atRA对C57BL/6N小鼠腭突间充质细胞周期分布的影响及其作用机制

目的：在全反式维A酸（all-trans retinoic acid,atRA）诱导建立腭裂小鼠模型的基础上,检测胎鼠体内胚胎腭突间充质细胞的周期分布,并检测相关周期蛋白的变化情况,为进一步阐明维A酸（retinoic acid,RA）诱导腭裂机制提供新的线索。方法：以atRA建立C57BL/6N胎鼠腭裂模型,采用流式细胞术及免疫组化检测小鼠胚胎腭突间充质细胞的周期分布,通过实时定量RT-PCR和Western印记法检测p21和pRb在胎鼠胚胎腭突间充质中的mRNA和蛋白表达水平。采用SPSS11.0软件包对数据进行单因素方差分析和t检验。结果：流式细胞术及免疫组化检测发现,在小鼠妊娠日（gestation day,GD）第10天时给予atRA,可以诱导胎鼠胚胎腭突间充质细胞在一定妊娠阶段出现G1期细胞周期阻滞,同时也使胎鼠胚胎腭突间充质内p21和pRb的表达水平出现改变。而妊娠第12天（GD12）时给予atRA则无此现象。结论：p21与pRb参与了GD10时给予atRA诱导组胎鼠胚胎腭突间充质细胞G1期阻滞的发生。     

小鼠体外胚胎腭器官培养模型的建立及全反式维甲酸致畸

目的 探讨体外胚胎腭器官培养模型的建立,并研究全反式维甲酸(atRA)诱导形成腭裂的机制.方法 首先建立体外胚胎腭器官培养模型,并在培养体系内添加3.0 μmol/L atRA,对照组加入相应剂量的乙醇溶液.吖啶橙染色观察胚胎腭器官体外培养效果.TUNNEL法检测体胚胎腭细胞凋亡情况,免疫组化检测Smad2/3表达情况.结果 通过静止法体外培养基本可以重复体内腭突接触融合过程,融合率达到82.30%(93/113).对照组的腭突逐步发生接触,并在接触区上皮出现凋亡带,在体外培养24 h的腭突中嵴上皮细胞Smad2/3呈阳性表达.48 h腭突实现融合,腭突中嵴上皮消失,Smad2/3在腭上皮组织内的表达明显下降.而单侧腭突体外培养时,在中嵴上皮区域未出现凋亡现象.实验组3.0 μmol/L atRA可以阻碍腭突中嵴上皮带在接触后出现的凋亡现象,同时Smad2/3在中嵴上皮内的表达水平较对照组明显下降,中嵴上皮带不能消失,双侧腭突间充质无法融合.结论 本研究成功建立胚胎腭器官体外培养模型,证实两侧腭突接触触发了腭突中嵴上皮部位的凋亡现象.同时证实atRA干扰了转化生长因子β/Smad信号系统在腭突中嵴上皮带的消失过程中的调节作用,导致两侧腭突不能融合.     

全反式维甲酸对C57小鼠胚胎腭突Bmpr-1b表达的影响

目的探讨维甲酸对不同时期小鼠胚胎腭突区Bmpr-1b表达的影响。方法采用100mg/kg全反式维甲酸(atRA)在C57BL/6N近交系孕鼠妊娠第10天(GD10)给予灌胃,对照组纯玉米油灌胃。GD13、GD15、GD17时取出胚胎并暴露胎鼠腭突,进行苏木精-伊红(HE)染色,并对3个时期的胚胎腭样本进行免疫组织化学染色,检测Bmpr-1b在不同组内小鼠胚胎腭突组织内的表达。在GD15和GD17时按照上述方法取孕鼠的胚胎腭部组织进行反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Bmpr-1b的mRNA表达。结果 HE染色观测发现实验组腭突没有在中线处融合,形成体积较小的畸形腭突和明显的中缝腭裂,成骨中心区范围明显小于对照组。免疫组织化学检测发现,Bmpr-1b的表达与腭突间充质组织的生长发育呈正相关。GD13～GD17期间实验组小鼠发育中的腭突间充质中Bmpr-1b的阳性指数得分均少于对照组。GD17时期实验组小鼠腭突间充质组织的骨组织支架面积小于对照组。RT-PCR结果显示,GD17时期Bmpr-1b的mRNA表达水平均显著高于GD15。在同一时间点内,对照组的Bmpr-1b的表达水平显著高于实验组。结论对GD10 C57BL/6N母鼠进行atRA灌胃可导致胎鼠腭突区Bmpr-1b的表达水平明显下调,腭突发育不良,腭部骨骼形成进程都受到抑制,最终形成小腭突畸形。     

siRNA抑制TGFβ3诱导小鼠腭裂机制的研究

目的:探讨siRNA抑制TGFβ3诱发腭裂的机制。方法:使用不同剂量(200、400、800pmol)经脂质体LipofectamineTM2000包裹的TGFβ3 StealthTMRNAi于交配后(days post coitum,dpc)12天做孕鼠宫腔注射,等体积生理盐水注射作为空白对照。14dpc时取部分胎鼠腭突,RT-PCR及Western印迹检测腭突中TGFβ3、Smad2、BMP2的表达情况。16dpc时再取部分胎鼠腭突,观察腭突融合情况,免疫组织化学及免疫荧光观察胚鼠腭突的TGFβ3、Smad2、BMP2的表达情况。实验数据均以SPSS13.0软件包进行分析,多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用t检验。结果:宫腔注射800pmol的StealthTMRNAi,可引起TGFβ3基因mRNA和蛋白表达水平明显降低,400pmol组能显著降低Smad2基因的mRNA和蛋白表达水平,但BMP2的表达情况未受明显影响。20%～60%的实验组小鼠胚胎腭突不能融合,形成腭隐裂,与空白对照组相比,其TGFβ3、Smad2的表达量较低,而BMP2的表达未见显著变化。结论:在12dpc给予小鼠宫腔注射TGFβ3 StealthTMRNAi,能有效沉默TGFβ3基因,20%～60%小鼠胚胎形成腭隐裂,同时Smad2基因表达下调,但对BMP2基因表达无明显影响。     

p21Waf1/Cip1蛋白在侧腭突MEE/MES消失过程中的表达及意义

目的:探讨p21 Waf1/Cip1(p21)蛋白与调控p21的相关蛋白Jag1、Jag2、Notch1在正常胎鼠和腭裂模型侧腭突胚胎上皮,特别是胚胎腭中线上皮细胞、胚胎腭中线上皮带中的表达及变化,初步研究p21蛋白在胚胎腭中线上皮细胞、胚胎腭中线上皮带消失过程中的作用。方法:实验组为全反式维A酸(all-trans retinoic acid,at RA)诱导建立的C57BL/6J胎鼠腭裂模型,对照组用同等剂量玉米油喂养孕鼠。在鼠孕期第13.5天(gestation day,GD13.5)、GD14.5、GD15.5、GD16.5解剖取得胎鼠腭突,吖啶橙染色观察腭突形态,免疫组织化学染色检测p21与Jag1、Jag2、Notch1在胎鼠侧腭突上皮的表达。结果:实验组Jag1、Jag2、Notch1、p21在各个时间点均呈阴性表达。在GD14.5、GD15.5,对照组Jag1、Jag2、Notch1、p21在胚胎腭中线上皮带细胞内均有阳性表达。在GD15.5,对照组胚胎腭中线上皮带消失,腭突基本融合;实验组则胚胎腭中线上皮细胞未消退,形成腭裂。在GD16.5,Jag1、Jag2、Notch1在侧腭突所有被覆上皮仍有阳性表达,p21仅在鼻腔侧有微弱阳性表达。结论:在胎鼠侧腭突发育过程中,存在Jag1、Jag2、Notch1、p21特定时空的差异表达。结合前期试验,提示p21参与侧腭突上皮的凋亡与分化,尤其参与了ΔNp63在胚胎腭中线上皮细胞、胚胎腭中线上皮带消失过程中的作用。     

地塞米松和维生素B12对小鼠胚胎腭突发育早期成纤维生长因子10及其2b受体信号的影响

目的观察地塞米松和维生素B12作用后小鼠胚胎腭突成纤维生长因子10（Fgf10）及成纤维生长因子2b受体（Fgfr2b）信号的变化。方法将孕鼠分为致畸组、拮抗组和对照组,各组孕鼠分别注射地塞米松、地塞米松和维生素B12、生理盐水,胚胎12.5和13.5 d处死孕鼠并获取胚胎腭突,采用免疫印迹和BrdU染色的方法检测胚胎腭突Fgf10和Fgfr2b信号和间充质细胞增殖的变化。结果地塞米松作用后,小鼠胚胎腭突Fgf10和Fgfr2b表达显著下调,间充质细胞增殖抑制;维生素B12拮抗后,虽然Fgf10和Fgfr2b表达仍然下调,但间充质细胞增殖恢复。结论地塞米松和维生素B12影响小鼠胚胎腭突Fgf10和Fgfr2b表达和间充质细胞增殖,但二者的变化并不协调一致。     

骨形态发生蛋白受体2在维甲酸诱导腭裂小鼠胚胎腭突中的表达

目的 探讨全反式维甲酸（atRA）对小鼠胚胎腭突中骨形态发生蛋白受体 2（BMPR2）表达的影响。方法 通过 atRA灌胃的方法建立 atRA诱导的小鼠腭裂模型,取妊娠 15 d（GD15）和 17 d的（ GD17）的胚胎腭部进行苏木精-伊红染色,并用免疫组织化学及逆转录聚合酶链式反应技术检测 BMPR2在胚胎腭部的表达。结果 atRA诱导小鼠形成体积较小的畸形腭突和明显的中缝腭裂畸形。 BMPR2在GD15和GD17正常胚胎腭部有高水平的阳性表达,但在腭裂胚胎腭部的表达水平明显减弱。正常胚胎腭部 Bmpr2 mRNA在GD15和GD17的表达水平均明显高于腭裂胚胎（ P<0.05）。结论 atRA可导致小鼠胚胎腭突发育不良形成腭裂,并显著下调 BMPR2表达水平,从而影响腭部发育的正常分子调控过程。     

p63在侧腭突MEE／MES消失过程中的作用机制

目的：探讨p63及其亚型ANp63、TAp63在正常胎鼠和腭裂模型胎鼠侧腭突上皮，特别是在胚胎腭中线上皮（medialedgeepithelial，MEE）／胚胎腭中线上皮带（medialepithelialseam，MES）中的表达及变化情况，阐明p63及其亚型△Np63、TAp63在MEE／MES消失过程中的作用。方法：建立全反式维A酸（all—transretinoicacid，atRA）诱导的胎鼠腭裂模型，实验组在鼠孕期第10天（gestationday，GD10）按100mg，kg给予atRA灌胃，对照组则给予同等剂量的玉米油．分别在GD13．5、GD14．5、GD15．5、GD16．5解剖取得胎鼠的腭突，通过HE染色、扫描电镜进行形态学观察，采用免疫组化方法检测胎鼠侧腭突上皮p63、ANp63及TAp63的表达。结果：在GD14．5，对照组p63和ANp63在侧腭突MEE细胞内基本呈阴性表达．而实验组则呈阳性表达。在GD15．5．对照组MEE／MES消失，腭突基本融合，侧腭突所有被覆上皮基底层细胞再次出现p63和△NF．63阳性表达；实验组MEE／MES则未完全消退，p63和ANp63在消退异常的MEE细胞内仍呈阳性表达。在GD16．5对照组，腭突融合完成，侧腭突被覆上皮基底层细胞p63和△Np63仍呈阳性表达；而实验组未融合，呈腭裂，p63和△Np63在MEE细胞内呈阴性表达。结论：在胎鼠侧腭突上皮发育过程中，存在p63及其亚型ANp63特定时空的差异表达，提示ANp63参与侧腭突上皮的分化调控，尤其是参与了MEE／MES消失过程中的信号调控．     

地塞米松对A系小鼠胚腭突间充质细胞表皮生长因子基因表达的影响

目的:研究地塞米松(DEX)对A系小鼠胚腭突间充质细胞表皮生长因子(EGF)基因mRNA表达的影响。方法：将DEX(10ng/ml)加入培养的A系小鼠胚腭突间充质细胞，并在培养第1、3、5天时收集细胞，提取RNA，应用RT-PCR技术半定量检测腭突问充质细胞EGF基因mRNA的表达水平。结果：DEX可显著促进腭突间充质细胞EGF mRNA的表达，并在加入DEX培养第3天时，这种促进EGF mRNA表达的作用最强。结论：DEX显著促进腭突间充质细胞EGF基因的表达，可能干扰腭突间充质细胞EGF基因的表达而影响了腭发育。     

ARHGAP29调控小鼠腭突间充质细胞增殖能力的研究

目的:探讨ARHGAP29对小鼠腭突间充质细胞增殖能力的影响.方法:免疫组织化学染色确定ARHGAP29在腭突组织中的表达;体外培养GD13.5小鼠腭突间充质细胞,免疫荧光染色鉴定细胞来源;合成3条Arhgap29基因特异性小干扰RNA进行体外沉默实验,利用Real-time PCR和Western blot检测沉默效...     

叶酸拮抗亚甲基四氢叶酸还原酶基因沉默的实验研究

目的:探讨叶酸补充拮抗5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因下调的作用机制.方法:MTT法检测叶酸梯度补充后拮抗MTHFR基因功能下调对细胞增殖的影响;流式细胞仪分析MTHFR基因功能下调补充叶酸前后细胞周期的改变.结果:MTHFR基因功能下调后,不同剂量叶酸补充可以逆转MTHFR基因功能下调对EPM细胞的不良影响,影响程度与补充叶酸的浓度在一定范围内具有剂量依赖性.结论:MTHFR基因是重要的先天性唇腭裂候选基因,叶酸补充可以拮抗MTHFR基因功能下调对胚胎腭突发育的不良影响.     

地塞米松对体外培养A系小鼠腭突腭中嵴上皮融合的影响

目的　研究在腭间充质存在的情况下,地塞米松对腭中嵴上皮细胞分化、转归的影响,以探讨地塞米松引 起腭裂畸形的发病机制。方法　A系小鼠妊娠14 d 8 h在体视显微镜下,解剖分离出A系小鼠胚胎腭突,应用半浸 静式腭突体外培养方法,通过光学显微镜和透射电镜观察在腭突接触融合时,地塞米松对腭中嵴上皮细胞的影响。 结果　地塞米松促进了腭中嵴上皮分化成复层鳞状上皮,加速了腭间充质分化过程,影响了腭突的正常发育,阻碍 腭突融合。结论　地塞米松可能通过加速腭间充质分化和抑制腭中嵴上皮正常转归的双重作用,阻碍腭的正常发 育过程,导致腭裂畸形。     

7-脱氢胆固醇还原酶基因沉默对体外培养小鼠腭突融合的影响

目的 通过RNA干扰抑制7-脱氢胆固醇还原酶（Dhcr7）基因在培养腭突中的表达,研究Dhcr7基因对腭突融合的影响。方法 根据C57BL/6J小鼠Dhcr7基因特异性的siRNA序列构建pAdTrack-CMV-siDhcr7,阳性克隆的pAdTrack-CMV-siDhcr7质粒进行体外重组,筛选出抗卡那霉素的重组腺病毒pAdEasy-1-siDhcr7质粒,酶切后制备腺病毒载体DNA转染胚胎腭突。取妊娠13.5 d的小鼠胚胎腭突共30对随机分为3组,每组10对。正常对照组、空白腺病毒对照组和实验组均用不含胆固醇培养基培养腭突,其中空白腺病毒对照组加入空白腺病毒,实验组加入Dhcr7 siRNA 腺病毒。培养48 h后固定腭突并提取Dhcr7 mRNA和蛋白,采用扫描电子显微镜（SEM）观察腭突融合情况,采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot分析Dhcr7 mRNA和蛋白的含量。结果 SEM检测显示,正常对照组和空白腺病毒对照组在培养48 h时两侧腭突融合,形成连续的上腭;而实验组几乎没有生长,两侧腭突之间有很宽的裂隙。RT-PCR和Western blot检测显示,实验组Dhcr7 mRNA和蛋白表达与正常对照组和空白腺病毒对照组相比均明显减少,其差异有统计学意义（P<0.05）。结论 Dhcr7基因在腭突中的表达下调后,腭突融合失败,说明Dhcr7基因在腭突正常发育融合中起一定的作用。     

A系小鼠胚腭突细胞培养及生物学特性的研究

目的:研究A系小鼠胚愕突上皮与间充质细胞在DMEM/F-12培养基中进行原代和传代联合培养及其生物学特性。方法:采用机械分离及胰蛋白酶消化法，简便、准确、快速地获得高成活率的A系小鼠胚愕突细胞，并通过流式细胞仪、相差显微镜、光镜等观察其DNA及蛋白质合成、细胞骨架及其结构。结果:联合培养的A系小鼠胚鳄突细胞中，愕突上皮及间充质细胞均能较好地生长，光镜下观察见上皮型细胞呈多角型，单层铺路石状排列，细胞骨架为栅栏型或巢穴型;间充质细胞呈梭型，单层漩涡状排列，细胞骨架呈梭型、多平行排列的纤维。流式细胞仪检测见细胞DNA及蛋白质含量较丰富，细胞增殖活跃。结论:A系小鼠胚愕突上皮与间充质细胞联合培养模型能较好地保持体内胚愕突的上皮细胞及间充质细胞细胞成分的基本特征。     

叶酸对小鼠腭突间充质细胞增殖的影响

目的:从细胞水平对维A酸致小鼠腭裂畸形作用和叶酸是否有拮抗维A酸的致畸作用及其机制进行研究。方法:给予孕鼠过量维A酸,诱导胚胎腭裂模型,不完全消化法提取孕期第14天、17天(GD14、17)的胚胎腭突间充质细胞(EPM cells)进行培养并鉴定细胞;采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测加入不同浓度叶酸与未加入叶酸细胞增殖的情况。采用SPSS16.0软件包对数据进行统计学处理。结果:①在GD10、GD12管饲孕鼠50 mg/kg维A酸,可致胎鼠腭裂畸形;②不完全消化法提纯EPM细胞,纯度达到98%;③维A酸导致GD14的EPM细胞增殖受到抑制,20 μg/mL、40 μg/mL浓度叶酸可拮抗这种抑制作用。结论:①过量维A酸可致小鼠腭裂畸形,腭突间充质细胞增殖受抑制是其致畸机制之一;②叶酸可拮抗维A酸对小鼠GD14 EPM细胞增殖的抑制作用。     

腭裂相关基因mcpr1在小鼠腭突发育及腭裂发生中的表达研究

目的检测mcpr1基因的蛋白在正常腭突及小鼠腭裂模型腭突发育中的时空表达模式。方法实验组管饲含全反式维甲酸的植物油诱导建立小鼠腭裂模型,对照组小鼠管饲植物油。2组取胎龄12、13、14、16 d的胎鼠各3只,包埋切片,HE染色观察2组胎鼠腭部发育的形态学变化,免疫组织化学方法观察MCPR1蛋白在2组胎鼠腭突中的表达差异。结果成功建立小鼠腭裂模型。切片HE染色观察发现实验组双侧腭突体积较对照组小,两侧腭突未接触;而对照组腭突融合,腭骨形成。免疫组织化学检查结果表明对照组小鼠胎龄12 d时MCPR1蛋白在腭突上皮细胞呈强阳性表达;而实验组小鼠胎龄12 d时腭突间充质细胞内MCPR1蛋白的表达较强,实验组胎龄16 d小鼠仅在上皮细胞附近的间充质细胞中有阳性表达。同一时间点比较,MCPR1蛋白的表达在实验组均强于对照组（P〈0.05）。结论 MCPR1蛋白的表达变化随腭部发育存在时空表达差异。     

核因子-κB/p65 siRNA介导的舌鳞状细胞癌Tca8113细胞凋亡及相关分子机制

目的：研究下调核因子κB（nuclear factor-kappa B,NF-κB）/p65基因的表达对舌鳞状细胞癌Tca8113细胞凋亡的影响,并探讨Tca8113细胞凋亡可能的分子机制。方法：利用脂质体2000将终浓度为100nmol/L的p65 siRNA转染舌鳞状细胞癌Tca8113细胞,通过RT-PCR检测0、24、48和72hp65 mRNA的表达,并通过流式细胞术检测转染前后细胞凋亡变化,通过Caspase-Glo○R-3/7,-8和-9检测试剂盒分析caspase-3/9活性,用Western blotting技术检测p65、bcl-2和bax蛋白表达。结果：Tca8113细胞转染p65siRNA后,在48hp65 mRNA的相对表达量为0.181±0.028,显著低于未处理组0.595±0.038和对照siRNA组0.613±0.067（P〈0.05）。流式细胞术结果显示,p65 siRNA能促使Tca8113细胞凋亡,其早期凋亡比率为（23.16±1.72）%,显著高于未处理组和对照siRNA组（P〈0.01）。转染48h后,p65和bcl-2蛋白的相对表达水平明显下调,而促凋亡蛋白bax的表达显著上升,并伴随着caspase-3/9活性的显著上升。结论：NF-κB信号途径中的p65亚基可能在舌鳞状细胞癌凋亡中发挥重要作用,该研究有望为舌鳞状细胞癌的分子靶向治疗提供理论依据。