微型双功能抗体介导人T细胞杀伤耐药实体瘤细胞

目的 探讨抗P-糖蛋白（P-gP）／抗CD3微型双功能抗体介导人T细胞杀伤耐药实体瘤细胞的作用。方法 采用抗E-tag亲和层析柱分离纯化抗P-gp／抗CD3微型双功能抗体,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行鉴定;采用^51Cr释放实验,测定抗P-gP／抗CD3微型双功能抗体介导的人T细胞体外靶向杀伤活性;采用多药耐药（MDR）细胞系KB／MDR、敏感KB细胞裸鼠移植瘤模型,测定该微型双功能抗体介导的体内靶向杀伤活性。结果 纯化的抗P-gp／抗CD3微型双功能抗体,在相对分子质量28000和26000处各有1条蛋白带。在抗P-gp／抗CD3微型双功能抗体存在的情况下,激活的T淋巴细胞能够裂解KB／MDR细胞,且随着效靶比的增高而增高。抗P-gp／抗CD3微型双功能抗体联合人T淋巴细胞能有效抑制KB／MDR细胞裸鼠移植瘤的生长,而对敏感KB细胞移植瘤的生长无抑制作用。结论 抗P-gP／抗CD3微型双功能抗体在体内外均能介导人T淋巴细胞杀伤表达P-gP抗原的KB／MDR细胞,是有望用于耐药实体瘤临床治疗的双特异性抗体。     

抗CD3/抗CD20偶联物的制备及其介导激活T细胞杀伤活性研究

目的：研究抗CD3/抗CD20抗体偶联物介导的激活T细胞杀伤活性。方法：通过SPDP偶联，经分子筛层析法纯化得到抗CD3/抗CD20抗体偶联物，并用FACS和玫瑰花环试验鉴定纯化产物；采用^51Cr释放试验测定该抗体偶联物介导的体外靶向杀伤活性。结果：纯化的抗CD3/抗CD20抗体偶联物具有与jurkat(CD3^ )和Daudi细胞（CD20^ )的结合活性，且能同时将Jurkat和Daudi细胞结合形成玫瑰花环；在体外能介导激活的T细胞杀伤Daudi细胞。结论：抗CD3/抗CD20抗体偶联物体外能介导激活的T细胞杀伤表达CD20抗原的肿瘤细胞，为B细胞恶性肿瘤临床治疗提供实验依据。     

人B淋巴瘤裸鼠腹腔内移植模型

目的建立人B淋巴瘤裸鼠移植瘤腹腔模型,主要是为了研究抗CD20/CD3双功能抗体对人B淋巴瘤的治疗作用.方法采用5周龄左右的雌性BALB/c-nu,腹腔注射pristane0.2ml/只2次,经60Co照射,3天后腹腔接种人B淋巴瘤细胞株(Raji)1×107/只,并于第2天随机分组用预先激活的T细胞加入双功能抗体进行治疗,每周腹腔给药1次,共4次.结果人B淋巴瘤细胞株(Raji)裸鼠腹腔移植,接种38只均获成功,成瘤率100%.染色体检查证明为人类染色体特征,病理形态学观察,瘤块主要分布于腹腔、肠系膜、淋巴结、贴近肠壁处,并且CD19、CD20,HLA-DR阳性率达95%以上,对照组40天时全部死亡,治疗组存活至100天处死.结论成功地建立了人类B淋巴瘤裸鼠移植瘤腹腔模型,经过实验证明,抗CD3/抗CD20双功能抗体有很好地抑瘤作用.     

抗EGFR／抗CD3双功能抗体对胃癌荷瘤小鼠的免疫治疗研究

目的 通过抗EGFR／抗CD3双功能抗体（EGFR/CD3 BsAb）治疗SGC7901胃癌细胞移植瘤小鼠模型,初步验证该抗体在体内对胃癌细胞的杀伤能力。方法 采取化学偶联法合成的EGFR/CD3 BsAb联合人外周血淋巴细胞（PBLS）经尾静脉给药注入荷SGC7901胃癌细胞移植瘤小鼠体内。实验裸鼠随机分为抗EGFR单抗联合PBLS组（抗EGFR组）、抗CD3单抗联合PBLS组（抗CD3组）、EGFR／CD3 BsAb联合PBLS组（EGFR/CD3 BsAb组）和空白对照组（生理盐水组）。治疗后检测并比较加药各组对胃癌细胞的杀伤能力。结果 EGFR／CD3 BsAb成功制备,分子量为43kD。EGFR／CD3 BsAb组裸鼠的肿瘤抑制率为(57.2±8.6）％,显著高于抗EGFR组的（38.5±6.1）％和抗CD3组的（6.9±7.6）％（P＜0.05）;治疗结束时EGFR／CD3 BsAb组的瘤重为（517.1±45.4）mg,显著低于抗EGFR组的（737.4±54.3）mg和抗CD3组的（1097.9±167.7）mg（P＜0.05）。各组移植瘤组织EGFR免疫组化染色均为强阳性。EGFR／CD3 BsAb组裸鼠肿瘤组织CD3免疫组化染色可见部分细胞呈阳性。透射电镜观察显示,EGFR／CD3 BsAb组和抗EGFR组可见肿瘤坏死。结论 EGFR／CD3 BsAb在体内条件下可能对胃癌有治疗作用。     

抗CD3/抗CD19微型双功能抗体的构建、表达及活性测定

背景与目的:微型双功能抗体是基因工程抗体的-种形式,它具有两个抗原结合位点,可选择性募集效应细胞到靶细胞周围,介导特异性杀伤作用.本实验构建抗CD3/抗CD19微型双功能抗体(diabody)载体,表达纯化后测定其生物学活性.方法:用重叠PCR(overlap PCR)和PCR方法,构建抗CD3/抗CD19 diabody 载体,转化感受态大肠埃希菌进行原核表达.表达产物经抗His-tag亲和层析柱分离纯化,12%SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定.应用间接免疫荧光和竞争性免疫荧光结合流式细胞分析技术(PACS)检测生物学活性.结果:基因重组质粒经测序证实序列正确.抗CD3/抗CD19 diabody能够在原核表达系统中进行可溶性表达.12%SDS-PAGE显示28×103和26×103各有-条带,Western blot在28×103显示有条带,与预期相符.表达产物经纯化定量可达5 mg/L.FACS检测抗CD3/抗CD19 diabody可与CD19+ Raji细胞和CD3+ Jurkat细胞特异结合,并能竞争性抑制HIT3a和HIT19a与上述细胞的结合活性.结论:本实验成功构建了抗CD3/抗CD19 diabody,并且能够进行可溶性表达,可与CD19+ Raji细胞和CD3+ Jurkat细胞特异结合,为以后的抗体功能实验奠定了基础.     

抗CD_3/抗CD_(20)微型双功能抗体裸鼠体内分布研究

目的：建立裸鼠皮下人Ｂ－淋巴细胞移植瘤模型,研究抗ＣＤ３／ＣＤ２０。微型双功能抗体在裸鼠体内的分布。方法：采用亲和层析分离纯化本室构建的抗 ＣＤ３／抗 ＣＤ２０微型双功能抗体可溶性表达产物,并用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、分子排阻层析和 ＦＡＣＳ鉴定纯化产物;采用５周龄左右的雌性 ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ,经４Ｇｙ照射、皮下接种 Ｒａｊｉ细胞建立裸鼠皮下人Ｂ－淋巴细胞移植瘤模型,并于眼底静脉丛注射１２５Ｉ标记的抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０微型双功能抗体,测定各组织中１２５Ｉ的分布。结果：雌性ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ经照射、皮下接种１×１０～７～３×１０～７Ｒａｊｉ细胞／只,６～１４天均开始出现移植瘤,移植瘤细胞膜表面标记与 Ｒａｊｉ相同,且在２４小时时肿瘤部位１２５ Ｉ的分布明显低于心、肝、肾、脾,其比值分别为０．０８、０．１９、０．０６和０．５１,而 ７２小时时肿瘤部位１２５Ｉ的分布则高于心、肝、肾、脾,其比值分别为 ２．３２、９．４６、８．２４和９．５０。结论：抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０微型双功能抗体能在裸鼠皮下人Ｂ－淋巴细胞移植瘤部位富集,是一个有望用于Ｂ细胞恶性肿瘤临床治疗的双特异性抗体。     

双功能抗体抗CD3/抗CD19介导T细胞对靶细胞的杀伤作用

背景与目的:双功能抗体有2个抗原结合臂,一方面具有肿瘤相关抗原,另一方面具有和免疫效应细胞表面分子标记结合的能力,并能有效地使效应细胞靶向杀火肿瘤细胞的作用.本实验探讨抗CD3/抗CD19双功能抗体介导T细胞杀伤靶细胞的作用.方法:利用非放射性荧光染料Calcein-AM进行抗体介导的体外特异性杀伤活性榆测,Ficoll-Hypaque法分离外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL),流式细胞术从中分选T淋巴细胞及CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞作为效应细胞.首先以Raji细胞为靶细胞,按不同效靶比,不同抗体浓度分组,以PBS、抗CD3scFv+、抗CD3scFv抗体及非相关抗体抗CD3/抗PGP为对照,另设CD19-K562细胞为非相关靶细胞组,比较双功能抗体介导特异性体外杀伤活性.取上述杀伤实验效靶比25:1,抗体浓度500 ng/mL各组,ELISA法比较激活的T细胞分泌IL-2的量,Real-time PcR法检测T细胞因子IL-3、IFN-γ、TNF-α激活后的表达变化.结果:体外介导T细胞杀伤靶细胞Raji的效果比对照组明显增强(P＜0.05),激活T细胞分泌IL-2、IL-3、IFN-γ及TNF-α的表达均明显高于对照组.结论:双功能抗体抗CD3/抗CD19在体外介导T细胞对靶细胞具有较强的杀伤作用.     

肝癌细胞凋亡-抗HBx/抗CD3双功能抗体介导细胞毒性T细胞对靶细胞的杀伤

研究发现，针对效应细胞毒性T淋巴细胞[CTL]表面受体[TCB／CD3复合物]与肿瘤相关抗原的双功能抗体能有效地介导CTL对靶肿瘤细胞的杀伤。为此，我们通过细胞融合法经流式细胞仪[FACS]无菌分选建立了抗HBx／抗CD3二次杂交瘤，应用该二次杂交瘤所分泌的双特性单克隆抗体[BsAb]介导CTL在LTNM4裸鼠人肝癌模型进行了实验性治疗研究。     

靶向4-1BBL 和CD3 双信号的协同抗肿瘤作用机制研究*

目的:探讨人4-1BBL 胞外区/抗CD20融合蛋白增强抗CD3/抗CD20diabody介导的靶向杀伤作用及其机制。方法:通过表达纯化人4-1BBL 胞外区/抗CD20融合蛋白及抗CD3/抗CD20diabody,利用台盼蓝计数观察联合应用人4-1BBL 胞外区/抗CD20融合蛋白及抗CD3/抗CD20diabody对淋巴细胞增殖的影响;采用ELISA 检测白介素-2（IL- 2）水平。RT-PCR 检测穿孔素和颗粒酶mRNA 的表达。Calcein 检测其联合应用抗CD3/抗CD20双功能抗体及PBL 对靶细胞Raji 细胞的杀伤作用。结果:人4-1BBL 胞外区/抗CD20融合蛋白增强抗CD3/抗CD20diabody对靶细胞Raji 细胞的杀伤作用,其机制可能是促进淋巴细胞增殖,减少细胞死亡,促进IL- 2 分泌及上调穿孔素和颗粒酶mRNA 表达。结论:人4-1BBL 胞外区/抗CD20融合蛋白与抗CD3/抗CD20diabody联合应用,分别靶向4-1BBL 和CD3 双信号发挥协同抗肿瘤作用,为肿瘤免疫治疗提供了新的思路。      

抗CD3/抗TNP双功能抗体的制备及对胃癌细胞系的杀伤作用

:目的　以化学方法将抗CD3 及抗三硝基苯 (TNP)单克隆抗体交联为双功能抗体 ,研究此双功能抗体与任何TNP化的抗肿瘤单抗结合 ,介导对肿瘤细胞的杀伤作用。方法　分别纯化抗CD3 及抗TNP单克隆抗体 ,经二硫苏糖醇 (DTT)还原、偶联得到抗CD3 /抗TNP双抗。TNP化抗胃癌单抗PD4 、3H11与抗CD3 /抗TNP双抗介导人淋巴细胞对胃癌细胞系MGC80 3的细胞毒作用。结果　双抗与TNP化的单抗结合 ,介导效应细胞对靶细胞的杀伤率高于未TNP化单抗 ,并随着效靶比的提高而升高。结论　抗CD3 /抗TNP双抗能够与不同种类的TNP化单抗结合介导效应细胞杀伤靶细胞 ,有潜在的临床应用价值     

自体外周血CD34^＋造血干细胞移植治疗多发性骨髓瘤

[目的]探讨自体外周血CD+34造血干细胞移植治疗多发性骨髓瘤的可行性。[方法]应用CliniMACS系统分选纯化 患者外周血CD+34造血干细胞,用流式细胞仪检测分选纯化 结果。选马法兰200mg/m2作为预处理方案。[结果]分选纯化结 果,单个核细胞数为3.7136×108,活性率96.6％,CD+34细胞数 3.68018×108,即5.52×106/kg。移植后患者骨髓像获得完全缓 解。移植相关并发症少且易于控制。[结论]自体外周血CD+34 造血干细胞移植治疗多发性骨髓瘤是安全、有效、可行的 。     

CCNG2在甲状腺肿瘤表达的临床意义及过表达对甲状腺癌细胞增殖与凋亡的影响

目的 细胞周期蛋白G2 (CyclinG2, CCNG2 ) 在甲状腺癌中的表达意义及其过量表达对甲状腺癌SW579细胞的生物学影响。方法 采用免疫组织化学方法、Western blot检测63例甲状腺癌组织及距其癌组织边缘5cm以上的镜下未见癌浸润的63例正常组织中蛋白的表达情况。通过慢病毒转染方法建立过量表达CCNG2的甲状腺癌SW579细胞。采用RT-PCR及Western blot 检测转染后SW579细胞内CCNG2基因的表达水平,MTT比色法及流式细胞术(FCM)观察细胞增殖、凋亡变化情况。结果 免疫组织化学结果表明,CCNG2蛋白在正常甲状腺组织及甲状腺癌组织中的表达阳性率分别为96.8%、33.3%,较正常甲状腺组织明显降低(P＜0.05)。Western blot结果表明,CCNG2蛋白在甲状腺癌组的表达相对量较正常甲状腺组织的表达相对量明显降低,二者比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。CCNG2蛋白表达与甲状腺癌患者性别、年龄、肿瘤大小无关(P＞0.05);而与甲状腺癌细胞分化程度、淋巴结转移以及肿瘤临床分期有关(P＜0.05)。Kaplan-Meier生存分析提示,CCNG2表达阳性的甲状腺癌患者的5年总生存率明显高于其表达阴性者,二者比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。MTT及凋亡结果表明,CCNG2过量表达能明显抑制SW579细胞增殖能力,细胞凋亡数目明显增多(P＜0.05)。结论 CCNG2在甲状腺癌发生发展过程中占重要作用,可作为判断甲状腺癌患者预后的指标。     

食管癌中CD44V5和nm23-H1基因表达及意义

目的探讨CD44V5,nm23-H1的基因产物表达与食管癌临床病理及预后的关系.方法应用免疫组织化学S-P法对85例食管癌标本进行CD44V5和Nm23-H1的基因产物测定,并对其中50例患者术后随访3年.结果①CD44V5在食管癌中的阳性表达率为61.2%,Nm23-H1在食管癌中的阳性表达率为57.6%.②在食管癌中CD44V5的过表达和Nm23-H1的低表达与食管癌的浸润深度、分化程度、淋巴结转移、临床TNM分期及预后相关(P＜0.05),而与食管癌患者的性别、年龄、肿瘤大小、病理类型均无相关性(P＞0.05).③在食管癌中,CD44V5和Nm23-H1的表达呈负相关(r=-0.439,P＜0.01),且CD44V5的过表达伴有Nm23-H1低表达者发生淋巴结转移的可能性大(P＜0.01).结论CD44V5和Nm23-H1在食管癌中的不同表达与食管癌的淋巴结转移及预后显著相关.CD44V5、Nm23-H1的不同表达在食管癌淋巴结转移中可能起协同作用,可为临床预测食管癌淋巴结转移及评估预后提供重要的参考指标.     

CD54、CD44在涎腺腺样囊性癌中的表达及意义

目的：探讨CD54、CD44在腺样囊性癌中的表达意义。方法：采用免疫组织化学SP法检测31例腺样囊性癌中CD54、CD44表达情况。结果：在腺样囊性癌腺样管状型。混合型、实体型中CD54、CD44表达率分别为88．24％、66．67％、25％与3539％、50％、87．5％在31例中、21例有复发或淋巴结转移,19例无复发转移,CD54在复发转移组中的表达显著低于无复发转转移组（P＜0．01）,而CD44的表达在复发转移组中却显著高于复发转移组（P＜0．01）。结论：涎腺腺样囊性癌CD54、CD44分子的表达与组织分化程度,肿瘤进展及复发,转移有关。CD44高表达者复发转移较低,而CD44高表达者复发、转移倾向明显。     

胃癌中巨噬细胞移动抑制因子和血管内皮生长因子表达及临床意义

【】目的 检测巨噬细胞移动抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor, MIF)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)在胃癌中的表达,探讨MIF和VEGF在胃癌发生发展过程中的临床意义,为胃癌的诊断提供参考指标。方法 采用免疫组织化学法和Western bolt方法检测胃癌组织及癌旁组织中的MIF和VEGF的表达,并结合临床资料统计分析其与胃癌的生物学行为的关系,并分析二者的相关性。结果 MIF和VEGF在胃癌中的表达率分别为88.8%和50.6%。而在正常胃粘膜中均无表达。结论 MIF和VEGF可能是胃癌变多阶段演进过程中的重要变化分子之一,很有潜力作为胃癌分子诊断的生物标志。     

PET/CT纵隔淋巴结SUVmax与N0~N 1期非小细胞肺癌手术患者预后相关性的研究

  目的  评价NSCLC患者行根治性切除术后, 纵隔淋巴结组织学检查阴性(N0~N1期)的患者术前纵隔淋巴结FDG摄取水平对患者预后的意义。  方法  回顾性总结了2005年4月至2009年5月在天津医科大学附属肿瘤医院行PET/CT检查后接受手术治疗的N0~N1期NSCLC患者的PET/CT数据、术后随访资料及临床资料。运用Kaplan-Meier法及Log-rank检验对纵隔淋巴结SUV_max以及性别、年龄、组织学类型、TNM分期、术后辅助治疗、原发病灶SUV_max等分别与患者生存时间进行单因素生存分析, 采用Cox回归风险比例模型对影响预后的各因素进行多因素生存分析。  结果  单因素分析表明, 术前PET/CT纵隔淋巴结SUV_max(P=0.001)以及TNM分期(P < 0.001)、原发病灶SUV_max(P=0.001)、是否有术后辅助治疗(P=0.012)对N0~N1期NSCLC患者术后预后存在预测作用; 多因素分析表明, 只有TNM分期(P=0.017)、原发病灶SUV_max(P=0.027)及纵隔淋巴结SUV_max(P=0.046)是影响本组NSCLC患者术后生存的独立预后因素, 三者的相对危险度分别为2.230, 2.179及1.962。  结论  对于N0~N1期的NSCLC术后患者, 术前PET/CT纵隔淋巴结SUV_max、TNM分期、原发病灶SUV_max均是影响患者术后生存的因素。将三者结合起来, 对于指导临床尽早制定术后个体化治疗方案、延长患者生存期具有重要意义。      

肝细胞生长因子诱导不同基因型非小细胞肺癌细胞株对埃罗替尼耐药及机制的研究

背景与目的肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor ,HGF)受体(c-Met)可能与非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)对埃罗替尼耐药有关。本研究旨在体外研究HGF诱导不同EGFR基因型NSCLC细胞对埃罗替尼耐药及可能的耐药机制。方法 选择不同EGFR基因型NSCLC细胞(PC9、H292、A549),用HGF诱导或(和)埃罗替尼处理细胞,通过MTT法检测细胞增殖,PI法检测细胞周期,Annexin V-FITC法检测细胞凋亡,Western blotting检测细胞中c-Met、EGFR、ErbB3及其磷酸化蛋白的表达。结果 埃罗替尼对三种细胞的生长抑制作用均呈浓度依赖性,埃罗替尼对HGF诱导的药物-存活率曲线明显往右移。实验分为四组：C组(control)、H组(HGF)、E组(erlotinib)、HE组(HGF erlotinib)。在每种细胞分组中,HE组凋亡率均比E组减少(P<0.05)。在H292、A549,HE组与E组比较,G0/G1期比例减少(P<0.05)、S期比例增多(P<0.05)。HGF能迅速活化三种细胞内p-Met蛋白磷酸化,HE组与E组比较,p-Met蛋白含量明显升高。结论 在体外,在体外HGF诱导不同EGFR基因型NSCLC细胞株对埃罗替尼耐药,c-Met磷酸化活化可能是HGF诱导NSCLC细胞株对埃罗替尼耐药的重要机制。     

Proliferative and anti-proliferative effects of dietary levels of phytoestrogens in rat pituitary GH3/B6/F10 cells - the involvement of rapidly activated kinases and caspases

Background  

Phytoestogens are a group of lipophillic plant compounds that can have estrogenic effects in animals; both tumorigenic and anti-tumorigenic effects have been reported. Prolactin-secreting adenomas are the most prevalent form of pituitary tumors in humans and have been linked to estrogen exposures. We examined the proliferative effects of phytoestrogens on a rat pituitary tumor cell line, GH₃/B₆/F₁₀, originally subcloned from GH₃ cells based on its ability to express high levels of the membrane estrogen receptor-α.