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1.
目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A对硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)启动子转录的激活作用.方法以我室构建的丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式调节基因的cDNA文库抑制性消减杂交(SSH)筛选结果及基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定TXNRD1的启动子区域(TXNRD1p),聚合酶链反应(PCR)扩增TXNRD1p,克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-TXNRD1p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与pcDNA3.1(-)-NS5A共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果pCAT3-TXNRD1p和pcDNA3.1(-)-NS5A瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-Basic空载体的9.6倍,pCAT3-TXNRD1p的2.1倍.本实验进一步验证了我室利用SSH技术及基因表达谱技术发现的HCV NS5A蛋白反式激活TXNRD1基因转录作用的结果.结论我室克隆的TXNRD1启动子有顺式激活下游基因的活性;HCV的NS5A蛋白具有对TXNRD1基因启动子的反式激活作用. 相似文献
2.
目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)对新生多肽相关复合物(NACA)启动子转录活性的影响。方法以我室构建的能够表达NS5A蛋白的pcDNA3.1(-)-NS5A质粒和含有NACA基因启动子的PCAT3-NACA报告基因质粒共转染HepG2细胞系设为实验组,同时PCAT3-NACA单独转染HepG2细胞系作为对照组。用酶联免疫吸附法检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果pCAT3-NACA单独转染HepG2细胞的CAT酶表达活性与pCAT3-NACA和pcDNA3.1(-)-NS5A共转染组HepG2细胞的CAT酶表达活性比较,共转染组A值下降了79.3%。结论HCV NS5A能够抑制NACA启动子的活性,对NACA的表达具有下调作用。 相似文献
3.
目的探讨HBV表面抗原基因启动子ⅠDNA结合蛋白1(SBP1)对诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因启动子转录的凋节作用。方法利用生物信息学技术确定iNOS基因的启动子区域(iNOSp)和3个缺失突变体的基因序列,PCR分别扩增iNOSp和3个缺失体的基因序列,分别克隆至报告基因表达载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-iNOSp报告载体;以构建的这4种报告质粒分别转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2,用ELISA检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与构建的真核表达载体pcDNA3.1(-)-HBVSBP1共转染HepG2细胞系,用ELISA检测CAT的表达活性。结果成功获得iNOS基因启动子和3个缺失突变体的正确克隆,其中pl—iNOSp和pcDNA3.1(-)-HBVSBP1瞬时共转染HepG2细胞时,iNOS启动子的转录活性上升1.54倍;p3-iNOSp启动子和pcDNA3.1(-)-HBVSBP1瞬时共转染HepG2细胞时,iNOS启动子的转录活性下降31.3%,重复实验得到相似结果。结论克隆的新基因SBP1在细胞内的表达,对iNOS基因反式激活iNOS启动子的转录活性具有明显的双向凋节作用,双向调节的部位是iNOS启动子的核因子(NF)-IL6、A-激活域结合位点(AABS)和NF-κB这3个结合位点。 相似文献
4.
目的 探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心(core)蛋白对诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因启动子转录的激活作用。方法 利用生物信息学技术确定iNOS基因的启动子区域(iNOSp),聚合酶链反应(PCR)扩增iNOSp的DNA,克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-iNOSp报告载体;以该质粒转染正常人肝细胞LO2,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与HCV核心蛋白的真核表达载体pcDNA3.1(-)-core共转染LO2细胞,用ELISA法检测CAT的表达活性。结果 成功获得iNOS基因启动子的正确克隆,pCAT3-iNOSp和pcDNA3.1(-)core瞬时共转染LO2细胞时,报告基因表达载体中的SV40病毒的即刻早期启动子的转录活性明显提高,CAT表达活性是pCAT3-Basic空载体的11倍,是pCAT3-iNOSp的6倍,重复试验得到了相似的结果。结论 成功克隆的iNOS启动子有转录活性;HCV核心蛋白具有对iNOS基因启动子的反式激活作用。HCV核心蛋白在细胞内的表达对于iNOS基因反式激活在HCV感染相关的慢性肝脏疾病的发病过程中具有重要意义。 相似文献
5.
新基因NS5ATP4表达产物下调细胞周期素B2基因表达的研究 总被引:2,自引:0,他引:2
目的探讨新基因NS5ATP4表达产物对细胞周期素B2(cyclin B2)基因启动子转录的调节作用.方法根据文献确定细胞周期素B2的启动子区域,聚合酶链反应(PCR)扩增细胞周期素基因因启动子(B2p),克隆至真核报告基因表达载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-cyclin B2p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测报告基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性:并与pcDNA3.1(-)-NS5ATP4共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果成功获得细胞周期素B2启动子的正确克隆.pCAT3-cyclinB2p和pcDNA3.1(-)-NS5ATP4共转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-Basic空载体的10倍,pCAT3-cyclin B2p的0.14倍.结论本文克隆的细胞周期素B2启动子有顺式调节下游基因表达的活性,NS5ATP4对细胞周期素B2基因的转录具有下调作用. 相似文献
6.
目的:阐明丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A(NS5A)反式激活基因NS5A-TP9表达的调控机制。方法:选取NS5A-TP9基因翻译起始密码子ATG上游661bp的基因组DNA序列作为启动子序列,应用聚合酶链反应(PCR)技术,以肝母细胞瘤细胞系HepG2基因组DNA为模板,扩增该启动子DNA片段,将其克隆至pCAT3中,构建pCAT3-NS5A-TP9-promoter报告基因表达载体,以该质粒转染HepG2细胞,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测报告基因编码产物氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果:发现质粒pCAT3-NS5A-TP9-promoter具有指导报告基因CAT转录表达的启动子活性,CAT的吸光度(A值)是缺乏启动子序列对照质粒pCAT3的13.9倍。结论:本研究克隆的启动子DNA序列具有指导下游基因转录的启动子活性,这一结果为研究新基因NS5A-TP9转录表达的调节机制,进一步阐明丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A的作用机制奠定了基础。 相似文献
7.
目的 探讨乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)对S100钙结合蛋白A11(calgizzarin S100A11)启动子转录的激活作用。方法 以我室构建的HBeAg反式调节基因的cDNA文库抑制性消减杂交(SSH)筛选结果为基础,利用生物信息学技术确定S100A11的启动子区域(S100A11-P),聚合酶链反应(PCR)扩增S100A11-P,克隆至真核报告载体PCAT3中,构建pCAT3-S100-p报告载体,以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性,并与pcDNA3.1(-)-HBeAg共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性。结果pCAT3-S100-P在HepG2细胞中能够指导CAT的表达;共转染实验中pCAT3-S100-P-pcDNA3.1(-)-HBeAg组CAT的表达活性是pCAT3-S100-P组的6.1倍。结论 我室克隆的S100A11启动子有顺式激活下游基因的活性,HBeAg具有对S100A11的反式激活作用。本实验进一步验证了我室利用SSH技术研究HBeAg反式激活作用的结果。 相似文献
8.
目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原主蛋白(SHBs)对硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)启动子转录的激活作用.方法 以我室构建的SHBs基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定TXNRD1的启动子区域(TXNRD1p),聚合酶链反应(PCR)扩增TXNRD1p,克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-TXNRD1p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与pcDNA3.1(-)-SHBs共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果 pCAT3-TXNRD1p与pcDNA3.1(-)-SHBs瞬时共转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-TXNRD1p的7.4倍,是pCAT3-TXNRD1p与pcDNA3.1(-)-empty共转染的2.5倍.结论 我室克隆的TXNRD1启动子有顺式激活下游基因的活性;HBV的SHBs蛋白可以上调TXNRD1的启动子活性. 相似文献
9.
目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)对硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)启动子转录的激活作用.方法利用生物信息学技术确定TXNRD1的启动子区域(TXNRD1p),聚合酶链反应(PCR)技术扩增TXNRD1p,克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-TXNRD1p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测报告基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与HBxAg真核表达载体pcDNA3.1(-)-X共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果结果表明,pCAT3-TXNRD1p和pcDNA3.1(-)-X瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-Basic空载体的19.3倍,pCAT3-TXNRD1p的3.9倍.结论克隆的TXNRD1启动子有顺式激活下游基因的活性;HBxAg具有对TXNRDl的反式激活作用. 相似文献
10.
目的:探讨人肝再生增强因子(hALR)对硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)启动子转录的激活作用。方法:以我室构建的hALR的cDNA基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定TXNRD1的启动子区域(TXNRD1p).聚合酶链反应(PCR)扩增TXNRD1p,亚克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-TXNRD1P报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测报告基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与表达载体pcDNA3.1(-)-ALR共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性。结果:pCAT3-TXNRD1p和pcDNA3.1(-)-ALR瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-Basic空载体的10.4倍,pcAT3-TXNRD1p的2.1倍。本实验进一步验证了我室利用基因表达谱技术研究ALR蛋白反式激活作用的结果。结论:我室克隆的TXNRD1启动子有顺式激活下游基因的活性;hALR蛋白具有对TXNRD1的反式激活作用。 相似文献
11.
肝再生增强因子对细胞周期素依赖性激酶1基因表达的影响 总被引:1,自引:0,他引:1
目的研究人肝再生增强因子(ALR)对细胞周期素依赖性激酶1启动子(CDK1p)转录调节的作用,探讨ALR的生物学作用机制。方法根据GenBank中CDK1p序列的分析设计引物,应用聚合酶链反应(PCR)扩增人CDK1基因启动子基因序列,并克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建CDK1启动子报告基因表达载体pCAT3-CDK1p,以该质粒转染HepG2细胞系,并同时与pcDNA3.1(-)-ALR共转染HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测报告基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果 pCAT3-CDK1p组CAT表达活性明显高于pCAT3-basic组,差异有统计学意义,pCAT3-CDK1p与pcDNA3.1(-)-ALR共转染组的CAT表达活性明显低于pCAT3-CDK1p组,差异有统计学意义。结论 CDK1启动子有顺式激活下游基因的活性,ALR对CDK1基因有下调作用。 相似文献
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乙型肝炎病毒前-S2蛋白下调诱导型一氧化氮合酶基因启动子的转录活性 总被引:1,自引:0,他引:1
目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)前-S2(pre-S2)蛋白对诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因启动子转录的调节作用。方法利用生物信息学技术确定iNOS基因的启动子区域(iNOSp)和3个缺失突变体的基因序列,聚合酶链反应(PCR)分别扩增iNOSp和3个缺失突变体的基因序列,分别克隆至报告基因表达载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-iNOSp载体;以构建的这4种报告基因表达载体,分别转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与真核表达载体pcDNA3.1(-)-HBV pre-S2共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性。结果成功获得iNOS基因启动子和3个缺失突变体的正确克隆,p1-iNOSp、p3-iNOSp启动子和pcDNA3.1 (-)-HBV pre-S2瞬时共转染HepG2细胞时,iNOS启动子的转录活性明显下降,HBV pre-S2蛋白对p1- iNOSp、p3-iNOSp表达活性的抑制率分别是54.7%和79.5%,p2-iNOSp、p4-iNOSp与pcDNA3.1(-)-HBV pre-S2共转染HepG2细胞后,HBV pre-S2蛋白对p2-iNOSp、p4-iNOSp表达活性没有明显的调节作用。重复试验得到了相似的结果。结论HBV pre-S2蛋白在细胞内的表达对iNOS启动子的转录活性具有明显的下调作用。 相似文献
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目的研究丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白6号结合蛋白基因(Hcbp6)序列表达的调控机制。方法根据软件对启动子的预测,选取翻译起始密码子ATG上游3256bp及下游180bp的DNA序列,分成5段活性区域,分别以聚合酶链反应技术(PCR),肝母细胞瘤细胞系HePG2基因组DNA为模板,扩增该启动子DNA片段,将其克隆至PCAT3中,构建PCAT3-Hcbp6-P报告基因表达载体,将该质粒分别转染HePG2,NIH3T3细胞,用酶联免疫吸附法检测报告基因编码产物氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果发现质粒pCAT3-Hcbp6-1066p和pCAT3-Hcbp6-240p能够指导CAT的表达,其平均吸光度值(4)是PCAT3-basic对照质粒的3.1倍和6.4倍。结论本研究克隆的启动子DNA序列具有转录活性,这一结果为研究HcbP6的调节机制,进一步阐明HCV核心蛋白的作用机制奠定了基础。 相似文献
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目的 探讨人肝再生增强因子(ALR)对钙结合蛋白S100A11启动子(S100A11p)转录的调节作用。方法 利用生物信息学技术确定S100A11P区域,聚合酶链反应(PCR)扩增S100A11p,克隆至真核报告载体pCAT3中,构建PCAT3-S100A11P报告载体;以该质粒转染HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测报告基因编码产物氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。并以人ALR的真核表达载体pcDNA3.1(-)-ALR共转染的HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测CAT的表达活性。结果pCAT3-S100A11p在HepG2细胞中具有CAT的表达活性;以pcDNA3.1(-)-ALR和pCAT3-S100A11p共转染HepG2细胞,CAT表达活性是单独转染细胞组pCAT3-S100A11p的0.42倍。结论 所克隆的S100A11启动子有启动子的转录活性,ALR的转基因表达具有对S100A11基因的下调作用。 相似文献