重组人canstatin真核载体的构建及鉴定

目的 构荧光蛋白和canstatin融合蛋白基因的真核表达载体pEGFP-N1／canstatin，以深化研究血管生成抑制剂canstatin的生物学性能和用于肿瘤生物治疗的可能性。方法 提取人胚肝总RNA，RT—PCR扩增canstatin基因片断，T—A克隆到pGEM—T中，从pGEM—T／canstatin克隆载体中，将人canstatin cDNA亚克隆入真核表达载体pEGFP-N1，构建含人canstatin cDNA的重组质粒pEGFP-N1／canstatin，通过酶切鉴定出重组体并测序分析。结果 成功构建pEGFP—N1／canstatin真核表达载体，双酶切及测序鉴定显示canstatin基因片断正确插入载体，与Genebank中报道的序列一致。结论 pEGFP—N1／canstatin真核载体的构建为进一步进行canstatin蛋白表达和活性研究以及canstatin用于基因治疗奠定了基础。     

重组人canstatin表达产物的抗肿瘤活性鉴定

 目的　正确构建人canstatin原核表达载体 ,诱导表达重组人canstatin融合蛋白 ,并对其活性鉴定。方法　将人canstatincDNA亚克隆入 pQE30 ,构建重组质粒 pQE30 canstatin ;转化M 15 [pREP4] 中 ,IPTG诱导表达 ,纯化回收表达产物 ,复性后用Lewis肺癌移植瘤模型对其活性鉴定。结果　成功构建人canstatincDNA表达载体 ,纯化回收 ,获得高纯度canstatin重组蛋白。纯化产物在体内能抑制Lewis肺癌移植瘤血管的生成 ,从而抑制肿瘤生长和转移 ,抑瘤率 (% )为 6 0 .0 % ,转移抑制率 (% )为 74 .3%。结论　 (1)成功构建了原核表达载体 pQE30 canstatin。 (2 )重组人canstatin融合蛋白在原核表达系统中高水平表达 ,并获得高纯度canstatin重组蛋白。 (3)重组canstatin融合蛋白可抑制Lewis肺癌移植瘤血管的生成 ,从而抑制肿瘤生长和转移活性。     

人canstatin基因的克隆及其真核载体的构建

[目的]克隆人canstatin基因,构建并鉴定其真核表达载体pSecTag2/canstatin.[方法]采用RT-PCR方法从中国人胎盘脐带组织中扩增canstatin cDNA,T-A克隆到pUCm-T载体中,酶切后将人canstatin cDNA亚克隆入pSecTag2,构建真核表达载体pSecTag2/canstatin,重组质粒经限制性内切酶鉴定并进行测序分析.[结果]人canstatin基因片断正确插入载体,与Genebank中报道的序列一致.[结论]pSecTag2/canstatin真核载体的构建为进一步进行canstatin蛋白表达、活性鉴定和作用机制研究以及canstatin用于基因治疗奠定了基础.     

人血管抑制因子Vasostatin短片段（120 180 aa）的克隆、表达及功能研究

目的：利用基因工程技术，克隆并表达人血管抑制因子Vasostatin120180 aa功能区片段，探讨其对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管抑制的作用。方法：采用PCR技术扩增人血管抑制因子Vasostatin120180 aa功能区基因，并利用pQE30原核表达系统诱导表达Vasostatin120180aa，经镍金属螯合层析法纯化，通过鸡胚绒毛尿囊膜实验验证其抑制新生血管生成的作用。结果：PCR扩增出了长度为180 bp的Vasostatin120180 aa功能区基因，后经pQE30原核表达系统表达并纯化出Vasostatin120180 aa，SDSPAGE显现一条约8 kD的阳性条带，Vasostatin120180aa可显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜新生血管的生成。结论：原核表达的Vasostatin120180 aa功能区片段具有生物学活性，可明显抑制鸡胚绒毛尿囊膜新生血管的生成，在一定范围内呈量效依赖性。     

血管生成抑素的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:在原核系统中表达并纯化人血管生成抑素（angiostatin）,制备鼠抗人血管生成抑素多克隆抗体。方法:设计引物扩增angiostatin的cDNA,然后亚克隆入原核表达载体pQE,并转化入大肠杆菌BL21中诱导表达并纯化,再用纯化的人血管生成抑素免疫小鼠并制备多抗。结果:通过重组质粒酶切和测序分析等方法,筛选出重组阳性克隆,转化入大肠杆菌BL21中诱导表达并纯化成功,再利用纯化的人血管生成抑素制备成功鼠抗人血管生成抑素多克隆抗体。结论:表达产物及多克隆抗体为下阶段深入研究提供了重要的实验材料。     

血管发生抑制因子 restin的克隆表达及其抗血管活性的初步研究

目的：克隆人血管发生抑制因子restin(hRs)，在E.coli中融合表达，并测定其抗血管活性。方法：用RT-PCR法从中国人胎盘组织中扩增hRs基因，重组人pGEM-T载体中并测定鉴定，构建原核表达载体pGEX-hRS，表达融合蛋白GST-hRS。融合蛋白经亲和纯化及凝血酶切后，采用鸡胚绒毛膜尿囊膜试验检测其抗血管生成活性。结果：RT-PCR产物为564bp，测序结果与Genbank中胶原XV(COL15A1)的C端序列一致，但在21位（TCT→TCG）引起丝氨酸的同义突变，82位（ACA→TCA）引起丝氨酸突变为苏氨酸。诱导表达的人GST-hRS融合蛋白经凝血酶切后，分子量为20kD，具有抗血管生成活性。结论：hRS的成功克隆、表达为抗血管生成治疗实体瘤的研究奠定了实验基础 。     

血管内皮生长因子部分多肽抗血管生成的研究

目的：观察血管内皮生长因子（VEGF）部分多肽（3－4外显子）抗血管生成的作用。方法：抽提LoVo细胞总RNA,进行RT－PCR,克隆VEGF部分多肽cDNA,构建VEGF部分多肽原核表达载体,用限制性酶切和DNA测序进行鉴定,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）分析表达产物,表达产物经亲和层析纯化后,以人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和鸡胚尿囊膜（CAM）血管测定其生物学活性。结果：表达产物以可溶性分子形成存在于菌体中,具有良好的抗原性和特异性,并具有抑制HUVEC增殖及CAM血管形成的活性。结论：VEGF部分多肽具有竞争抑制血管生成的功能,在肿瘤生物靶向治疗中具有一定潜在的价值。     

重组IFN-α2a与HSV-tk/GCV系统协同作用增强对于卵巢癌细胞系SKOV3杀伤作用的体外研究

目的：在原核系统中表达并纯化人血管生成抑素（angiostatin),制备鼠抗人血管生成抑素多克隆抗体。方法：设计引物扩增angiostatin的cDNA,然后亚克隆入原核表达载体pQE,并转化入大肠杆菌BL21中诱导表达并纯化,再用纯化的人血管生成抑素免疫小鼠并制备多抗。结果：通过重组质粒酶切和测序分析等方法,筛选出重组阳性克隆,转化入大肠杆菌BL21中诱导表在并纯化成功,再利用纯化的人血管生成抑素制备成功鼠抗人血管生成抑素多克隆抗体。结论：表达产物及多克隆抗体为下阶段深入研究提供了重要的实验材料。     

人血管抑制因子Vasostatin短片段(120-180 aa)的克隆、表达及功能研究

目的:利用基因工程技术,克隆并表达人血管抑制因子Vasostatin120-180aa功能区片段,探讨其对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管抑制的作用.方法:采用PCR技术扩增人血管抑制因子Vasostatin120-180aa功能区基因,并利用pQE30原核表达系统诱导表达Vasostatin120-180aa,经镍金属螯合层析法纯化,通过鸡胚绒毛尿囊膜实验验证其抑制新生血管生成的作用.结果:PCR扩增出了长度为180 bp的Vasostatin120-180aa功能区基因,后经pQE30原核表达系统表达并纯化出Vasostatin120-180aa,SDS-PAGE显现一条约8 kD的阳性条带,Vasostatin120-180aa可显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜新生血管的生成.结论:原核表达的Vasosta-tin120-180aa功能区片段具有生物学活性,可明显抑制鸡胚绒毛尿囊膜新生血管的生成,在一定范围内呈量效依赖性.     

血管内皮抑素的原核表达及多克隆抗体的制备

背景与目的：本实验拟在原核系统中表达并纯化人血管内皮抑素（endostatin),制备鼠抗人血管内皮抑素多克隆抗体。方法：设计引物扩增内皮抑素的cDNA,重组人原核表达载体并在大肠杆菌中诱导表达,应用纯化产物免疫3只小鼠。结果：构建成制备人血管内皮抑素的原核表达载体pQE-30,并转化入大肠杆菌BL21中得到表达产物,经Ni亲和层析柱纯化后进行SDS-PAGE鉴定结果为单一组分。利用纯化的人血管内皮抑素成功制备高滴度的鼠抗人血管内皮抑素多克隆抗体,并由Western blot分析证实。结论：高纯度表达产物及多克隆抗体的制得为今后的研究提供了素材。     

人睾丸肿瘤抗原MAGE-E1基因的克隆测序及在原核系统中的表达

目的：扩增及克隆人的MAGE-E1基因并利用大肠杆菌进行表达。方法：从人胶质瘤细胞系BT-325中提取总RNA，用RT-PCR从中扩增出MAGE-E1基因片段。将MAGE-E1基因片段插入载体pGEM-T easy中，经全自动序列分析仪测序正确后，再克隆至表达载体pGEX-4T-2中，构建重组表达载体pGEX-4T-2-MAGE-E1，并转化大肠杆菌进行表达。结果：1mmol／L．异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导5h，MAGE-E1蛋白表达即达高峰，SDS-PAGE及凝胶密度扫描分析表明，表达出Mr约41000大小的蛋白，占菌体总蛋白的35％。结论：成功扩增、克隆MAGE-E1基因，并在大肠杆菌中得到稳定高效表达。     

小鼠内皮抑素基因的克隆、表达及其抑瘤效应研究

克隆小鼠内皮抑素（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）基因,检测其表达蛋白的生物学活性,应用该蛋白治疗大鼠Ｃ６脑胶质瘤。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ法,从小鼠肝组织克隆ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ基因,重组入ｐＵＣ１９,测序后构建非融合表达载体ｐＢＶ２２０－ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ,使其在ＤＨ５α内经温度诱导表达,纯经ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ蛋白并用鸡胚绒毛膜尿囊膜实验和内皮细胞抑制实验检测其活性,经荷Ｃ６胶质瘤大鼠皮下注射该蛋白,     

重组天花粉蛋白的原核表达、纯化及其对 宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

 目的克隆天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)的cDNA, 构建原核表达TCS的质粒,从表达菌中分离纯化重组天花粉蛋白（rTCS）后,分析rTCS和nTCS（天然天花粉蛋白）对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。方法RT-PCR技术从新鲜栝楼叶片中扩增TCS cDNA,测序鉴定后克隆入表达载体pET-28a(+) 并转化入BL21(DE3)细胞。IPTG诱导表达后,用金属镍螯合层析法纯化rTCS蛋白, MTT法分别检测rTCS 和nTCS处理24、48和72h对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。结果1. 成功克隆获得TCS的cDNA并构建 pET-28a (+)-TCS原核表达质粒;该cDNA的碱基序列与基因库中注册的序列99.4%同源;2.在BL21(DE3)菌中,IPTG可诱导重组TCS蛋白表达,且表达的TCS主要以包含体的形式存在。在一定的时间范围内（0～8h）;rTCS的表达水平与诱导时间正相关;3.用Ni-NTA树脂亲和层析法,从诱导表达菌中获得了高纯度的重组TCS蛋白;4. MTT法分析表明,rTCS和nTCS均对HeLa宫颈癌细胞的生长具有抑制作用。在0～100μg/ml的浓度范围内,随着药物浓度的增加及作用时间的延长,rTCS和nTCS对HeLa细胞的生长抑制率逐渐增大,且各组之间差异有统计学意义（P﹤0.05）;rTCS的IC₅₀小于nTCS。结论本实验克隆了TCS的cDNA,构建了表达载体pET-28a (+)-TCS,并成功地在E.coli中原核表达和纯化出重组TCS蛋白,发现纯化的rTCS和nTCS对HeLa细胞的生长都有明显抑制作用,并且rTCS的细胞毒性小于nTCS。     

重组人内皮抑素的纯化及抗肿瘤活性研究

[目的]从高效表达的基因工程菌中纯化重组人内皮抑素,对其抗肿瘤活性进行研究.[方法]经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,重组人内皮抑素在大肠杆菌基因工程菌中以包涵体形式高效表达.通过凝胶层析纯化重组内皮抑素蛋白.应用鸡胚绒毛尿囊膜实验(CAM),肺癌细胞MTT试验及细胞迁移抑制实验,裸鼠皮下移植喉癌抑瘤实验、病理组织切片、免疫组化指标的测定等检测研究重组人内皮抑素的抗肿瘤活性.[结果]重组内皮抑素的复性率可达40%.重组内皮抑素在体外直接抑制肺癌细胞的增殖及迁移.用药21天,对裸鼠皮下移植喉癌的抑瘤率达到40.66%,HE染色、免疫组化及CAM实验表明其对肿瘤组织新生血管的生成有较强的抑制作用.[结论]重组人内皮抑素具有抑制肿瘤组织新生血管生成和直接抑制肿瘤细胞生长和迁移的双重抗肿瘤活性.     

宫颈癌组织HPV58的检测及其E7基因的克隆和表达

目的　检测宫颈癌组织中人乳头瘤病毒 5 8型 (HPV5 8)并克隆表达其E7基因。方法采用GP5 /GP6 引物系统扩增 5 8例宫颈癌组织 ,将荧光偏振 (FP)检测技术与模板指导的末端延伸反应 (TDI FP)结合 ,检测HPV5 8,确定HPV5 8感染阳性宫颈癌组织。用特异引物从HPV5 8阳性标本中扩增HPV5 8早期表达蛋白E7基因 ,将其连入pGEM TEasy载体 ,获得克隆重组体HPV5 8E7 pGEM T ,并测序验证。将E7基因与pRSET A融合表达载体连接 ,获得E7表达重组体pRSET 5 8E7,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,并用IPTG诱导表达。结果　 5 8例宫颈癌标本中 ,HPV5 8阳性 10例 ,占 5 2例HPV阳性标本的 19.2 %。从其中扩增到了HPV5 8E7基因并构建了其克隆和表达重组体。其表达重组体经IPTG诱导后 ,可表达Mr16× 10 3 的HPV5 8E7His6融合蛋白 ,表达量占菌体蛋白的 30 %。结论　欧美国家少见的高危HPV5 8在中国陕西人宫颈癌组织中并不少见。HPV5 8E7重组表达体可在大肠杆菌中高效表达 ,为HPV5 8相关肿瘤诊断试剂及疫苗的研制奠定了初步基础     

人热休克蛋白70的原核表达和纯化的实验研究

目的在大肠杆菌中表达人源性热休克蛋白70基因并纯化表达产物。方法以人HSP0 cDNA为模板,采用PCR方法进行扩增,将PCR产物克隆到表达载体pET30a上,将重组质粒pET30a-HSP70转化大肠杆菌BL21上,经IPTG诱导后,表达产物进行SDS-PAGE及Western blot验证并纯化。结果应用PCR方法扩增出约1900bp的目的片段;经酶切鉴定和DNA测序证实,HSP70基因成功地克隆到原核表达载体pET-30a上;转入重组质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE,发现在分子量约为70kD处有蛋白表达,Western blot证实其为目的蛋白,纯化后的HSP70纯度达到90%以上。结论在大肠杆菌中已成功地表达了HSP70蛋白并且经过纯化,为研究HSP70的结构、功能及临床应用提供了必要条件。     

细胞凋亡相关新基因Apr-3的一个转录剪接体的克隆、初步表达及纯化

目的克隆Apr-3基因的一个转录剪接体,进行原核表达,并进行初步纯化。方法培养HL-60细胞,提取HL-60细胞总RNA,应用RT-PCR获取Apr-3编码区cDNA序列的前366bp,将该cDNA与质粒pcDNA3.0连接,构建克隆载体,将其转化E.coliDH5α,进行测序,与GenBank中登录序列比对,结果正确后将该cDNA与质粒pET28a连接,构建原核表达载体,转化大肠杆菌,诱导表达获得Apr-3蛋白。结果对测序结果进行序列分析,与GenBank中登录的Apr-3编码区完全一致。Apr-3融合蛋白主要以包涵体形式存在。结论成功构建了Apr-3的原核表达载体,获得了较纯的Apr-3融合蛋白。     

人截短型线粒体凋亡诱导因子蛋白的克隆、表达及诱导肝癌细胞凋亡的活性鉴定

背景与目的:线粒体在细胞凋亡中扮演关键的角色,线粒体凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF)是定位于线粒体中的一种重要的凋亡蛋白,对线粒体蛋白质的研究可深入阐明线粒体在凋亡中的作用.本研究的目的在于克隆、表达重组的人截短型AIF,并对其诱导肿瘤细胞核凋亡的生物学活性进行鉴定.方法:采用RT-PCR技术从人肝癌细胞SMMC-7721中扩增出剪切掉线粒体定位信号的人AIF基因片段,并按阅读框克隆到原核表达载体pET32a( )中.进行酶切与测序鉴定后,以构建的正确重组质粒pET32a-AIF转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下表达AIF蛋白,表达产物用SDS-PAGE和Western blot检测;采用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白;采用凝胶滞后实验(EMSA)与Hoechst 33258染色检测AIF蛋白的生物学活性.结果:获得了去掉线粒体定位信号的AIF基因,并克隆到pET32a( )载体中,经酶切与测序鉴定完全正确.此重组质粒转化人大肠杆菌,经IPTG诱导后,在大肠杆菌中可表达相对分子质量约Mr 70 000的目的蛋白;表达量约占菌体蛋白总量的11%,表达的目的蛋白与抗His标签抗体与抗人的AIF蛋白具有良好的反应性;纯化后,AIF的纯度达到95%.经EMSA与Hoechst 33258染色实验证实:获得的AIF蛋白具有良好地与DNA结合并可诱导肿瘤细胞核凋亡的能力,凋亡率为37%.结论:人AIF基因在PET表达系统中得到有效表达:蛋白复性后能有效地在体外与DNA结合,并可诱导细胞凋亡.