人类血型-H抗原单克隆抗体20D7的研制

用鼠细胞融合杂交瘤技术,获得一株分泌抗H血型抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株-20D7H,为IgM类。已连续培养一年,生物学性状稳定。凡具有H抗原的红细胞与该抗体作用均发生凝集,而与H抗原缺失型:孟买、类孟买血球不发生凝集。20D7细胞分泌单克隆抗体能被O型分泌型唾液抑制;能被O型细胞吸收并释放。该单抗经O型分泌型唾液吸收后,再与红细胞谱细胞反应,这些谱细胞虽经木瓜酶处理和抗球蛋白试验等,均不再出现血球凝集反应。该单抗用血型抗原Syn-sorb试剂检测,所识别的抗原为H_2型。20D7细胞培养上清的抗H血凝效价是1:256,亲和力为5秒,都比市售多克隆标准品质量高。在不同温度下保存,或经反复冻融其效价稳定,可用于临床检测。     

抗血型M、N及抗血型糖蛋白A/B单克隆抗体的制备及其特性鉴定

目的:制备抗血型M、N及抗血型糖蛋白A/B(GPA/GPB)的单克隆抗体(mAb),并进行特性鉴定。方法:用人“O”型血红细胞作为免疫源,免疫BALB/c小鼠。采用淋巴细胞杂交瘤技术制备mAb,用谱红细胞筛选阳性克隆;采用直接、间接血凝试验检测杂交瘤细胞培养上清及腹水中mAb的效价。分别用快速定性试纸和酶处理红细胞检测mAb的Ig亚类及抗原表位。用Western blot鉴定抗GPA/GPB mAb的特异性。结果:获得4株分泌抗M、1株抗N及3株抗GPA/GPB mAb的杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞培养上清mAb的效价介于1×2-4~1×2-8之间,腹水mAb的效价在1×2-7~1×2-12之间。除1株mAb 1C1C9C4为IgM外,其他7株mAb均为IgG。通过杂交瘤细胞培养上清与谱红细胞的反应格局,结合mAb抗原表位的检测,确定4株和1株mAb可分别特异性结合于GPA的M、N抗原表位;另3株mAb 6D7C9、7C9H4和7C9G11与“O”型血红细胞膜的Western blot结果显示,均可结合GPA、GPB蛋白。结论:成功地建立了4株分泌抗M、1株分泌抗N及3株分泌抗GPA/GPB mAb的杂交瘤细胞株,可用于MNSs血型系统的研究及鉴定,并为制备双功能抗体用于病毒、肿瘤疾病的诊断和治疗打下了坚实的基础。     

型特异性、构象依赖性HPV16 L1单克隆抗体的制备与鉴定

目的:研制具有型特异性和构象依赖性的人乳头瘤病毒16主衣壳L1蛋白(HPV16 L1)单克隆抗体(mAb).方法:利用昆虫-杆状病毒系统表达有生物活性的HPV16 L1蛋白.非变性条件下纯化HPV16 L1蛋白,免疫6周龄雌性BALB/c小鼠.末次加强免疫后取其脾细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞融合,应用间接ELISA筛选阳性克隆.非变性Western blot鉴定mAb的型特异性和构象依赖性,细胞免疫组化确定抗体的型特异性.间接ELISA法测定杂交瘤分泌上清及腹水中抗体效价.mAb亚类试剂盒鉴定mAb亚类.结果:获得1株稳定分泌具有型特异性和构象依赖性的HPV16 L1抗体的杂交瘤细胞株,命名为2E3.2E3杂交瘤细胞株细胞培养上清中抗体效价为1:800;小鼠腹水中抗体效价为1:12 800.亚类鉴定结果为IgG1κ.Western blot及细胞免疫组化分析结果显示,2E3 mAb具有型特异性和构象依赖性,只与非变性的HPV16 L1蛋白发生反应,不与HPV18L1、HPV58L1、HPV11L1产生交叉反应.结论:成功制备了型特异性HPV16 L1 mAb,为进一步研究HPV16 L1的抗原表位奠定了基础.     

抗人肺鳞癌单克隆抗体的制备及其特性鉴定

目的:制备和鉴定抗人肺鳞癌单克隆抗体(mAb),为肺癌的早期诊断和靶向治疗提供候选抗体药物及为肺癌抗原的筛选提供工具。方法:用肺癌细胞株YTMLC-90做抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合,间接ELISA和有限稀释法筛选抗体阳性的杂交瘤细胞获得mAb。染色体计数法鉴定杂交瘤细胞,并进行mAb同种型鉴定;对细胞培养上清液和腹水中的mAb采用间接ELISA法进行初步特异性检测及效价测定;采用Western blot法鉴定其与不同组织抗原结合活性;采用免疫组化染色法鉴定其在肺癌组织中的分布。结果:筛选出5株可稳定分泌抗肺鳞癌mAb的杂交瘤细胞株E2、F9、E11、D5和C6,分泌的抗体均为IgG1亚类,κ亚型。C6染色体数目为89～112条,细胞培养上清和腹水效价分别为1∶1 004和1∶104,ELSA和Western blot结果显示其能特异性与肺癌细胞结合,未见与其他高发癌组织和正常组织结合。结论:成功地制备了能够特异识别肺癌组织的mAb。     

抗禽流感病毒M2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备抗禽流感病毒M2蛋白的单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定.方法:利用纯化的融合蛋白GST-M2免疫BALB/c小鼠,然后以GST-M2 和 GST分别作为ELISA抗原进行筛选,选择GST-M2抗原检测强阳性、GST抗原检测阴性的杂交瘤细胞进行克隆,建立能稳定分泌抗AIV M2 mAb的杂交瘤细胞株.mAb的效价采用间接ELISA和琼脂扩散试验(AGP)测定,用夹心ELISA测定Ig亚类,Western blot、抗原捕获ELISA、间接免疫荧光及免疫组化染色法检测 mAb 的特性.结果:得到4株分泌抗禽流感病毒M2蛋白的mAb的杂交瘤细胞株1E1、2F8、4E3 和 5D6,小鼠腹水中抗体的ELISA效价大于210×100、AGP效价大于1:4.抗体亚类鉴定1E1和4E3为IgG2a,2178和5G6为IgG2b.抗原捕获ELISA表明,2F8 wAb能与H5、H9亚型AIV发生特异性反应,而不能与鸡新城疫病毒(NDV)和鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)反应.IFA和免疫组化试验表明,2F8 mAb能够与感染了禽流感病毒的MDCK细胞以及鸡体组织细胞发生特异性结合.结论:本研究获得4株抗禽流感病毒M2蛋白的mAb,其中2F8mAb的效价高、特异性强,可作为检测AIV方法的核心试剂.     

缺失PRD的人FOXP3单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备抗脯氨酸富含区缺失的人FOXP3(△PRD-hFOXP3)的单克隆抗体(mAb),为进一步研究人FOXP3各片段功能奠定基础。方法:以纯化的△PRD-hFOXP3重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞Sp2/0进行常规融合,经筛选及克隆化建立2株分泌抗△PRD-hFOXP3的mAb杂交瘤细胞株;利用核型分析、间接ELISA及Western blot分别鉴定了杂交瘤的细胞核型、抗体的效价与特异性。结果:筛选到2株可稳定分泌抗△PRD-hFOXP3的mAb的细胞株,分别命名为1A2和3A11;2株抗体均为IgG1,腹水经ELISA方法测定效价均可达1∶105;Western blot显示这2株杂交瘤分泌的mAb均可与△PRD-hFOXP3蛋白特异性地结合。结论:成功获得2株能稳定分泌特异性抗△PRD-hFOXP3的mAb的杂交瘤细胞株,可用于人FOXP3的进一步研究及相关试剂的研发等。     

抗人红细胞M型抗原单克隆抗体的研制及初步应用

应用杂交瘤枝术,用人M型RBC免疫的BALB/c小鼠脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞系NS-1融合,筛选出抗M血型抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株13H_2;经过8个多月连续传代培养增殖良好,仍能稳定分泌效价高、特异性强的单克隆抗体。细胞培养上清效价1∶512,亲和力11s。通过将此株单抗用于血型检测、标准红细胞谱细胞的鉴定和在法医上检测血痕,均证明此株单抗识别的只是红细胞上的M血型抗原,与其它血型抗原无关。较多克隆抗M型抗原血清特异性强,效价高,亲和力好,是检测MN血型的良好诊断试剂。     

人红细胞凝集型单抗的制备与鉴定

目的制备人红细胞凝集型单克隆抗体并进行鉴定。方法以3种方式处理人血红细胞,获得红细胞免疫原,分别免疫Balb/c小鼠。应用杂交瘤技术,取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,以凝集实验筛选分泌凝集型抗体的杂交瘤细胞,继而用有限稀释法克隆3次,并对杂交瘤细胞的稳定性进行测定。通过腹水法制备抗体,亲和层析法纯化抗体,对抗体的特性进行研究。结果 3种方式获得的免疫原均能建立有效的免疫反应,低渗加超声破碎法所获得的小鼠血清抗体效价最高。通过融合获得8株可稳定分泌抗体的杂交瘤细胞,其中,4A1分泌的抗体凝集效价最高。抗体可使4种人血型的红细胞凝集,无种属交叉凝集反应。结论有效制备了针对人红细胞的凝集性单抗,为其之后的应用研究奠定了基础。     

抗人硫氧还蛋白-1单克隆抗体的制备与鉴定及初步应用

目的:制备抗硫氧还蛋白-1(TRX-1)的单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定.方法:以原核表达的TRX-1为抗原免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行细胞融合.采用有限稀释法和间接ELISA法克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株,用ELISA检测mAb腹水的效价、相对亲和力和进行表位分析,用Western blot法对mAb的特异性进行鉴定.结果:得到筛选出3株能稳定分泌抗TRX-1的杂交瘤细胞株B6、D5和E3,免疫球蛋白亚类均为IgG>(к),腹水mAb效价均在106以上,3株抗体分别针对不同抗原表位.用mAb建立的竞争抑制ELISA灵敏度达1.22 μg/L.结论:获得3株特异性好、亲和力高、能稳定分泌抗TRX-1的杂交瘤细胞株,为研究TRX-1在人类细胞、血液、组织中的表达及定位提供了可能,并为探索相关炎症、癌症发病机制及新治疗方法提供了强有力的工具.     

抗MRSA-PBP2a转肽酶区蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的:制备和鉴定抗MRSA-PBP2a转肽酶区蛋白单克隆抗体(mAb),初步建立检测PBP2a的乳胶凝集方法。方法:以基因工程重组PBP2a转肽酶区蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠,制备鼠源性mAb,间接ELISA鉴定IgG亚类、腹水效价及亲和常数,Western blot检测mAb的特异性,用所得mAb致敏聚苯乙烯乳胶,建立检测PBP2a的乳胶凝集方法。结果:筛选出2株能稳定分泌抗PBP2a mAb的杂交瘤细胞株F1和F2,免疫球蛋白亚类均为IgG1类;腹水效价为0.5×106~1×106,亲和力常数分别为1.57×108M-1和5.43×109M-1。Western blot显示F1、F2抗体均能有效识别重组PBP2a转肽酶区蛋白及MRSA临床分离株中的天然PBP2a,用mAb F2建立了乳胶凝集法,敏感性达1mg/L。结论:获得2株特异性好、亲和力高、能稳定分泌抗PBP2a mAb的杂交瘤细胞株,为研制MRSA快速鉴定试剂盒奠定了良好的基础。     

抗艰难梭菌A毒素单克隆抗体的制备及特性分析

目的 :制备抗艰难梭菌A毒素的单克隆抗体 (mAb)并鉴定其特性。方法 :用纯化的艰难梭菌A毒素免疫BALB/c小鼠 ,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2 / 0融合 ,采用间接ELISA筛选杂交瘤细胞。用ELISA检测mAb腹水的效价、相对亲和力和进行表位分析 ;用Westernblot检测mAb的特异性。结果 :得到 6株杂交瘤细胞株 ,5C10株细胞分泌的mAb为IgG2a ,4B5和 8A1株细胞分泌的mAb为IgG1,其他 3株细胞mAb (2H7、3E9和 6G8)均分泌IgM。中和试验表明 ,所有的mAb均无中和活性。腹水mAb的效价均在 10 -4以上 ,其中mAb 2H7、6G8、5C10、4B5和 8A1具有共同的表位 ,而mAb 3E9识别的位点与其他 5株不同。mAb 8A1和 4B5的相对亲和力>10 5,其他 4株mAb的相对亲和力 >10 4。在非变性条件下 ,PAGE后Westernblot的结果显示 ,6株mAb均可与相对分子质量 (Mr)为 5 5× 10 4的A毒素产生反应 ;而在变性条件下 ,还原与非还原SDS PAGE后Westernblot均显示 ,6株mAb均可与Mr 为 5× 10 4～ 2 4× 10 4的A毒素产生反应。结论 :6株杂交瘤细胞株均能分泌抗艰难梭菌A毒素的特异性mAb ,为艰难梭菌A毒素的研究提供了有利的工具     

Establishment of hybrid cell lines producing monoclonal antibodies to a synthetic peptide from the E1 region of the hepatitis C virus

We aimed at establishing hybridoma cells secreting monoclonal antibodies (mAbs) against E1 synthetic peptide of HCV. BALB/c mice were immunized with HCV E1-synthetic peptide (GHRMAWDMM) and its spleenocytes were fused with the P3NS1 myeloma cell line. Two highly reactive and specific mAbs (10C7 IgG2b mAb, and 10B2 IgG1 mAb) were generated. The target HCV E1 antigen was identified at approximately 38 kDa in serum of infected individuals. A newly developed ELISA detected the target antigen in 90% of sera from HCV RNA infected individuals with a specificity of 84%. So, the generated mAbs may provide promising probes for serodiagnosis of HCV infection.     

抗rhNDPK-A单克隆抗体的制备及鉴定

目的 :研制抗rhNDPK A (recombinanthumannucleosidediphosphatekinase A)单克隆抗体 (mAb) ,并鉴定其特性。 方法 :以纯化的rhNDPK A免疫BALB/c小鼠 ,采用杂交瘤技术制备抗rhNDPK AmAb ;用免疫双扩散鉴定Ig亚类 ;West ernblot鉴定mAb的特异性 ;间接ELISA检测mAb的腹水效价、亲和常数 ,并进行表位分析。结果 :获得 6株可分泌特异性mAb的抗rhNDPK A的杂交瘤细胞系 2D9、8C7、13E2、15D9、15E3和 2 0D9,Ig亚类均为IgG1;其效价为 1× 10 -4～5× 10 -6;亲和常数为 4 .5× 10 -9～ 2 .8× 10 -10 mol/L ;共有3个抗原表位。结论 :获得抗rhNDPK A的mAb ,为进一步用于临床诊断和实验研究创造了条件     

鼠抗人S100A9 天然蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的:探索以白细胞为免疫原的鼠抗人白细胞天然蛋白单克隆抗体(monoclonal antibodies,mAbs)制备与克隆筛选鉴定方法,制备鼠抗人S100A9 天然蛋白单克隆抗体,并鉴定抗体性质。方法:用健康人外周血白细胞免疫小鼠,利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备mAbs,通过免疫细胞化学法对杂交瘤细胞进行非特异性阳性筛选,有限稀释法进行亚克隆,应用免疫沉淀鄄质谱法进行mAb 特异性鉴定,通过Western blot 进行细胞株筛选,小鼠体内诱生腹水法制备单抗,亲和层析法纯化,ELISA 间接法测定效价及亲和力,Western blot 进行特异性鉴定及交叉反应性分析,免疫组化染色人乳腺癌石蜡切片。结果:获得免疫细胞化学检测阳性多克隆细胞35 孔,分泌鼠抗人S100A9 蛋白单克隆抗体细胞株11 株,优选1 株制备腹水并纯化鉴定抗体,抗体效价为1 3.18 105 ,亚类为IgG1,轻链为kappa 链,抗体纯度达95%以上,亲和力常数3.54 108 L/ mol,与S100A8的交叉反应率为0.12%,与S100A12 和S100A13 几乎无交叉反应,组化染色识别人乳腺癌组织中的S100A9 蛋白。结论:成功制备鼠抗人S100A9 天然蛋白单克隆抗体,该单抗具有高效价、较高亲和力和高特异性,能为其应用于免疫组化检测S100A9蛋白的表达提供依据。     

抗HIV-1核心抗原p24单克隆抗体的制备及特性的初步鉴定

目的 :建立分泌抗HIV 1p2 4单克隆抗体 (mAb)的杂交瘤细胞株 ,并对其特性进行初步鉴定。方法 :以纯化的基因工程制备的p2 4抗原免疫BALB/c小鼠 ,取免疫小鼠的脾细胞与Sp2 /0骨髓瘤细胞融合 ,经HAT、HT选择培养及有限稀释法进行克隆化后 ,用间接ELISA法及Dotblot对其进行筛选和特性鉴定。结果 :筛选到 2株可分泌抗HIV 1p2 4mAb的杂交瘤细胞 ,其腹水效价为 1×10 -5,亲和力为 1.7× 10 4～ 1.8×10 4mol/L ,mAb的Ig亚类均为IgG1。两株mAb与HBcAg、HCVRNA阳性血清及HIVgp4 1等均无交叉反应 ,只与HIV 1p2 4抗原阳性血清产生特异反应。结论 :成功地建立了 2株可分泌抗HIV 1p2 4mAb的杂交瘤细胞 ,为进一步研制HIV 1p2 4抗原的ELISA检测试剂盒奠定了基础     

抗死亡受体-5单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:研制抗DR5单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性。方法:以纯化的DR5免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗DR5mAb。用Ig亚类ELISA试剂盒鉴定抗DR5mAb的亚类。用ELISA法测定sDR5对抗DR5mAb与DR5结合的阻断作用及流式细胞术检测与Jurkat细胞膜上DR5结合的阻断作用,以鉴定mAb的特异性。用间接ELISA法检测腹水mAb的效价、亲和常数并进行表位分析。结果:获得4株可分泌抗DR5mAb的的杂交瘤细胞系YM366EC、YM366ED、YM369F5和YM369E6。4株mAb的Ig亚类均为IgG1;腹水mAb效价为1×10-4~5×10-6;亲和常数为1×109水平,4株mAb可识别2种不同的抗原表位。结论:获得4株抗DR5的mAb,为进一步用于临床诊断和实验研究创造了条件。     

抗人层黏连蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:制备抗人层黏连蛋白(laminin,LN)单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性。方法:以人LN免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗人的mAb;同时采用间接ELISA法柃测mAb的腹水效价及mAb的相对亲和力;采用ELISA法鉴定mAb的Ig亚类、进行表位分析及特异性鉴定。结果:获得4株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞2A3、2C6、3G7和4H2,其腹水mAb 的效价为3.6 × 104～2.1×106;4株mAb的Ig亚类为IgG1,轻链均属κ型;相对亲和力2C6在1012以上,2A3、3G7和4H2在106以上;其中2株与1个表位结合,另2株与另外的1个表位结合。结论:成功地制备出抗人LN的mAb,为进一步研究LN在一些疾病中的作用提供了工具。     

抗CP4-EPSPS单克隆抗体的制备和生物学特性的鉴定

目的制备可用于胶体金快速检测试条的抗CP4-EPSPS(5-enolpyruvlshimimate-3-phosphate synthase)单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性。方法以重组蛋白CP4-EPSPS免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗CP4-EPSPS的mAb,以间接ELISA法和Western blot进行mAb特异性鉴定;同时采用间接ELISA法鉴定mAb的Ig亚类,检测mAb的效价及相对亲和力,并进行mAb结合表位分析。结果获得2株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞(Ⅲ5A3,Ⅲ13A2)。其抗体亚类均为IgG1;腹水效价分别为1∶106和1∶108;相对亲和力Ⅲ5A3在105以上,Ⅲ13A2在106以上。ELISA相加实验结果显示2株mAb识别相同或相近的抗原表位。结论成功地制备出抗CP4-EPSPS的2株mAb,为建立快速特异检测转基因植物(GMO)的实验方法提供了有力的工具。