荧光定量PCR法检测HBV感染者精液HBV DNA及其临床意义

乙型肝炎病毒 (HBV )感染的病原诊断及抗病毒疗效判断主要依赖于血清特异性抗原抗体和HBVDNA的检测 ,HBVDNA是复制活动最直接和可靠的指标 ,而血清检查结果常不能反映其精液的感染状况。为了解乙型肝炎患者精液感染情况及传染性 ,采用荧光定量PCR(FQ PCR)技术对 5 7例乙型肝炎患者精液HBVDNA作定量检测 ,现将结果报告如下。材料与方法一、标本来源及处理2 0 0 1年 6月～ 10月我院感染科门诊男性HBV感染者5 7例 ,年龄 2 0～ 4 0岁 ,平均 2 9.3岁。血清HBsAg均阳性。将精液置 37℃温箱内温化 30min。行精液常规分析 ,标本置 - 2…     

荧光定量PCR检测孕妇弓形虫感染的实验观察

应用荧光定量PCR检测自然流产妇女弓形虫感染率为16．3％，正常妊娠对照组感染率为6．5％，差异有统计学意义（P〈0．01）。认为弓形虫感染是导致孕早期自然流产的重要原因。     

定量PCR检测HCMV-DNA结合细胞培养分离病毒法诊断小儿HCMV感染

目的探讨实时荧光定量PCR检测HCMV-DNA结合细胞培养分离病毒,对诊断小儿HCMV感染的价值。方法使用实时荧光定量PCR法检测尿液HCMV-DNA与细胞培养分离尿液HCMV二种方法检测。结果（1）该实时荧光定量PCR检测HCMV-DNA体系,与相关的三种病毒（I型单纯疱疹病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒）无交叉反应,20例正常幼儿皆为阴性。（2）40例临床患儿实时荧光定量PCR检测尿液HCMV-DNA,阳性10例。其中,唇腭裂组阳性6例（6/11）,肺炎组阳性4例（4/29）,两组检出结果比较,差异有显著性（χ2=5.06,P〈0.05）,唇腭裂组阳性检出高于肺炎组。（3）40例临床患儿细胞培养法HCMV分离检测,阳性8例,其中,唇腭裂组阳性4例（4/11）,肺炎组阳性为4例（4/29）,两组检出结果比较,差异无显著性（χ2=1.21,P〉0.05）。（4）40例临床患儿,实时荧光定量PCR检测尿液HCMV-DNA与细胞培养分离病毒结果符合度比较,差异无显著性（χ2=3.33,P〉0.05）。二种方法阳性检出比较,差异无显著性（χ2=0.38,P〉0.05）。结论实时荧光定量PCR检测尿液HCMV-DNA,与细胞培养法分离病毒联合应用可提高HCMV感染诊断阳性率。     

荧光定量PCR检测嗜吞噬细胞无形体

目的采用新型TaqMan-MGB探针建立检测嗜吞噬细胞无形体的实时荧光定量PCR(quantitativereal-timePCR)方法。方法依据gltA基因序列设计嗜吞噬细胞无形体特异引物和探针,以克隆的嗜吞噬细胞无形体gltA基因片段作DNA模板,在荧光定量PCR检测仪(ABI7900HT)上建立实时荧光定量检测方法。结果建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.996);与套式PCR相比较,荧光定量PCR检测的灵敏度是其100倍。用荧光定量PCR检测其它相关立克次体和细菌DNA样本,检出结果几乎为0;对荧光定量PCR检测重复性进行分析,变异系数(CV)批内和批间误差在0~2.1%之间,证明该荧光定量PCR具有种特异性和良好的重复性。用荧光定量PCR检测体疑染嗜吞噬细胞无形体的10份蜱和30份小鼠脾脏标本,结果与套式PCR检测结果有密切相关性,但是定量PCR检测敏感性和准确率均高于套式PCR。结论本研究建立的检测嗜吞噬细胞无形体的实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性,特别适合检出样本中微量嗜吞噬细胞无形体。     

多重实时荧光定量PCR对下呼吸道感染病原体检测分析

目的比较多重实时荧光定量PCR(multiplex real-time polymerase chain reaction, MRT-PCR)和间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay, IFA)对成人呼吸道病毒及非典型病原体检测结果。 方法收集2014年1月至2017年12月间呼吸内科210例成人呼吸道感染的标本,采用MRT-PCR检测8种常见呼吸道病原体,同时应用IFA检测血清8种病原体IgM抗体,并全部进行PCR及测序分析,比较两种方法的特异性及敏感性,评估MRT-PCR的临床应用价值。 结果210例下呼吸道感染标本经MRT-PCR和IFA检测,阳性率分别为58.57%和38.10%,混合感染率分别为7.62%和4.76%。两种方法的灵敏度分别为94.74%和35.96%,特异度分别为84.38%和59.38%。灵敏度和特异度差异有统计学意义(P<0.05)。 结论与IFA相比,MRT-PCR灵敏度、特异度好,检测性能优于IFA。     

实时荧光定量PCR检测直肠癌XPC基因表达

目的 检测核苷酸切除修复（NER）基因XPC在直肠癌及直肠组织中的表达。方法采用实时定量荧光PCR法,检测16例手术后切除的新鲜直肠癌组织及6例癌旁直肠组织中XPC基因表达水平。结果直肠癌中XPC基因水平明显高于正常直肠组织。结论高表达的XPC基因直接在NER早期发挥着重要作用,在一定程度上导致直肠癌患者对化疗药物的敏感性降低。     

实时荧光定量PCR法检测日本血吸虫

目的 运用实时荧光定量PCR法检测日本血吸虫。 方法 根据日本血吸虫18 S小亚基单位核糖体核酸（18S rRNA）基因设计特异性引物,PCR扩增出1 450 bp序列,经TA克隆后转入大肠埃希菌DH5α,提取重组质粒,鉴定后作为模板制作荧光定量PCR 标准曲线。方法重现性评价,用初始循环数（Ct,拷贝/反应）进行标准差分析,并计算变异系数（CV）。 结果 制作的标准曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.998 7。方法重现性评价,在1.05×107～1.05×103个拷贝范围内,对应的Ct平均值分别为17.55、20.93、24.32、27.59和30.95;CV值分别为1.31%、1.53%、0.90%、1.85%及0.90%,在重复性试验中试验间数据平均变异系数为1.27%,无非特异性扩增。 在试验检测范围内（Ct≤30.95）,可检测的日本血吸虫基因组浓度为6.15 pg,3 h内完成。 结论 运用荧光定量PCR方法检测日本血吸虫DNA,快速、灵敏、特异性高。     

尖锐湿疣患者荧光定量PCR检测结果分析

目的探讨尖锐湿疣患者疣体中人乳头瘤病毒(HPV)分型、基因含量及其意义。方法采用荧光定量PCR技术(FQ-PCR)检测尖锐湿疣患者疣体中HPV-DNA含量及其型别。结果169例尖锐湿疣患者经FQ-PCR检测后168例(99.41%)阳性,其中HPV6/11型阳性150例(88.76%),平均1.2×107拷贝/ml;HPV16/18型阳性13例(7.69%),平均2.3×106拷贝/ml;HPV6/11和HPV16/18型同时阳性5例(2.96%),平均1.0×107拷贝/ml;4型均阴性1例(0.59%),定量为0×10拷贝/ml。结论HPV6/11型是尖锐湿疣发病的主要型别,尖锐湿疣患者疣体中HPV-DNA含量与其是否复发无明显关系,FQ-PCR可作为尖锐湿疣早期诊断的指标。     

HBV DNA荧光定量PCR检测的临床意义

乙型肝炎病（ＨＢＶ）毒核酸定量测定方法经过近几年的长足发展,迄今已有数种检测设备和商业化试剂盒面市,其中Ｒｏｃｈｅ公司新开发的Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ荧光定量ＰＣＲ仪和深圳匹基公司推出的ＨＢＶ荧光定量ＰＣＲ（ＦＱ－ＰＣＲ）检测法的临床应用鲜见报道。我们采用上述设备和试剂定量测定ＨＢＶ ＤＮＡ并探讨其临床意义。 一、资料和方法 １．研究对象：我所２００１年１月至６月收治的门诊和住院患者共１５３例。 ２血清标志物检测：由本所临床检验室测定。ＨＢＶ标志检测采用军事医学科学院四环公司研制的试剂盒,ＨＢＶＤＮＡ…     

荧光定量PCR方法应用于布鲁杆菌检测研究概述

布鲁杆菌病(简称布病)是布鲁杆菌属细菌侵入机体后引起人或动物多个器官系统发生病理损伤的人兽共患传染病.根据宿主倾向性和危害性,布鲁杆菌主要分为马耳他布鲁杆菌(B.melitensis)、流产布鲁杆菌(B.abortus)、猪布鲁杆菌(B.suis)、绵羊附睾布鲁杆菌(B.ovis)、犬布鲁杆菌(B.canis)和沙林鼠布鲁杆菌(B.neotomae)6个菌种.     

荧光定量PCR与常规PCR检测血清乙型肝炎病毒的对比观察

目的 探讨荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）与常规聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒（HBV）敏感性的差异。方法 对105份乙型肝炎患者血清用两种方法检测HBV。结果 常规PCR对10^6-10^9,10^5-10^4和≤10^3copy/ml的血清检测结果有统计学差异。常规PCR检测10^6-10^9copy/ml的血清假阴性率仅5.0%,10^4-10^5copy/ml时假阴性率达36.8%,10^3copy/ml主要为阴性结果，但有6例为阳性或弱阳性（24.0%)。结论 常规PCR对≤10^5copy/ml的血清有较高的假阴性率，比FQ-PCR灵敏度低10-100倍，弱阳性标本FQ-PCR检测也可能出现假阴性结果。     

SYBR Green荧光定量粪检PCR法检测日本血吸虫感染的敏感性研究

目的建立快速、敏感、特异的检测日本血吸虫感染的SYBR Green荧光定量PCR法,准确评估其敏感性。方法将计数的日本血吸虫虫卵掺人健康水牛粪样中,制备人工阳性粪样。采用改良QIAamp DNA Stool Kit粪样DNA提取方法,提取人工阳性粪样DNA,进行SYBR Green荧光定量PCR,建立Ct值与粪样中克粪虫卵数（EPG）的关系;提取单独（不与牛阴性粪样混合）日本血吸虫虫卵DNA与虫卵生理盐水冲洗液DNA,行定量PCR检测,以对本方法进行严格质量控制。结果每200mg粪样仅含1个虫卵时,荧光定量PCR仍呈阳性,人工阳性粪样EPG的对数与PCR的Ct值存在线性关系。结论SYBR Green荧光定量粪检PCR法检测日本血吸虫虫卵DNA敏感性高,EPG对数与PCR的Ct值存在线性关系。     

实时荧光定量PCR检测恙虫病东方体

目的建立检测恙虫病东方体的实时荧光定量PCR(quantitative real-ti me PCR)方法。方法根据恙虫病东方体56kD外膜蛋白基因序列设计引物和探针,以克隆的56kD基因片段作DNA模板,建立实时荧光定量PCR检测方法。结果建立的荧光定量PCR标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.999)。荧光定量PCR检测恙虫病东方体的灵敏度约为套式PCR的100倍,并且具有良好的重复性。用该定量PCR检测其它相关立克次体和病原菌DNA样本,检出结果均为0。用该定量PCR检测恙虫病东方体实验感染小鼠的血、脾脏、肺脏、肝脏标本,结果脾脏中东方体出现最早和检出量最多,肝脏和肺脏次之。血中的恙虫病东方体量较低。结论本研究建立的荧光定量PCR方法具有很高的特异性和敏感性,可用于东方体感染早期血样本的快速检测作恙虫病感染早期诊断,并且可以定量分析评价恙虫病东方体感染的程度。     

探讨荧光定量PCR在结核菌检测中的应用

目的探讨荧光定量PCR技术在检测临床标本中结核分枝杆菌的应用价值。方法通过荧光定量PCR技术鉴定350株临床分离株,进行结核分枝杆菌的菌种鉴定和定量分析,同时进行抗酸染色和培养法。结果荧光定量PCR、染色和培养法阳性检出率分别为38．8％（128／330）,21．8％（72／330）,29．7％（98／330）,提高阳性检出率（涂阴）16．97％（56／330）,菌种鉴定特异性实验符合率为100％。结论荧光定量PCR技术是一种快速、敏感、特异性强的结核分枝杆菌辅助诊断方法。     

沙眼衣原体荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立沙眼衣原体实时荧光定量PCR检测技术,以期用于沙眼衣原体的感染检测。方法针对沙眼衣原体ompA基因序列保守区域设计引物和TaqMan探针,构建标准质粒并制作标准曲线,建立沙眼衣原体实时荧光定量检测方法,通过对人型支原体等的检测评价方法的特异性。结果建立的沙眼衣原体荧光定量PCR体系能特异性检测沙眼衣原体,与人型支原体、解脲脲原体、淋球菌、大肠埃希菌EDL933、金黄色葡萄球菌无交叉反应;标准曲线在3.9×109～3.9×103 copies/μl之间线性关系良好(r2=0.99);方法的灵敏度高,检测最低拷贝数为3.9copies/μl;组内及组间变异系数均5%。结论建立的检测沙眼衣原体实时定量PCR方法特异、灵敏,可用于沙眼衣原体感染的早期筛查和临床快速诊断。     

荧光定量PCR检测异尖线虫类病原体

目的运用荧光定量PCR法检测异尖线虫类病原体。方法于鱼类内脏中检获6种异尖线虫类幼虫:抹香鲸异尖线虫、简单异尖线虫、内弯对盲囊线虫、带鱼针蛔线虫、灰海鳗对盲囊线虫和台湾海峡鱼类中一优势种对盲囊线虫。提取各虫体DNA,PCR扩增ITS-2序列,测序并进行数据库比对。依据测序结果设计特异引物,常规PCR检验引物特异性。将ITS-2序列扩增产物回收、纯化后经T克隆转入大肠埃希菌DH5α,提取重组质粒,鉴定后作为标准品模板建立荧光定量PCR标准曲线,并做敏感性和重复性试验。结果构建的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数均在0.998以上。重复性实验中,6种虫体对应的变异系数(cv)最小值为0.18%,最大值为2.80%,试验间平均cv最小值为0.55%,最大值为1.94%,无非特异性扩增,溶解曲线的特异性和重复性良好。灵敏度实验中,可检出的最低模板浓度为1×102拷贝/μl,比常规PCR灵敏度高100倍。结论初步建立了SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测异尖线虫类病原体的方法 。     

检测贝氏柯克斯体的实时荧光定量PCR

目的采用新型TaqMan-MGB探针建立检测贝氏柯克斯体的实时荧光定量PCR(real-timequantitativePCR)方法。方法根据贝氏柯克斯体特异的23SrRNA插入基因序列设计引物和探针,以克隆的23SrRNA插入基因片段作DNA模板,在荧光定量PCR检测仪(ABI7900型)上建立实时荧光定量检测方法。结果建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.997);与套式PCR相比较,荧光定量PCR检测敏感性是其100倍。用荧光定量PCR检测其它相关立克次体,检出结果均为0。用荧光定量PCR检测贝氏柯克斯体感染的小鼠脾脏标本,脾脏中贝氏柯克斯体的感染量与感染过程具有相关性。结论本研究建立的检测贝氏柯克斯体的实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性,特别适合样本中微量贝氏柯克斯体DNA的检测,其定量检测可用于动物实验中的贝氏柯克斯体感染程度的分析。     

汉坦病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的通过建立汉坦病毒实时荧光定量PCR检测方法,快速准确地检测汉坦病毒。方法根据汉滩型和汉城型汉坦病S片段基因的序列分别设计特异性探针引物,使用含有目的基因片段的重组质粒标准品绘制标准曲线,建立检测两型汉坦病毒的实时荧光定量PCR方法。结果建立的检测方法特异性良好,与其他常见病原不发生交叉反应;最低检测限为101copies/μl,灵敏度高;不同梯度定量模板的拷贝数的对数值与Ct值之间线性关系表达式分别为y=-3.4607x＋40.988（HTN）,y=-3.5307x＋39.356（SEO）,扩增效率分别为92.2%（HTN）和92.6%（SEO）,相关系数R2分别为0.9968（HTN）和0.9997（SEO）,呈良好的线性关系,且重复性好。结论建立的实时荧光定量PCR灵敏度高,重复性好,可用于汉坦病毒的快速检测,并可初步辨别汉滩型和汉城型汉坦病毒,对肾综合征出血热的病原早期诊断和流行病学调查有较好的应用价值。