移植物转染反义细胞外信号调节激酶-2基因减轻慢性移植物血管病

目的 研究转染反义ERK2基因对慢性移植物血管病的抑制作用及其机制.方法 构建含有反义ERK2基因和带有LacZ基因的腺病毒载体.以BN大鼠为供者,Lewis大鼠为受者,制作大鼠腹主动脉移植模型.ERK2组接受转染反义ERK2基因的腹主动脉移植,LacZ组接受转染LacZ基因的腹主动脉移植,对照组接受不进行处理的腹主动脉移植.移植后60 d,取各组移植血管和血清样本,以2,3-二羟基丙醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参照,计算ERK2条带灰度与GAPDH条带灰度的比值(ERK2/GAPDH,即为ERK2的相对表达强度);测量移植血管内膜厚度(I)和中膜厚度(M),计算I/(I+M)之百分比;检测移植血管平滑肌细胞(VSMC)的数目和分布;检测血清血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)的浓度.结果 对照组、LacZ组和ERK2组ERK2/GAPDH的比值分别为1.21±0.15、1.02±0.06和0.47±0.09,后者显著低于前二者(P<0.05).对照组和LacZ组移植血管呈典型的移植物血管病表现,两组I/(I+M)比值分别为84.1%和79.9%;ERK2组移植血管呈移植动脉内膜炎表现,该组I/(I+M)比值为13.7%,显著低于前两组(P<0.05).对照组和LacZ组内膜增厚处散在分布大量VSMC,计数分别为(71.3±9.2)个和(76.4±11.3)个;ERK2组内膜处VSMC计数为(34.8±5.3)个,明显少于前两组(P<0.05).对照组和LacZ组受者血清PDGF-BB浓度分别为(1075±70)pg/ml和(1200±25)pg/ml,ERK2组为(626±27)pg/ml,ERK2组明显低于对照组和LacZ组(P<0.05).结论 转染反义ERK2基因可减轻慢性移植物血管病,并延缓其进展,其机制可能与VSMC增殖和迁移受到抑制以及PDGF-BB表达下调有关.     

结缔组织生长因子介导转化生长因子β1促进瘢痕成纤维细胞转分化的研究

目的 了解结缔组织生长因子(CTGF)介导TGF-β1发挥促人增生性瘢痕Fb(HSFb)转分化的作用.方法 体外培养人HSFb,取5份细胞标本分别加入不同浓度TGF-β1(0、2.5、5.0、7.5、10.0 ng/mL),作用48 h后待测.余下标本分为:空白对照组;CTGF刺激组,培养液中加入终浓度10.0 ng/mL重组人CTGF;TGF-β1刺激组,培养液中加入终浓度10.0 ng/mL重组人TGF-β1;CTGF反义寡脱氧核苷酸(ASODN)转染组,细胞转染CTGF ASODN后,加入培养液;CTGF ASODN转染+TGF-β1刺激组,细胞转染CTGF ASODN后2 h,加人含终浓度10.0 ng/mL重组人TGF-β1的培养液.蛋白质印迹法分析不同浓度TGF-β1刺激对细胞CTGF表达的影响,比较各组α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达变化;流式细胞仪检测α-SMA阳性细胞百分率.结果 TGF-β1浓度为10.0 ng/mL时,CTGF的表达明显高于未受刺激的细胞(P<0.05).CTGF刺激组与TGF-β1刺激组α-SMA表达明显高于空白对照组(P<0.01).CTGF ASODN转染组以及CTGF ASODN转染+TGF-β1刺激组α-SMA表达与空白对照组接近(P>0.05).上述各组细胞α-SMA阳性细胞百分率依次为(10.8±2.8)%、(29.1±4.0)%、(28.7±4.8)%、(10.7±2.3)%、(14.3±2.9)%,统计学分析结果类似于α-SMA表达.结论 CTGF是TGF-β1发挥促人HSFb转分化的重要下游效应分子之一.     

脂多糖协同转化生长因子-β1对乳腺癌MCF-7细胞上皮-间充质转化及迁移侵袭能力的影响

目的 观察脂多糖(LPS)协同转化生长因子-β1 (TGF-β1)作用于乳腺癌MCF-7细胞的生物学效应,并探讨其分子生物学机制.方法 倒置显微镜下观察细胞形态;罗丹明-鬼笔环肽标记细胞骨架;实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、转录因子Snail、Twist以及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的基因表达水平;Transwell小室检测迁移、侵袭能力;明胶酶谱检测活性蛋白MMP-9的表达水平;Western blot检测核因子(NF)-κB、细胞外信号调节激酶(ERK)和Smad信号通路.结果 LPS和TGF-β1联合组(联合刺激组)的细胞呈纺锤状,细胞骨架明显改变.联合刺激组E-cadherin显著下调,Vimentin、Snail-2、Twist、MMP-9 mRNA表达水平显著上调;对照组、LPS组、TGF-β1组、联合刺激组每个视野迁移细胞数分别为(6.8±4.1)、(10.2±4.3)、(39.5士3.8)、(69.7±4.4)个,每个视野侵袭细胞数分别为(4.4±1.1)、(6.8±2.4)、(32.1±2.3)、(54.9±4.5)个.联合刺激组活性MMP-9表达水平最高;联合刺激组磷酸化ERK和磷酸化Smad-2的水平要高于TGF-β1组.结论 LPS能够增强TCF-β1诱导乳腺癌MCF-7细胞发生上皮-间充质转化,并且两者联合作用能够促进MCF-7细胞发生侵袭迁移.     

血小板源性生长因子-BB影响下大鼠血管平滑肌细胞增殖及其ras蛋白的表达

目的 观察血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)的增殖及其ras蛋白表达的影响.方法 体外培养大鼠VSMC并传代,将第4代VSMC分4组,设空白对照组,另设3组分别加入1、2、4 μg/L PDGF-BB进行干预,采用细胞计数、免疫组织化学及免疫荧光等方法,观察干预后1、3、7 d 3个时间点的VSMC计数、增殖细胞核抗原(PCNA)表达及相应时段ras蛋白的表达,并分析两者之间的相关性.结果 (1)在7 d内各组VSMC计数均逐渐增加,其中2 μg/L和4 μg/L PDGF-BB组的计数增长较对照组快(P＜0.05),4 μg/L PDGF-BB组较1 μg/LPDGF-BB组快(P＜0.05);(2)免疫组织化学和免疫荧光检测显示,干预3 d后各组VSMC增殖细胞百分比均表现为高PDGF-BB浓度组高于低浓度组(P＜0.05),ras蛋白荧光表达强度亦呈现相同趋势(P＜0.01).PDGF-BB干预后的VSMC的PCNA表达和ras蛋白表达呈显著正相关(r=0.735,P＜0.05).结论 PDGF-BB可以刺激体外培养大鼠VSMC增殖,并可促进其ras蛋白的表达.     

megsin基因转染对高糖环境中系膜细胞胞外调节蛋白激酶表达的影响

目的 观察megsin基因转染对高糖环境中小鼠肾小球系膜细胞血小板源性生长因子BB（PDGF-BB）、磷酸化胞外调节蛋白激酶1/2（pERK1/2）、转化生长因子β1（TGF-β1）的表达及Ⅳ型胶原水平的影响;探讨megsin基因对细胞外信号调节激酶（ERK）通路的作用。 方法 将小鼠肾小球系膜细胞分为7组：低糖组（A组,5.5 mmol/L）、高糖组（B组,30 mmol/L）、高糖+空质粒组（C组）、高糖+megsin质粒组（D组）、高糖+megsin质粒+ERK通路抑制剂组（E组）、高糖+ megsin siRNA组（F组）和低糖+甘露醇组（24.5 mmol/L甘露醇,G组）。分别在培养12、24、48 h后,采用Western印迹法测定各组系膜细胞megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1的表达,放射免疫测定法（RIA）测定各组细胞上清液中Ⅳ型胶原浓度。 结果 与A组相比,高糖刺激可上调系膜细胞megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1的表达及上清液Ⅳ型胶原的水平（均P ＜ 0.05）,且有一定的时间依赖性。转染megsin基因可进一步上调高糖环境下系膜细胞PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1、Ⅳ型胶原的表达（均P ＜ 0.05）。应用ERK通路抑制剂后,与D组相比系膜细胞megsin 和PDGF-BB的表达无明显变化（均P ＞ 0.05）,而pERK1/2、TGF-β1及Ⅳ型胶原的表达则明显降低（均P ＜ 0.05）。转染megsin siRNA对系膜细胞megsin基因进行干扰后,系膜细胞PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1的表达及Ⅳ型胶原的含量较B组下调（均P ＜ 0.05）。 结论 高糖环境下,转染megsin基因可使小鼠系膜细胞megsin、PDGF-BB表达增高,其可能部分通过ERK通路使TGF-β1表达上调及Ⅳ型胶原合成与分泌增加。megsin siRNA干扰可使上述指标下调,megsin基因可能在糖尿病肾病发病中起重要作用。     

不同浓度转化生长因子β_1对人主动脉平滑肌细胞增殖及迁移的影响

目的探讨不同浓度转化生长因子(TGF)-β_1对人主动脉平滑肌细胞(HA-VSMCs)增殖及迁移的影响。方法体外培养人主动脉平滑肌细胞,用0、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10ng/ml浓度的重组人TGF-β_1进行干预,分别在干预后第0、6、12、24、36小时5个不同时间点进行CCK-8试验,或24小时后进行Transwell迁移试验,观察细胞增殖及迁移情况。结果当TGF-β_1浓度5ng/ml时,随着刺激浓度增加,人主动脉VSMCs增殖水平逐渐升高,当TGF-β_1浓度5 ng/ml时,细胞增殖水平降低。不同浓度TGF-β_1(0、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10 ng/ml)干预细胞,随着作用时间延长,细胞增殖水平逐渐升高,在24小时时达到高峰,之后逐渐降低。TGF-β_1浓度为5 ng/ml且培养时间为24小时时细胞增殖水平最高(OD值:0.843±0.016)(P0.01)。当TGF-β_1浓度≤5ng/ml(0、0.05、0.1、0.5、1、2、5 ng/ml)且作用时间为24小时时,随着TGF-β_1浓度增加,人主动脉VSMCs迁移水平不断升高,其中以TGF-β_1浓度为5 ng/ml时细胞迁移水平最高,迁移细胞数为84.667±0.577;TGF-β_1浓度5 ng/ml时,细胞迁移水平降低,迁移细胞数为69.667±1.528。与其余各组TGF-β_1浓度作用下的迁移细胞数比较,差异有统计学意义(P0.01)。结论 5ng/ml的TGF-β_1作用24小时更能刺激人主动脉平滑肌细胞发生增殖及迁移。     

丹参酮ⅡA对大鼠血管平滑肌细胞增殖的抑制作用及机制探讨

目的:观察丹参酮ⅡA(TanⅡA)对体外培养的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖与迁移的影响。方法:采用CCK8法筛选VSMC增殖的最适胎牛血清(FBS)浓度,然后将VSMC分为3组:(1)对照组:VSMC加入5%FBS培养液;(2)增殖组:VSMC加入30%FBS培养液;(3)TanⅡA干预组:110 mg/L TanⅡA+30%FBS;220 mg/L TanⅡA+30%FBS;340 mg/L TanⅡA+30%FBS,分别培养24、48、72 h后检测细胞增殖情况;伤口愈合实验观察VSMC迁移指数;免疫细胞化学法检测细胞血小板生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)的表达变化;应用Western blot法观察细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及金属基质蛋白酶2(MMP2)、金属基质蛋白酶9(MMP9)的表达情况。结果:与增殖组相比,TanⅡA干预后细胞增殖明显缓慢,其抑制作用呈时间、剂量依赖性,20 mg/L TanⅡA干预48 h对VSMC增殖的抑制作用比较显著,且无明显细胞损伤。伤口愈合实验显示TanⅡA干预后VSMC的迁移指数明显低于增殖组(P0.05);免疫细胞化学结果显示,与增殖组相比,TanⅡA干预后PDGF表达减少,差异具有统计学意义(P0.05),各组间b FGF表达差异无统计学意义;Western blot结果显示,与增殖组比较,TanⅡA干预组随药物浓度的提高,Bcl-2、MMP2、MMP9表达水平降低,Bax提高,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:20 mg/L TanⅡA对高浓度FBS诱导的VSMC增殖与迁移的抑制作用较为明显,且无明显细胞损伤,其抑制作用可能与调节Bcl-2、Bax表达,阻断PDGF、MMP2、MMP9生长因子活化有关。     

转染Megsin基因对体外系膜细胞增殖和Ⅳ型胶原分泌的影响及机制

目的 了解Megsin基因高表达对体外系膜细胞增殖和Ⅳ型胶原分泌的影响，并探讨其机制。 方法 构建大鼠Megsin基因真核表达载体，体外转染系膜细胞。3H-胸腺嘧啶(3H-TdR)掺入法检测系膜细胞增殖情况。RT-PCR方法检测系膜细胞血小板源生长因子(PDGF)-BB、IL-1β、IL-6、IL-10、TGF-β1和TNF-α mRNA表达变化。ELISA法检测细胞培养上清PDGF-BB、TGF-β1和Ⅳ型胶原浓度。观察PDGF-BB中和抗体对大鼠系膜细胞转染Megsin基因后细胞增殖和TGF-β1 mRNA表达的影响。 结果 大鼠系膜细胞转染Megsin基因后，细胞内3H-TdR掺入量显著增加，PDGF-BB和TGF-β1 mRNA表达显著上调，细胞培养上清PDGF-BB、TGF-β1和Ⅳ型胶原的浓度显著升高，3者与转染Megsin基因呈明显时间依赖性关系。PDGF-BB中和抗体显著抑制系膜细胞转染Megsin基因后细胞内3H-TdR的掺入，并下调稳定表达Megsin基因的大鼠系膜细胞TGF-β1 mRNA表达。结论 Megsin基因高表达在体外可促进系膜细胞PDGF-BB和TGF-β1的表达和分泌，进而促进系膜细胞增生和Ⅳ型胶原分泌。     

反义细胞外信号调节激酶-2基因治疗移植物动脉血管病内膜病变

目的 观察移植物动脉血管病(TA)的内膜病变机制和反义细胞外信号调节激酶2基因腺病毒载体(Adanti-ERK2)基因治疗的效果.方法 建立Brown-Norway(BN)-Lewis移植物动脉血管病模型,分为同系组、Control组、LacZ组和Adanti-ERK2组(给予5×109 pfu Adanti-ERK2基因治疗),每组各6例.术后60 d检测各组内膜病变和血管腔内膜/(内膜+中膜)比,α-肌动蛋白(α-actin)和血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)染色检测移植动脉平滑肌细胞(VSMCs)增殖和分泌功能,评估移植动脉新生毛细血管情况并检测移植动脉中环氧化酶-2(COX-2)的表达.结果　术后60 d同系组内膜无异常,Control组和LacZ组典型内膜增殖改变,Adanti-ERK2组内膜病变较轻;内膜/(内膜+中膜)比各组分别为7.6%、81.4%、85.9%、15.9%;α-actin阳性细胞(内膜平滑肌细胞)每视野计数各组分别为0、71.3±9.2、76.4±11.3、34.8±5.3;PDGF-BB阳性细胞每视野计数各组分别为0.9±0.5、28.4±3.4、29.1±3.2、8.6±1.7;移植动脉中膜和内膜新生毛细血管检测各组分别无、丰富、丰富、少量;COX-2新生血管阳性细胞计数各组分别为0、36.3±8.3、40.9±9.2、10.4±3.9.Adanti-ERK2组与其他组别间比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论　内膜增生,血管腔缩窄,PDGF-BB诱导内膜平滑肌细胞募集分化并激发血管新生是TA重要病理生理环节,AdantiERK2基因治疗可有效干预各发病环节,达到治疗效果.

Abstract：

Objective To explore the mechanisms of intimal injury underlying transplant arteriosclerosis (TA) and to clarify the treatment effect of adenovirus-mediated anti-extracellular signal regulated kinase 2 (Adanti-ERK2) gene therapy on TA. Methods The Brown-Norway (BN)-Lewis TA model was employed. According to different gene therapy, the recipients were divided into isograft group, control group, LacZ group, which were used as control, and Adanti-ERK2 group (5 × 109 pfu Adanti-ERK2 was transferred into the graft before transplant, 6 cases in each group). The grafts were harvested on the day60 post-transplantation to evaluate the intimal injury and calculate the ratio of intima/( intima + media). The staining of α-actin and PDGF-BB was performed to analyze proliferation and secretion of vascular smooth muscle cells (VSMCs). The angingenesis was evaluated and the cyclooxygenase-2 (COX-2) staining was detected. Results The intima was normal in the isograft group but a typical intimal proliferation was observed in the control group and the LacZ group. A mild intima injury was obtained in the Adanti-ERK2 group. The ratio of intima/( intima + media) was 7.6%, 81.4%, 85.9% and 15.9% in isograft, control, LacZ and Adanti-ERK2 groups, respectively. The α-actin staining-positive cells, which indicated VSMCs, were counted per vision-field as 0, 71.3 ± 9.2, 76. 4 ± 11.3 and 34. 8 ± 5.3, respectively. The platelet derived growth factor-BB (PDGF-BB) positive cells were counted as 0. 9 ± 0. 5, 28.4 ± 3.4,29. 1 ± 3.2 and 8.6 ± 1.7, respectively. The angiogenesis was detected as none, abundant, abundant and few, and COX-2 positive cells were counted as 0, 36. 3 ± 8. 3, 40. 9 ± 9. 2 and 10. 4 ± 3.9, respectively (P ＜ 0. 05 between Adanti-ERK2 group and other groups). Conclusion Intimal proliferation, luminal narrow, VSMCs recruitment and differentiation induced by PDGF-BB in intima and the following angiogenesis are the important pathophysiological process of TA. Adanti-ERK2 gene therapy modulates the process and then ameliorates TA.     

转化生长因子β1诱导的系膜细胞纤维蛋白溶酶系统变化及其机制

目的研究转化生长因子(TGF)-β1对大鼠系膜细胞纤维蛋白溶酶(纤溶酶)系统的影响,并探讨反应性氧基(ROS)的作用。方法以体外培养的大鼠系膜细胞为对象,采用TGF-β1刺激12h,部分实验中培养的细胞在刺激前应用DL-buthionine-(S,R)-sulfoximine(BSO)预处理24h,或应用抗氧化剂N-acetylcysteine(NAC)预处理1h。应用荧光素法测定细胞ROS含量。系膜细胞tPA、uPA和PAI-1mRNA的表达采用RT-PCR测定。PAI-1蛋白表达应用ELISA检测。应用合成的荧光素酶底物及荧光扫描法分别测定纤溶酶、uPA、tPA活性。结果TGF-β1可显著增加细胞ROS含量。2ng/mlTGF-β1可显著上调PAI-1mRNA和蛋白的表达,分别为1.9倍(P<0.01)和1.5倍(P<0.05)。tPAmRNA的表达不受影响但uPAmRNA的表达较对照组下调52%(P<0.01)。TGF-β1可抑制纤溶酶和uPA活性,分别为30%(P<0.01)和23%(P<0.05),但对tPA的活性无显著影响。在BSO预处理组,TGF-β1对uPA、PAI-1mRNA表达和蛋白释放的影响得到显著增强;而NAC预处理可明显逆转由TGF-β1诱导的uPA、PAI-1mRNA表达的上调和蛋白表达增加以及活性的改变。结论TGF-β1可促使细胞ROS产生增加。ROS介导了由TGF-β1诱导的系膜细胞PAI-1mRNA和蛋白表达的上调以及uPAmRNA表达的下调和uPA、纤溶酶活性的下降。TGF-β1对系膜细     

转化生长因子对两种人骨肉瘤细胞株侵袭和迁移的影响

目的观察外源性转化生长因子beta(TGF-β)对人骨肉瘤细胞HOS、MG-63细胞侵袭和迁移能力的影响,并初步探讨其作用机制。方法 SD208是TGF-β受体抑制剂,可以特异性抑制TGF-β信号通路。本实验所需细胞由广州医科大学实验医学研究中心赠与。用TGF-β与SD208分别和共同处理人骨肉瘤细胞HOS、MG-63,采用划痕实验检测TGF-β对细胞迁移的影响,侵袭实验(Transwell)检测TGF-β对细胞侵袭的影响,实时荧光定量聚合酶链锁反应(qRT-PCR)检测TGF-β与SD208处理细胞后PTHr P(甲状旁腺激素相关蛋白)、解离素19(ADAM19)、白细胞介素-11(IL-11)、血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)基因的变化,蛋白免疫印迹检测TGF-β与SD208对细胞PTHr P和MMP-2蛋白的作用。TGF-β和SD208处理细胞后各基因、蛋白及侵袭和迁移能力的变化,通过Graphpad Prism 5统计学软件进行统计分析,采用单因素方差分析经行分析,两两比较采用Bonferroni法进行比较。结果 TGF-β刺激骨肉瘤细胞后,细胞侵袭及迁移能力增强,HOS对照组、TGF-β组、SD208组和TGF-β+SD208组24 h侵袭细胞数分别为(73.4±5.2)个、(161.8±8.1)个、(55.3±4.5)个、(68.2±6.1)个,差异有统计学意义(F=6.9,P0.05);MG63细胞为(19.9±1.5)个、(32.3±2.2)个、(15.7±1.5)个、(17.6±2.5)个,差异有统计学意义(F=7.3,P0.05)。TGF-β能够明显上调细胞PTHr P、ADAM19、IL-11、VEGF和MMP-2 mRNA的表达,同时PTHr P与MMP-2的蛋白表达明显升高。HOS对照组、TGF-β组、SD208组和TGF-β+SD208组PTHr P蛋白表达量分别为(0.2±0.02)、(0.5±0.07)、(0.2±0.02)、(0.2±0.14)差异有统计学意义(F=4.6,P0.05)。MMP-2蛋白表达量分别为(0.4±0.03)、(0.8±0.02)、(0.2±0.02)、(0.3±0.02)差异有统计学意义(F=5.1,P0.05)。结论外源性TGF-β能够增强人骨肉瘤细胞HOS、MG-63细胞的侵袭和迁移能力,其机制可能与升高细胞内PTHr P、ADAM19、IL-11、VEGF和MMP-2有关。     

SHH信号通路在血小板源性生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖中的作用研究

目的探讨sonic hedgehog(SHH)信号通路是否在血小板源性生长因子(PDGF)诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)增殖中被活化,研究SHH信号通路是否参与PDGF诱导的VSMC增殖。方法体外培养人VSMC,施加PDGF刺激后应用激光共聚焦显微成像、Western-Blot及qRT-PCR检测SHH信号通路分子mRNA的表达变化;分别应用慢病毒介导的RNAi及SHH信号通路特异抑制剂cyclopamine阻断SHH通路后,用细胞计数、BrdU掺入法及Ki67染色评价细胞增殖情况。结果激光共聚焦显微成像及Western-blot及qRT-PCR均显示PDGF能够活化SHH信号通路蛋白shh、patched1及Gli2的表达;阻断SHH信号通路后,PDGF诱导VSMC增殖的作用明显减弱。结论 SHH信号通路在PDGF诱导的VSMC增殖中有重要作用。     

17 β雌二醇通过丝裂原活化蛋白激酶抑制前列腺癌细胞系PC3增殖

目的探讨丝裂原活化蛋白激酶在17β雌二醇(E2)抑制前列腺癌PC3细胞生长中的作用。方法检测不同浓度E2作用不同时间后PC3细胞生长抑制率。流式细胞仪分析细胞周期分布,TUNEL染色检测凋亡。Western blot检测ERK1/2,JNK和p38活性。RT-PCR法检测雌激素受体(ER)α、ERβ、P21WAF1和cyclinD1的表达。结果E2抑制PC3细胞增殖,并且可以激活ERK1/2、JNK和p38。处理因素作用48h后,对照组、E2、E2 PD98059、E2 SP600125、E2 SB203580组细胞的凋亡率分别为(0.9±0.1)%;(23.0±1.4)%;(30.0±1.2)%;(10.6±0.8)%和(14.6±0.7)%,(P<0.05)。E2使细胞阻滞在G1期,PD98059、SP600125、SB203580分别预处理1h后细胞分别进一步阻滞在G1期;轻度阻滞在G1期和进入S期。RT-PCR发现PC3细胞表达ERα和ERβ,E2、E2 PD98059、E2 SP600125、E2 SB203580组中cyclinD1、P21WAF1基因表达分别为对照组的(0.42±0.03)、(3.13±0.02)倍;(0.21±0.03)、(3.08±0.05)倍;(0.43±0.01)、(1.31±0.04)倍;(2.81±0.02)、(3.14±0.02)倍(P<0.05)。结论E2激活JNK增加P21WAF1基因表达,并激活p38抑制cyclinD1表达,使细胞阻滞在G1期,JNK和p38通路还介导E2引起PC3细胞凋亡。同时E2又可激活ERK1/2,轻度拮抗上述作用。     

肽生长因子和伤口愈合

在伤口微环境中,生长因子和细胞激素是重要的信号转导物。组织修复通过释放生长因子肽开始,如β-转移生长因子(TGF-β)、血小板源性生长因子(PDGF)和来自血小板α-颗粒的表皮生长因子(EGF)。这些肽可以趋化巨噬细胞和成纤维细胞。巨噬细胞则可分泌大量与伤口愈合机理相关的肽,包括TGF-β、TGF-α、PDGF、基础成纤维细胞生长因子(bFGF)及肿瘤坏死因子(TNF)。体外研究发现,TGF-β和PDGF在生理浓度时能趋化单核细胞,FGF、TGF-β和PDGF对成纤维细胞均有趋化作用。在培养基中,大     

丝裂素活化蛋白激酶信号转导途径对血小板源生长因子所致鼠肾系膜细胞表型转化的调控作用

目的 研究血小板源生长因子（PDGF）对肾小球系膜细胞（MC）表型转化的影响,并探讨丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）信号转导途径在其作用中的调控机制。方法 以体外培养的大鼠MC为对象,观察PDGF对细胞增殖、α-平滑肌肌动蛋白（SMA）表达和细胞内c-Jun氨基末端激酶（JNK）活性的作用;观察细胞外信号调节激酶（ERK）途径上游信号MEK-1阻断剂PD98059对PDGF所致上术作用的影响;应用raf-1基因转染并稳定高表达的MC观察其对α-SMA表达,细胞形态及其超微结构的影响。结果 PDGF可刺激MC持续增殖;刺激6～48h可使α-SMA表达增加,但持续刺激72h以上则可导致其表达被抑制近50%,PDGF对JNK活性无明显影响,阻断ERK活化不影响JNK活性及PDGF对α-SMA表达的短时刺激作用。Raf-1蛋白激酶稳定高表达的MC细胞内α-SMA表达缺失,同时细胞内微丝、微管结构减少,细胞形态改变。结论 PDGF对系膜细胞表型转化的影响表现为促进细胞持续增殖、短时作用刺激α-SMA表达而持续作用则抑制α-SMA表达,提示其为具有调控MC增殖和分化双重作用的细胞因子。PDGF的作用可能与MAPK不同亚类的调控有关,其中Raf-1和JNK活性可能对细胞表型具有关键调控作用。     

PDGF-BB对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞增殖和细胞周期的影响

目的探讨血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞(CCSMC)增殖和周期的影响。方法使用改良组织块贴壁法原代培养大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞,将细胞分为空白对照组和不同浓度PDGF-BB处理组,分别采用MTS法和流式细胞术检测PDGF-BB对CCSMC增殖和周期的影响。结果 MTS法提示PDGF-BB促进CCSMC增殖,且在一定时间范围和浓度范围内分别呈时间依赖和浓度依赖;流式细胞术结果显示PDGF-BB作用后G_0/G_1期细胞由(90.79±3.46)%减少至(77.57±5.72)%;而S期的细胞由(7.85±2.68)%升高至(16.47±4.42)%;G_2/M期由(2.46±1.25)%升高至(5.96±2.18)%,两组间差异具统计学意义(P0.05)。结论 PDGF-BB可促进大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞增殖。     

高糖状态下JAK2-STAT3通路的活化对系膜细胞转化生长因子β1、纤连蛋白表达的影响

JAK-STAT通路是近年发现的一组信号转导通路,能介导多种细胞因子和生长因子的细胞内信号转导过程.有研究提示JAK2-STAT3通路可能与系膜细胞的增殖、肥大及细胞外基质分泌有关[1].本研究旨在探讨高糖培养下大鼠肾小球系膜细胞JAK2-STAT3信号转导通路的活性变化及用AG-490(tyrphostin B42,JAK-STAT通路特异性阻断剂)抑制此通路活化对大鼠肾小球系膜细胞转化生长因子β1(TGF-β1)、纤连蛋白(FN)表达的影响,为进一步探讨JAK-STAT信号转导通路与糖尿病肾病发病机制的关系提供新的思路.     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂拮抗人皮肤成纤维细胞转化生长因子β1机制研究

目的 了解过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动剂拈抗TGF-β1促皮肤瘢痕化的效应机制.方法 体外培养正常成人皮肤Fb,根据培养基中所加刺激物不同分为空白对照组(无血清DMEM培养基),TGF-β1组(DMEM培养基加入含终浓度10 ng/mL TGF-β1作用48 h),曲格列酮组(DMEM培养基加入含终浓度10μmol/L曲格列酮作用2 h,再加入10 ng/mL TGF-β1作用48h),15-脱氧前列腺素J2(15d-PGJ2)组(DMEM培养基加入含终浓度10 μmol/L 15d-PGJ2作用2 h,再加入10 ng/mL TGF-β1作用48 h).应用蛋白质印迹法检测结缔组织生长因子(CTGF)的表达,实时荧光RT-PCR检测CTGF、基质金属蛋白酶1(MMP-1)及血小板源性生长因子(PDGF)的mRNA水平变化.对数据进行单因素方差分析.结果 TGF-β1组的CTGF蛋白和mRNA表达水平均高于空白对照组,曲格列酮组和15d-PGJ2组的CTGF蛋白及mRNA表达水平低于TGF-β1组.空白对照组、TGF-β1组、曲格列酮组、15d-PGJ 2组MMP-1 mRNA表达水平分别为1.281±0.195、0.193±0.051、0.417±0.043、0.485±0.027,其中TGF-β1组低于空白对照组(F=12.811,P＜0.01),曲格列酮组、15d-PGJ2组高于TGF-β1组(F=12.811,P值均小于0.01).空白对照组、TGF-β1组、曲格列酮组、15d-PGJ2组PDGF mRNA表达水平分别为0.349±0.057、1.044±0.237、0.677±0.055、0.511±0.017,其中TGF-β1组高于空白对照组(F=16.848,P＜0.01),曲格列酮组、15d-PGJ2组低于TGF-β1组(F=16.848,P值均小于0.01).结论 激活后的PPARγ对TGF-β1下游反应因子CTGF的抑制作用,可能是其拮抗TGF-β1促皮肤瘢痕化的主要机制,而对细胞因子MMP-1、PDGF的影响可能也是其机制之一.     

滋肾通络方对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1、MMP-2、MMP-9mRNA表达影响的实验研究

目的:观察滋肾通络方含药血清对高糖环境下LPS刺激大鼠肾小球系膜细胞(GMCs)TGF-β1、MMP-2、MMP-9mRNA的影响,并探讨其在防治糖尿病肾病(DN)中的机制。方法:以高糖环境下LPS刺激大鼠肾小球系膜细胞生长建立模型,分为以下8组:(1)正常组;(2)高糖组;(3)高糖+LPS组;(4)苯那普利组;(5)滋肾通络方小剂量组;(6)滋肾通络方中剂量组;(7)滋肾通络方大剂量组。采用RT-PCR技术从分子生物学水平检测各组系膜细胞中TGF-β1、MMP-2及MMP-9mRNA表达。结果:与正常组相比,高糖组、高糖+LPS组TGF-β1mRNA的表达明显升高(P<0.01),MMP-2及MMP-9mRNA的表达明显降低(P<0.01);与模型组相比较,滋肾通络方大、中、小剂量组对大鼠肾小球GMCs TGF-β1mRNA表达显著降低(P<0.05),MMP-2、MMP-9mRNA表达明显升高(P<0.05)。结论:滋肾通络方含药血清能够抑制大鼠肾小球GMCs TGF-β1mRNA的表达,增加MMP-2、MMP-9mRNA的表达,从而通过增加肾小球系膜细胞细胞外基质的降解以延缓DN进展。     

苦参碱调控Snail2表达水平抑制转化生长因子β1诱导的人腹膜间皮细胞上皮间充质转分化

目的 研究苦参碱对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导腹膜间皮细胞上皮间充质转分化(EMT)后转录因子Snail2的影响.方法 采用TGF-β1刺激人腹膜间皮细胞并同时予不同浓度苦参碱干预处理,实验分为空白对照组、TGF-β1(5 ng/ml)诱导组、TGF-β1+0.4 mg/ml苦参碱干预组、TGF-β1+0.6 mg/ml苦参碱干预组、TGF-β1+0.8 mg/ml苦参碱干预组和TGF-β1+1.0 mg/ml苦参碱干预组.实时荧光定量PCR和Western印迹检测Snail2、上皮标志分子E钙黏蛋白(E-cadherin)和间质标志分子α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(FN)、胶原Ⅲ(ColⅢ)的表达,Western印迹检测Smad2、Smad3和细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)的蛋白磷酸化水平.结果 TGF-β1(5 ng/ml)刺激能上调人腹膜间皮细胞Snail2、α-SMA、FN和ColⅢmRNA和蛋白的表达水平,上调Smad2、Smad3和ERK1/2的蛋白磷酸化水平,下调E-cadherinmRNA和蛋白的表达水平;苦参碱(0.4、0.6、0.8、1.0 mg/ml)干预处理后能下调Snail2和α-SMA、FN和ColⅢmRNA和蛋白的表达水平以及ERK1/2的蛋白磷酸化水平,上调E-cadherin mRNA和蛋白的表达水平.结论 TGF-β1能诱导人腹膜间皮细胞EMT,苦参碱可能通过ERK1/2信号通路下调Snail2的表达水平来抑制TGF-β1诱导的人腹膜间皮细胞EMT.