高、T波改变在可疑Danon病的早期诊断中可能会提供重要的诊断价值。     

湖南老年医院首例恙虫病多器官受累病例实验室分析

目的对湖南老年医院首例恙虫病可疑病例进行实验室快速诊断及病原分子流行病学分析。方法病人急性期及恢复期血清恙虫病IgM、IgG抗体进行胶体金快速定性及ELISA定量。环介导等温扩增(LAMP)病人血液及焦痂恙虫病东方体56KD 基因及巢氏PCR扩增热休克蛋白基因(groEL)并分析groEL遗传进化关系。结果病人发热期(发病24天)及恢复期(发病32天)血清IgM、IgG抗体定性试验均为阳性,ELISA定量试验双份血清IgM、IgG抗体滴度均达1∶2 560。急性期血液及焦痂DNA样本LAMP检测及巢氏PCR扩增groE阳性。结论本报道为湖南老年医院首例恙虫病病例报道。应加强立克次体病诊断及鉴别诊断。     

快速检测日本血吸虫感染性钉螺LAMP试剂盒的建立及应用

目的构建快速检测日本血吸虫感染性钉螺环介导同温DNA扩增（LAMP）试剂盒,用于血吸虫病流行区感染性钉螺调查。方法采用碱裂解法制备钉螺基因组DNA样品,以缩短检测过程中样品DNA制备时间;对LAMP试剂进行组合优化,采用染料显色方法判定LAMP结果,以减少LAMP检测的操作步骤,避免污染,减少假阳性结果产生;建立批量检测钉螺的LAMP方法,以适用于血吸虫病防治现场大规模钉螺筛查与有感染性钉螺地块的调查。将以上优化技术及试剂整合成快速检测日本血吸虫感染性钉螺LAMP试剂盒。结果制备的日本血吸虫感染性钉螺LAMP检测试剂盒可用于血吸虫流行区现场钉螺快速检测,检测时间可由原来的6h缩短为2h,方法的灵敏性与常规LAMP法相似。该试剂盒能检测出感染后1周钉螺,能对现场钉螺进行大批量检测。结论建立的LAMP试剂盒用于日本血吸虫感染性钉螺检测快速、特异、操作简便,适用于日本血吸虫病流行区感染性钉螺调查。     

环介导等温扩增技术在结核性胸膜炎快速诊断中的应用

目的探讨针对hsp X基因设计引物的环介导等温扩增技术(LAMP)对结核性胸膜炎患者结核分枝杆菌的诊断价值。方法采用LAMP技术对结核分枝杆菌标准株H37Rv的DNA样品进行检测,评价LAMP技术的检测限;同时对8种非结核分枝杆菌菌株及阴沟肠杆菌和大肠埃希菌标准菌株进行鉴定,评价该方法的特异性。对58例结核性胸膜炎患者和32例肺癌患者胸腔积液样本结核分枝杆菌进行检测,评价LAMP技术的临床应用价值。结果 LAMP对倍比稀释的H37Rv的DNA样品检测结果为阳性,检测限为320a M。八种非结核分枝杆菌和2种普通菌菌株检测结果为阴性。LAMP对胸腔积液标本检测的灵敏度是75.8%(44/58),定量PCR为79.3%(46/58),无显著差别(χ2=0.25,P0.05);均显著高于涂片法39.6%(23/58),差异具有统计学意义(χ2=17.39,P0.01)。结论 LAMP技术是一种简单快速有效的等温扩增技术,由于其较高的灵敏度和特异度,可以对结核性胸膜炎患者胸腔积液标本快速鉴定。     

基于cox2基因的细粒棘球绦虫环介导等温扩增检测方法的初步建立

目的建立一种安全、快速、高效的细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)的诊断方法——环介导等温扩增方法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)。方法根据细粒棘球绦虫线粒体细胞色素c氧化酶亚基2(cytochrome c oxidase subunit 2,cox2)基因序列,设计4条LAMP引物,建立LAMP检测方法,采用LAMP法和常规PCR法检测细粒棘球绦虫、泡状带绦虫(Cysticercus tenuicollis)、扩展莫尼茨绦虫(Moniezia expansa)、羊曲子宫绦虫(Thysaniezia ovilla)、中点无卵黄腺绦虫(Avitellina centripunctata)、鞭毛线虫(flagella nematodes)、肝片吸虫(Fasciola hepatica)、多房棘球绦虫(E.multilocularis)和捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)等9种寄生虫的DNA以验证LAMP法的特异性;分别用LAMP法和常规PCR法检测梯度稀释的含cox2基因片段的细粒棘球绦虫标准质粒后,比较两者的敏感性。采用LAMP、PCR和夹心ELISA法检测50份犬粪样,计算细粒棘球绦虫cox2基因的阳性率,评价所建立的LAMP法检测效果。结果LAMP法的特异性验证结果表明,仅在以细粒棘球绦虫DNA为模板的反应体系中出现特异性产物。LAMP法在细粒棘球绦虫标准质粒浓度为16.09 ag/μl时仍可见梯状条带,而常规PCR法仅可检测到浓度为16.9 fg/μl以上的质粒,LAMP法灵敏性是常规PCR法的1 000倍。对50份犬粪中细粒棘球绦虫DNA的检测结果显示,PCR、LAMP和夹心ELISA法检测结果相同,阳性率为8.0%(4/50)。结论基于细粒棘球绦虫线粒体cox2基因的LAMP检测方法操作方便、特异性较强、敏感性较高,适于细粒棘球绦虫感染犬的快速检测。     

环介导同温DNA扩增技术快速检测弓形虫DNA的初步研究

目的 建立一种快速的弓形虫活动性感染检测方法. 方法 根据刚地弓形虫特异性基因B1的基因序列设计一套用于环介导同温DNA扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)的特异性引物,用DNA聚合酶Bst在65 ℃水浴箱中对含有弓形虫基因组DNA的样本进行LAMP扩增,用荧光染料SYBRⅡ染色及琼脂糖凝胶电泳,溴化乙啶染色观察结果.同时进行常规PCR对照试验. 结果 琼脂糖凝胶电泳,溴化乙啶染色发现LAMP扩增产物为大小不等的DNA片段,在扩增产物中加入荧光素SYBRⅡ顔色由紫红色变成绿色荧光,而阴性对照管仍保持紫红色.环介导同温DNA扩增的敏感性为103个弓形虫/ml, 高于常规PCR. 结论 LAMP扩增检测弓形虫DNA的方法已经建立,为发展弓形虫病快速诊断方法奠定了良好的基础.     

环介导等温扩增技术在嗜水气单胞菌检测中的应用

目的 建立环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)对嗜水气单胞菌检测的方法,并用临床标本对该方法进行评价。方法 根据嗜水气单胞菌desA 基因的保守序列设计特异性引物,利用参考质粒评价该检测体系的灵敏度;用30种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌评价该检测体系的特异性;用粪便模拟样本以及临床样本评价该检测体系的临床检测的可行性。结果 LAMP检测体系对嗜水气单胞菌重组质粒的检测灵敏度为1×10²拷贝/反应体系;LAMP检测体系在检测30种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌时未出现假阳性;LAMP检测体系在粪便模拟标本中的检测下限为5 × 10³ CFU/g;通过与qPCR技术相比较,LAMP具有更高的灵敏度以及更优秀的临床标本的检测能力。结论 本研究建立的LAMP方法是首次将LAMP技术运用到了嗜水气单胞菌的检测,所需仪器设备简单,可作为一种快速的筛查方法在临床检验和基层实验室应用。     

慢性肾脏病中法布里病的筛查

<正>法布里病（Fabry disease,FD）是一种多系统、X连锁溶酶体贮积性疾病,由α半乳糖苷酶A(α-Gal A）活性降低或缺乏,导致其代谢底物三己糖酰基鞘脂醇（GL-3）及其去酰化形式Lyso-GL-3不能被代谢而贮积于不同细胞的溶酶体,引起多脏器损害。GL-3主要存在于心血管系统的血管内皮细胞、平滑肌细胞和肾脏足细胞,因此影响这些器官的临床表现占主导地位。FD是一种随年龄增长而恶化的进行性疾病。筛查的意义筛查是检测受疾病潜在或早期症状影响的表面健康患者的主要过程之一,它可以对疾病进行早期诊断和有效治疗,降低医疗成本,提高生活质量。     

环介导等温扩增技术(LAMP)检测棘球绦虫感染犬粪DNA的研究Ⅱ

目的 为有效地控制预防流行区犬科动物的棘球绦虫感染情况,建立一种快速检测棘球绦虫感染犬的粪便DNA检测方法—环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification. LAMP)。方法 针对细粒棘球绦虫线粒体DNA ND2基因6个位点特异性的设计4条LAMP引物,利用LAMP法和普通PCR方法同时检测棘球绦虫、肥胖带绦虫以及犬肠道内的其它寄生虫DNA来验证LAMP方法的特异性;将转入ND2基因片段的质粒作为标准阳性对照,并做梯度稀释后同时用 LAMP 和 PCR 方法进行检测比较两者的敏感性。此外,将采集的46份犬粪便标本提取DNA,分别运用LAMP和犬尸体剖检进行感染犬的初步检测评估。结果 E.g mtDNA ND2基因的LAMP引物能够鉴别多房棘球绦虫和细粒棘球绦虫这两个相近的种属,并不与其它待检寄生虫发生交叉反应,且最低检测限度为4×10¹拷贝(灵敏度比普通PCR高出10³倍)。在初步对46份犬粪便DNA检测结果中 ND2 LAMP 引物显示出较好的灵敏度和特异度,χ²检验结果该方法与犬尸体剖检方法的诊断效果无统计学差异。结论 本研究初步建立了LAMP技术检测细粒棘球绦虫感染犬的新方法,在各项特异度、灵敏度和样本检测中展现出较好的效果。该方法不需要昂贵的仪器设备和繁琐的电泳分析过程,有望成为流行区和基层兽医站细粒棘球绦虫感染犬检测的新方法。     

简单异尖线虫环介导等温扩增(LAMP)鉴定方法的建立和应用

目的 建立快速鉴定简单异尖线虫的环介导等温扩增方法(LAMP). 方法 根据简单异尖线虫ITS保守区域的基因序列设计特异性引物进行LAMP扩增,对反应体系中dNTPs、Mg2+、Betaine和2对引物的浓度,以及反应温度、反应时间等进行优化;在优化后的体系下,将10倍比稀释的简单异尖线虫ITS序列重组质粒进行灵敏性试验;用典型异尖线虫、对盲囊线虫、针蛔线虫对该方法进行特异性试验;并用7份简单异尖线虫样品进行验证. 结果 LAMP的最佳反应体系为0.8 mmoL/L dNTPs、10 mmol/L Mg2+、0.8 mmoL/L Betaine、0.2μmol/L外引物、1.6μmoL/L内引物、8 U Bst DNA聚合酶大片段以及适量的模板,反应温度为62℃,反应时间为60 min;检测简单异尖线虫的灵敏度达到10拷贝/μl,且对典型异尖线虫、对盲囊线虫、针蛔线虫无交叉反应;7份简单异尖线虫样品经LAMP验证均为阳性.结论 LAMP方法灵敏性高、特异性强,并且操作简便、成本低,是鉴定简单异尖线虫的有效手段.