PCR快速筛选质粒cDNA文库方法的建立

目的　建立一种快速、有效地筛选质粒ｃＤＮＡ 文库的方法—ＰＣＲ 法。方法　将质粒ｃＤＮＡ文库重组子进行矩阵排列,然后用特异引物进行ＰＣＲ 逐级筛选以获得目的克隆。结果　经两轮筛选（约１ 周的时间）获得４ 株阳性克隆。结论　ＰＣＲ 矩阵筛库法不仅适用于常规ｃＤＮＡ 克隆的筛选,还适用于筛选较短的ｃＤＮＡ片段,比常规的筛库方法更为灵敏、特异、高效。     

人宫颈癌Hela细胞穿透肽的噬菌体展示技术筛选

目的 细胞穿透肽是近年来发现的具有穿透哺乳动物生物膜功能,并能介导大分子物质跨膜转导的一类小分子肽段.该肽段以其转导效率高,速度快,生物活性好,对细胞损害小等特点,成为药物导向治疗方法 研究领域的热点.本研究目的 在于利用噬菌体展示技术高通量、系统地筛选人宫颈癌Hela细胞的穿透多肽.方法 以Hela细胞作为对象,利用噬菌体随机肽库,采用细胞筛选的方法 ,筛选具有细胞膜穿透作用的多肽.将筛选得到的穿透多肽与增强型绿色荧光(EGFP)融合表达,通过荧光显微观察技术快速对多肽的穿透功能进行验证.结果 通过4轮的噬菌体文库筛选,目的 多肽得到了有效而快速地富集.初步的测序和验证得到了3条具有明显介导融合蛋白内化的短肽序列.结论 成功建立起基于噬菌体随机肽库的细胞穿透肽筛选技术,为肿瘤导向药物载体的研究开发奠定了基础.     

靶标诱导变构解离SELEX技术筛选皮质醇特异核酸适体

目的通过指数富集配体系统进化（SELEX）技术获得皮质醇特异性核酸适体,建立高品质、超敏、易用和稳定的皮质醇检测试剂盒。方法人工合成两端固定序列,中间为35 bp随机序列,生成80 bp长度ssDNA文库,捕获序列固定在磁珠上,文库与其退火组装,皮质醇的特异核酸适体通过我们建立的靶标诱导变构解离SELEX（TISSD-SELEX）技术获得。最后一轮的PCR产物经克隆测序,MegAlign和RNAstructure软件分析其一级和二级结构。实时（real-time）apta-PCR方法分析G12的亲和活性。结果经过12轮筛选后,获得10个皮质醇的核酸适体。序列分析显示,特异核酸适体以高G含量核酸序列为主,软件预测其中8个序列主要以G四联体二级结构为主,候选核酸适体G12显示了可以作为生物探针用于皮质醇检测。结论成功建立TISSD-SELEX技术,获得小分子靶标皮质醇核酸适体。小分子靶标无需将其偶联在固相介质或大分子上,对靶分子结构、性质无特殊要求,因而有望成为小分子靶标核酸适体筛选的通用技术方法。     

噬菌体φ29末端酶大亚基gp16特异RNA适体的筛选

目的：筛选噬菌体φ29末端酶大亚基gpl6特异结合RNA适体。方法：采用SELEX技术，以微扎板为固定介质，在由25个碱基组成的随机区的RNA文库中进行筛选。结果与结论：经9轮筛选获得与gpl6特异结合的RNA适体，结合百分数从未经筛选的14.4％增加到第9轮的37．8％。测序结果大致分为5个家族。其二级结构多呈茎环或凸环结构。抑制性适体的筛选正在进行中。     

利用荧光极化技术在均相系统内建立基于Bcl-2/Bak作用模式的高通量药物筛选体系

目的：利用荧光极化原理，在液相系统内建立基于Bcl-2／Bak相互作用模式的高通量药物筛选体系。方法：在液相系统内建立Bd-2蛋白和多肽的相互作用体系，用光度计检测荧光极化值，分析荧光极化值随蛋白或多肽浓度变化而改变的趋势。结果：对应于Bak蛋白BH3结构域的5FAM标记肽（LP）可与Bcl-2蛋白相互作用，建立了二者相互作用的饱和曲线；非标记竞争性短肽（CP）和LP竞争性地与Bcl-2蛋白结合，而无关肽（NP）则不与Bcl-2相互作用；基于Bcl-2结构筛选到的小分子化合物SC对体系内LP荧光极化值的影响模式与CP相同。结论：在均相系统内初步建立了基于抑制Bcl-2活性进而促进细胞凋亡的药物高通量筛选方法，为实现药物的高通量筛选奠定了基础。     

一种基于双重PCR结合毛细管电泳验证转录组测序结果的新方法

目的：将双重PCR与毛细管电泳技术相结合,建立一种验证转录组测序结果的新方法。方法根据前期进行转录组测序的分析结果,挑选8个差异基因作为靶基因,分别使用双重PCR结合琼脂糖凝胶电泳、双重PCR结合毛细管电泳以及实时荧光定量PCR进行验证,比较三者的验证率。结果双重PCR结合琼脂糖凝胶电泳的验证率为50％;双重PCR结合毛细管电泳和实时荧光定量PCR的验证率均为100％。结论双重PCR结合毛细管电泳可作为转录组测序结果验证的一种有效方法。     

筛选环孢素适体的SELEX技术的建立

运用指数富集的配体系统进化(systematic evolution of ligand by exponential enrichment, SELEX)技术,筛选随机ssDNA文库和针对环孢素(CsA)的特异性适体,为建立检测全血CsA浓度的快速而简便的实验室诊断方法奠定基础.     

SELEX法筛选炭疽芽孢杆菌适配子的研究

目的：利用SELEX（system evolution of ligands by exponential enrichment)体外筛选,找能与炭疽芽孢杆菌芽孢特异结合的寡核苷酸适配子（aptamer),方法：体外合成长度为78个核苷酸的随机DNA库,通过SELEX技术,以炭疽牙直菌疫苗株A．16R的芽孢为靶标进行15轮的筛选,利用生物素－亲和素显色系统判断寡核苷酸与牙孢的结合活性,结果：随着筛选轮数的增加,PCR扩增电泳条带渐单纯,寡核苷酸与芽孢结合后显色,D值提高9倍以上,D值随适配子结合量的增加而递增,结论：已初步筛选到与炭疽芽孢具有亲和力的适配子。     

无胶筛分毛细管电泳与琼脂糖电泳检测ApoB_100基因点突变的比较

目的：无胶筛分毛细管电泳与琼脂糖电泳两种方法检测ＡｐｏＢ１００基因点突变的比较。方法：聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增ＡｐｏＢ１００基因的２６号外显子，ＸｂａⅠ酶切后，分别用常规琼脂糖电泳和无胶筛分毛细管电泳对比检测了４３例标本。结果和结论：毛细管电泳的突变检出率明显高于琼脂糖凝胶电泳，是一种研究基因突变与高脂血症关系更有效的分析手段。     

无胶筛分毛细管电泳与琼脂糖电泳检测ApoB100基因点突变？…

目的：无胶筛分毛细管电泳与琼脂糖电泳两种方法检测ＡｐｏＢ１００基因点突变的比较。方法：聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增ＡｐｏＢ１００基因的２６号外显子,ＢｂａⅠ酶切后,分别用常规琼脂糖电泳和无胶筛分毛细管电泳对比检测了４３例标本。结果和结论：毛细管电泳的突变检出率明显高于琼脂糖凝胶电泳,是一种研究基因突变与高脂血症关系更有效的分析手段。     

计算机辅助检测系统在低剂量CT早期肺癌筛查中的应用研究

目的:评价计算机辅助检测(computed aided detection,CAD)系统在低剂量CT肺癌筛查中的应用价值。方法:120例受检者的胸部低剂量CT图像纳入本研究。采用CAD肺结节自动分析软件(方法 A)、横断面薄层图像结合MIP图像(方法 B)、方法 C(方法 A+B)。方法 B和C由低年资和中年资影像诊断科医师各1名独立完成。以2名高年资影像诊断医师应用方法 C检出的肺结节的一致意见为真结节参照标准。记录检出肺结节的大小、位置和密度,所得数据应用SPSS 16.0软件进行统计学分析。结果:2位高年资医师确定了178个真结节。方法 A检出真结节121个,敏感性为67.98%;低年资和中年资医师应用方法 B检出的真结节数及敏感性分别为97个(54.49%)、142个(79.78%);2位医师应用方法 C检出真结节数及敏感性分别为138个(77.53%)、170个(95.50%)。低年资和中年资医师应用方法 C检出肺结节的敏感性均高于方法B,且差异有统计学意义(P0.001)。低年资和中年资医师应用方法C检出的结节数与参照标准均具有较高的一致性(Kappa=0.718、0.930,P0.001),2位医师之间具有较高的一致性(Kappa=0.784,P0.001)。结论:CAD系统明显提高了影像诊断医师对肺结节的检出能力,具有较高的应用价值。由于CAD系统相对较高的假阴性,在实际工作中尚不能独立应用。     

气相色谱法测定索拉非尼原料中的残留溶剂

目的用毛细管柱气相色谱法建立索拉非尼中5种残留溶剂的测定方法。方法采用DB-Wax（30m×0.45mm,0.85μm）毛细管柱,载气为氮气,FID检测器。采用程序升温,柱温：40℃,保持5min,然后以15℃/min的速率升至200℃。进样口温度：220℃,检测器温度：250℃,分流直接进样,N,N-二甲基甲酰胺为溶剂,丙酮为内标物,内标法计算残留溶剂的含量。结果在考察的浓度范围内呈现良好的线性关系（正庚烷r=0.9995、乙酸乙酯r=0.9993、甲醇r=0.9998、异丙醇r=0.9991、甲苯r=0.9997）,平均回收率为96%～104%,理论塔板数均大于10000,相邻峰的分离度均大于2,精密度、重复性RSD均小于3%。结论本法简单,结果准确,重复性好,适用于索拉非尼中正庚烷、乙酸乙酯、甲醇、异丙醇和甲苯5种残留溶剂的同时检测。     

HPLC测定妇炎平胶囊中苦参碱的含量

目的建立妇炎平胶囊中苦参碱的含量测定方法。方法采用高效液相色谱法,色谱柱为Kromasil C18（250mm×4．6mm,5um）;磷酸盐缓冲液（pH6．8）-乙腈-甲醇（66：17：17）为流动相;检测波长为220nm;流速1．0ml／min。结果在0.400～2．000ug范围内呈良好的线性关系（r=0．9997）,平均回收率为99．6％,RSD为0．42％。结论本法快速简便,结果准确可靠。     

HPLC法测定左卡尼汀氯化钠注射液中左卡尼汀的含量

目的建立测定左卡尼汀氯化钠注射液含量的HPLC法。方法采用Diamonsil C18（200mm×4.6mm,5μm）色谱柱,以庚烷磺酸钠-磷酸盐缓冲液-乙腈（555mg：955ml：55ml）为流动相,检测波长为225nm,流速1ml/min。结果左卡尼汀在200~2000ng范围内线性关系良好（r=0.9998）,平均回收率为97.88%,RSD为1.07%。结论本方法快速、准确,可用于注射用左卡尼汀的含量测定。     

原发性气管肿瘤及肿瘤样病变的多层螺旋CT诊断研究（附29例分析）

目的：探讨原发性气管肿瘤及肿瘤样变的MSCT特征及评价图像后处理技术的应用价值。方法：回顾性总结29例经病理证实的气管肿瘤及肿瘤样变的MSCT表现,并结合多种图像后处理技术,如多平面重建（MPR）、容积再现技术（VR）、CT仿真支气管镜（VB）图像进行分析诊断。结果：根据病灶的MSCT表现分为四种类型：①管腔内窄基底息肉样结节型;②管腔内广基底结节或肿块型;③单纯沿管壁浸润增厚型;④管腔内外肿块型。29例中,良性肿瘤4例CT表现为管腔内圆形或类圆形结节影,轮廓光滑,呈窄基底与管壁相连,局部管壁不增厚。低度恶性肿瘤17例表现为广基底结节或肿块或沿管壁浸润增厚为主。恶性肿瘤5例CT表现为管腔内外肿块,形态不规则,呈分叶状。此外2例炎性假瘤和1例气管硬结病患者亦具有良性病变的CT特征。结论：MSCT薄层横轴位及MPR、VR、VB图像重建技术能很好地显示气管病变的形态特征,定位准确,根据病变不同CT表现亦有助于定性诊断及肿瘤良恶性的鉴别,为临床治疗提供重要及可靠的影像学信息。MSCT是一种诊断准确性高,实用性较强的影像学检查方法。     

利用文本识别及图形显示技术实现微孔板实验数据的快速分析

目的：利用文本识别及图形显示技术建立微孔板实验数据便捷分析的方法。方法：首先利用文本识别软件将常用酶标仪输出到普通纸张上的微孔板（96孔或384孔）实验数据扫描并识别为数值,通过Visual BASIC编程（即宏功能）在PowerPoint中采用极值法利用直线回归从微孔板数据（最小值~最大值）推导出相应的灰度值（0~255）,并在PowerPoint中实现微孔板数据的平面图形显示,或利用插值法通过三次方程内插在MatLab中实现微孔板数据的三维图形显示。结果：通过文本识别及Visual BASIC脚本两级质控可使文本识别的正确率达100%,并且在PowerPoint中实现了微孔板数据的直观平面显示,同时利用插值法在MatLab中实现了微孔板数据的三维图形显示,为批量进行微孔板实验数据的快速处理和分析提供了一种有效方法。其中的文本识别过程具有通用性（亦可用于ELISA数据的快速识别和录入）,而图形显示技术则可结合特定目的灵活使用（例如动态显示微生物或培养细胞的生长曲线等）。结论：该方法能够便捷地实现微孔板实验数据的批量分析,具有一定的实用性和推广价值。     

^99Tc^m标记人表皮生长因子受体2小分子靶向结合蛋白的制备及体外结合特性

目的探讨^99Tc^m标记人表皮生长因子受体2（HER2）小分子靶向结合蛋白ZHER2：342的制备方法,分析其在体外与HER2的结合特洼。方法利用配体交换法进行ZHER2：342的^99Tc^m标记,分析不同质量的SnCl2和NaOH、不同反应时间对标记率的影响,探讨最佳的标记方法。用HPLC测定标记物的标记率与放化纯,并分析其体外稳定性。分析标记物在体外与HER2高表达的人卵巢癌SKOV-3细胞的结合率及滞留率,并与HER2低表达的人乳腺癌MDA—MB-231细胞进行对比。在体外用过量未标记的ZHER2：342对SKOV-3细胞HER2进行封闭后,与未封闭组进行对比,研究该分子探针与HER2结合的特异性。采用单因素方差分析及两样本t检验分析数据。结果^99Tc^m标记ZHER2：342的最佳条件为：反应体系中依次加人ZHER2：342 5μg（1g／L）、NaOH 5μg（1g／L）、SnCl2 8．8μg（1g／L）、^99Tc^mO4^-1 150μl（37MBq）,轻微振荡后室温静置1h.^99Tc^m-ZHER2：342标记率为（98.10±1.73）％,放化纯〉98％;体外稳定性好,与生理盐水及新鲜人血清混合24h后放化纯均〉85％。在体外与HER2高表达的SKOV-3细胞具有较高的结合率,混合后6h最高,结合率为（995±1．02）％,且各时间点细胞结合率均明显高于HER2低表达的MDA—MB-231细胞（5．68～9．88与0．56～2．11;t=-34．50—-13．14,均P〈0．01）。此外,加入过量的未标记的ZHER2：342进行受体封闭时,^99Tc^m-ZHER2：342与SKOV-3细胞的结合率从（9．95±1．02）％降到（2．11±0．27）％（t=-13．14,P〈0．01）。结论^99Tc^m标记ZHER2：342方法简单,标记率高;标记产物体外稳定性好,在体外可与HER2高表达的人卵巢癌SKOV-3细胞特异性结合,是有潜力的HER2靶向分子影像探针。     

人重组阿片受体样受体在CHO细胞稳定表达系统的建立

目的：在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞上稳定转染人重组阿片受体样受体（hORL1）,为体外高通量筛选hORL1受体作用药物及相关药物分子机制研究奠定基础。方法：用脂质体介导法将pcDNA3.1（＋）-hORL1重组质粒稳定转染到缺乏hORL1的CHO细胞中,然后用含G418的选择性培养液进行筛选,挑取耐药克隆;用放射性配体-受体结合实验进一步筛选阳性克隆,对阳性克隆受体亲和力和表达量进行分析,用[35S]GTPγS结合实验分析表达受体的功能。结果与结论：在稳定转染hORL1的克隆细胞中,[3H]伤害感受肽的Kd和Bmax值分别为（0.44±0.21）nmol/L和（0.35±0.06）pmol/mg蛋白。伤害感受肽刺激受体结合[35S]GTPγS的EC50值为3.45nmol/L。以上结果与文献报道的天然hORL1受体的特性相似,说明该细胞株表达的hORL1受体与天然的hORL1受体具有基本一致的生物学特性,证实成功建立了稳定表达人阿片受体样受体的细胞模型。     

肺硬化性血管瘤的CT影像学特点

目的：分析肺硬化性血管瘤（PSH）的CT表现,提高对此病的诊断能力。方法：本组经手术及病理证实的PSH共18例,其中女16例,男2例,年龄19～60岁,平均43岁,所有病例均行CT平扫,其中16例行增强扫描。结果：18例均为孤立肿物,长径1.9～4.2cm,平均长径（2.7±1.3）cm。形状呈圆形5例（27.8%）,卵圆形9例（50%）,边缘浅分叶4例（22.2%）,边缘光滑14例（77.8%）,2例（5.6%）有空气新月征,3例（16.7%）有晕征。2例（11.1%）病灶内有散在小结节状钙化,余病变密度均匀,CT值为28～47HU,平均35HU,16例增强扫描,8例有贴边血管征,1例轻度强化,5例呈明显均匀强化,10例强化不均匀。增强后CT值为60～110HU,平均72HU,最大强化净值为80HU,平均55HU。结论：CT发现中年女性单发圆形或卵圆形肺结节,边缘光滑,可伴有空气半月征及晕影,增强呈明显强化,应考虑到PSH的诊断。     

RP-HPLC法测定通滞苏润江胶囊中没食子酸的含量

目的建立反相高效液相色谱法测定通滞苏润江胶囊中没食子酸的外标定量方法。方法用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;乙腈-含0.1%三乙胺的0.1%磷酸溶液（3∶97）为流动相;检测波长为270nm。结果没食子酸在0.373 2-0.995 2μg范围内呈良好的线性关系,r=0.999 9。结论该方法操作简便,快速,准确,灵敏度高,重现性好,适用于通滞苏润江胶囊中没食子酸的含量测定。