衣原体噬菌体Chp4衣壳蛋白Vp1二级结构及B细胞抗原表位预测

【目的】对衣原体噬菌体chp4的Vpl蛋白的二级结构进行分析并预测其B细胞表位。【方法】以Chp4Vp1蛋白的氨基酸序列为基础,分别以Gamier～Robson法、Chou—Fasman法和Karplus—Schulz法共同预测其α螺旋、β折叠、转角结构和无规卷曲;按Kyte—Doolittle,法、Hopp—Woods法、Emini法和Jameson—Wolf法预测蛋闩的亲水性、表位可能性和抗原性指数。综合考虑二级结构及后续预测结果挑选最优表位。【结果】Chp4Vpl蛋白结构复杂,有较多潜在的抗原位点,预测其氨基酸残基第1～10、99～111、158～195、272～285、309～320、332～340、412～420为优势表位。【结论】Chp4Vpl蛋白理论上有较强的免疫原性,潜在的优势表位为之后蛋白相互作用研究和衣原体噬菌体野生株筛查提供了理论依据。     

衣原体噬菌体Chp3衣壳蛋白Vp1二级结构及B细胞抗原表位预测

目的：预测衣原体噬菌体Chp3Vp1蛋白的二级结构和B细胞表位。方法：以Chp3Vp1氨基酸序列为基础,采用Gamier-Robson法、Chou—Fasman法和Karplus-Schulz法预测蛋白二级结构;按Kyte—Doolittle法、Hopp—Woods法、Emini法和Jameson-Wolf法预测蛋白的抗原表位。结果：Chp3Vp1蛋白含多个抗原位点,预测其N端1—10,101—112,159—166,174—184,189—195,288—299,323—333,419-435,477-490为优势表位。结论：Chp3Vp1蛋白有较强的免疫原性,预测的抗原位点为之后蛋白相互作用研究和单抗制备提供了理论依据。     

衣原体噬菌体衣壳蛋白 Vp1 及其高保守区二级结构及 B 细胞表位研究

目的：分析衣原体噬菌体Vpl蛋白及其高保守区的二级结构并预测其B细胞表位。方法：以C｜ustalX程序比对各株衣原体噬菌体衣壳蛋白Vpl序列获得高保守区序列。以Vpl氨基酸序列为基础,采用Gamier—Robson法、Chou—Fasman法、Eisenberg法和Karplus—Schulz法分析蛋白二级结构;按Kyte—Doolittle法、Emini法和Jameson—Wolf法预测蛋白的抗原表位。结果：衣原体噬菌体Vpl蛋白的二级结构以β折叠为主,有少量α螺旋;其高保守区含多个抗原位点,预测其N端1—8,103—110,158—164,189—196,322—332,427—434,478—488为优势表位。结论：衣原体噬菌体Vpl蛋白及其高保守区存在复杂的蛋白结构,可形成多个可选表位。     

衣原体MOMP蛋白生物多态性及细胞表位分析

目的：预测并分析比较衣原体MOMP蛋白的二级结构和B细胞表位。方法：以各株衣原体MOMP蛋白的氨基酸序列为基础,采用Gamier—Robson法、Chou—Fasman法和Karplus-Schulz法预测蛋白二级结构;按Kyte-Doolittle法、Emini法和Jameson—Wolf法预测蛋白的抗原表位;以ClustalX软件序列比对分析其多变区。结果：各株MOMP蛋白含多个抗原位点,各序列在第80—107、165—178、249—264、332—346位序列高度差异,并出现比对“空沟”。多个强表位位于序列保守区内。结论：MOMP蛋白有较强的免疫原性,预测的抗原位点为之后蛋白相互作用研究、单抗制备、亚单位疫苗设计提供了理论依据。     

细粒棘球蚴抗原B亚单位基因序列分析

【目的】获得细粒棘球蚴抗原B亚单位基因序列 ,并进行序列分析。【方法】从包虫病羊体内获取细粒棘球蚴原头节 ,使用TRIZOL试剂提取总RNA ,逆转录成cDNA。根据E .granulosus抗原B亚单位基因的已知序列设计一对引物 ,采用RT PCR技术扩增出抗原B亚单位基因 ;将PCR产物纯化后用双脱氧链末端终止法进行序列测定 ,并进行序列分析。【结果】用RT PCR成功扩增出细粒棘球蚴抗原B亚单位基因序列 ,测序表明该基因ORF为 2 70bp ,和已发表基因核苷酸序列相比 ,缺失 3个碱基 ,同源性为 84 2 % ,推导编码氨基酸序列同源性为 77 8%。【结论】从E .granulosuscDNA扩增出抗原B亚单位基因 ,该基因编码 8ku亚单位前体蛋白。     

亚洲带绦虫烯醇酶基因及其蛋白质的结构与功能

【目的】分析和预测亚洲带绦虫烯醇酶基因及其编码蛋白的结构和特性,用于指导其生物学功能的实验研究。【方法】利用美国国家生物技术信息中心和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统中有关基因和蛋白的序列和结构信息分析的各种工具,结合其他生物信息学分析软件包,如Pcgene和Vector NTIsuite,从亚洲带绦虫全长cDNA质粒文库中识别烯醇酶基因及其编码区,分析、预测该基因编码的蛋白质的理化特性、翻译后的修饰位点、功能域、亚细胞定位、拓扑结构、二级结构、三维空间构象等。【结果】该基因全长1737bp,编码区为第205～1503bp,编码433个氨基酸,为全长基因。GenBank中与棘口吸虫烯醇酶氨基酸序列同源性最高,达78%。相对分子量理论预测值为46653.5 Ku。没有质体、线粒体定位序列。预测编码蛋白有1个跨膜区,3个亲水性部位。与吸虫属的烯醇酶进化关系最近。【结论】应用生物信息方法从亚洲带绦虫成虫cDNA文库中筛选出了亚洲带绦虫烯醇酶cDNA全长序列并预测得到其结构与功能方面信息。     

广州地区HCMV临床病毒株UL137基因的结构特征与多态性

【目的】研究广州地区新生儿感染人巨细胞病毒（HCMV）临床低传代分离株UL137基因的结构特征与基因多态性。【方法】从62份被证实为临床HCMV感染的新生儿尿液标本中分离获得3株低传代临床病毒株，经多重PCR鉴定后分别命名为HCMVD2、D3和D52。对3株临床分离株进行HCMVUL137基因全序列PCR扩增，PCR产物纯化后进行基因克隆，构建HCMVUL137-pMD18-T重组质粒；基因测序；将HCMVUL137基因序列呈报GenBank，并进行基因生物信息学分析。【结果】成功从广州地区新生儿感染HCMV患儿体内分离3株HCMV临床病毒株。克隆测序后呈报GenBank并被收录，收录序列号分别为：DQ180388、DQ180376、DQ180360。通过序列分析，结果显示低传代分离株UL137基因DNA序列高度保守，同源性在96．91％～100％之间．其变异均为碱基替换：编码蛋白均由96个氨基酸残基组成，同源性在90．63％～100％之间，超半数的变异发生在第61～81位氨基酸残基之间：编码蛋白翻译后修饰位点包括PKS、MYS、cAMPs三类，其中4个PKS和44～49位的MYS高度保守，cAMPs位点仅在5株病毒出现；编码蛋白等电点在11．50～12．00之间，呈强碱性。【结论】广州地区临床低传代分离株HCMVUL137基因核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列极为保守，但仍存在-定多态性。提示HCMVUL137ORF可能是-个具有重要功能的基因。     

亚洲带绦虫烯醇酶基因及其蛋白质的结构与功能

 【目的】 分析和预测亚洲带绦虫烯醇酶基因及其编码蛋白的结构和特性,用于指导其生物学功能的实验研究?【方法】 利用美国国家生物技术信息中心和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统中有关基因和蛋白的序列和结构信息分析的各种工具,结合其他生物信息学分析软件包,如Pcgene和Vector NTI suite, 从亚洲带绦虫全长cDNA质粒文库中识别烯醇酶基因及其编码区,分析?预测该基因编码的蛋白质的理化特性?翻译后的修饰位点?功能域?亚细胞定位?拓扑结构?二级结构?三维空间构象等?【结果】 该基因全长1737 bp,编码区为第205～1503 bp,编码433个氨基酸,为全长基因?GenBank中与棘口吸虫烯醇酶氨基酸序列同源性最高,达78%?相对分子量理论预测值为46653.5 Ku?没有质体?线粒体定位序列?预测编码蛋白有1个跨膜区,3个亲水性部位?与吸虫属的烯醇酶进化关系最近? 【结论】 应用生物信息方法从亚洲带绦虫成虫cDNA文库中筛选出了亚洲带绦虫烯醇酶cDNA全长序列并预测得到其结构与功能方面信息?     

人类Foxm1b基因的原核表达、抗体制备及其对肝癌细胞中Foxm1b蛋白的识别

 【目的】构建人类Foxm1b基因的原核表达载体，表达并纯化蛋白，制备多克隆抗体，并用此抗体检测肝癌细胞中Foxm1b基因的表达，为进一步研究Foxm1b基因的功能奠定基础。【方法】从GenBank中下载人类Foxm1b基因全长cDNA序列并用Pegene软件分析其可能的抗原表位，设计引物．应用RT—PCR获得含抗原表位的Foxm1b基因片段，重组人原核表达载体pET-28a，在大肠杆菌BL-21（DE31中诱导表达，应用亲和层析法获得纯度较高的原核表达蛋白并免疫大鼠制备多克隆抗体，用ELISA检测抗体滴度并用免疫细胞化学的方法检测此抗体对肝癌细胞中天然Foxm1b蛋白的识别。【结果】成功构建了Foxm1b基因重组表达载体pET-28a—Foxm1b，表达的蛋白经纯化后免疫大鼠得到了高滴度的多克隆抗体．该抗体可以识别肝癌细胞中的天然抗原。【结论】人类Foxm1b基因的原核表达载体的构建、重组蛋白的表达纯化及有诊断价值的抗体的制备为后续的研究提供了基础。     

应用噬菌体随机肽库筛选2型登革病毒E蛋白的抗原表位

【目的】通过型特异性单抗与噬菌体随机 12肽库的生物淘洗 ,确定 2型登革病毒E蛋白分子的抗原表位。【方法】以DEN2型特异的E单克隆抗体作为筛选分子 ,生物淘洗噬菌体随机 12肽库 ,将筛选的噬菌体阳性克隆进行ELISA检测、DNA序列测定及展示肽的氨基酸序列推导 ,通过展示肽序列与DEN2E蛋白的氨基酸一级结构的对比 ,确定E蛋白的抗原优势表位并用相应的合成肽验证。【结果】常规生物淘洗获得富含芳香族氨基酸并有aHWbW核心结构的克隆 ,确定为非特异的塑料结合噬菌体。改进淘洗方法后 ,肽库筛选的噬菌体阳性克隆有共同的结构模体WFKKGS ,与DEN2E蛋白分子的 390～ 397有 3～ 5个氨基酸相同。其对应的合成 10肽能与淘洗单抗特异反应 ,并可抑制噬菌体阳性克隆与该单抗结合。【结论】本实验通过噬菌体随机肽库的生物淘洗确定DEN2E蛋白 390～ 397氨基酸残基 (WFKKGSSI)存在一线性的B细胞抗原表位。     

重组轮状病毒抗原表位亚单位疫苗的小鼠保护性

目的评价重组表达的轮状病毒(RV)抗原表位疫苗的小鼠体内保护效果及安全性.方法在以FlockHouse virus病毒外壳蛋白为载体的外源抗原表位呈递系统(FHV-RNA2系统)中构建和重组表达RV Vp4蛋白上第223～262位抗原表位(REABC);在原核系统[质粒pET,大肠杆菌BL21(DE3)]中表达的REABC免疫小鼠用细胞培养适应的参照RV Wa(G1PA型)和SA11(G3P2型)经口腔灌胃攻击,对RV攻击后的免疫小鼠和对照小鼠的感染症状、排毒情况、血清抗体中和病毒感染性效价进行测定和分析.结果REABC可诱导免疫小鼠产生较强的抗-Wa和抗-SA11株血清中和抗体和特异的免疫记忆反应,有效保护免疫小鼠对Wa和SA11的攻击(不腹泻),减少病毒在体内复制水平和排毒时间,与对照组相比差异具有显著性(P＜0.001).结论重组表达RV抗原表位REABC对小鼠具有较好的免疫保护效果和安全性.     

Regulative Function of Telomerase and Extracelluar Regulated Protein Kinases to Leukemic Cell Apoptosis

In order to investigate the regulative function of telomerase and phosphorylated (activated) extracelluar regulated protein kinase (ERK) 1 and 2 in the leukemic cell lines HL-60 and K562 proliferation inhibition and apoptosis,three chemotherapeutic drugs Harringtonine (HRT),Vincristine (VCR) and Etoposide(Vp16) were selected as inducers.The proliferation inhibition rate was detected by MTT method,the cell cycle and cell apoptosis was analyzed by flow cytometry and the telomerase activity was detected by the telomeric repeat amplification protocol (TRAP) assay and bioluminescence analysis method.The phosphorylated ERK 1/2 protein expression was detected by western blot method.The results showed that HRT,VCR and Vp16 could inhibit cell proliferation,induce apoptosis,inhibit telomerase activity and down-regulate the protein expression of phosphorylated ERK.It was suggested that ERK signal transduction pathway was involved in the down-regulation of telomerase activity and the onset of apoptosis in the leukemic cells treated by HRT,VCR and Vp16.     

牡蛎过敏原Cra g 1的二级结构及其B细胞和T细胞表位分析

目的分析牡蛎过敏原Cra g 1的二级结构及其B、T细胞表位,为探索基于抗原表位的免疫治疗奠定基础。方法从Uniprot数据库中获得牡蛎过敏原Cra g 1的氨基酸序列,通过DNA Star Protean软件,采用Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法分析其二级结构;采用Kyte-Doolittle法、Karplus-Schulz法、Emini法、Jameson-Wolf法综合分析Cra g 1主要的B细胞抗原表位。使用SYFPEITHI和NetMHC-Ⅱ在线网站分析T细胞抗原表位。结果牡蛎过敏原Cra g 1的二级结构主要为α-螺旋,其B细胞表位接近覆盖Cra g 1氨基酸全序列;而T细胞优势表位位于第89～103、108～122、129～143位肽段。结论本研究分析牡蛎过敏原Cra g 1的B、T细胞优势表位,为日后Cra g 1的基础免疫学研究,如疫苗的研制、诊断试剂的制备和其抗原性改造等提供了理论依据。     

Regulative function of telomerase and extracellular regulated protein kinases to leukemic cell apoptosis.

In order to investigate the regulative function of telomerase and phosphorylated (activated) extracellular regulated protein kinase (ERK) 1 and 2 in the leukemic cell lines HL-60 and K562 proliferation inhibition and apoptosis, three chemotherapeutic drugs Harringtonine (HRT), Vincristine (VCR) and Etoposide (Vp16) were selected as inducers. The proliferation inhibition rate was detected by MTT method, the cell cycle and cell apoptosis was analyzed by flow cytometry and the telomerase activity was detected by the telomeric repeat amplification protocol (TRAP) assay and bioluminescence analysis method. The phosphorylated ERK1/2 protein expression was detected by western blot method. The results showed that HRT, VCR and Vp16 could inhibit cell proliferation, induce apoptosis, inhibit telomerase activity and down-regulate the protein expression of phosphorylated ERK. It was suggested that ERK signal transduction pathway was involved in the down-regulation of telomerase activity and the onset of apoptosis in the leukemic cells treated by HRT, VCR and Vp16.     

1型糖尿病人来源胰岛素原特异性T细胞克隆的建立及表型鉴定

[目的]研究1型糖尿病相关的胰岛素原(Proinsulin,PI)T细胞表位。[方法]采用有限稀释法建立糖尿病病人胰岛素原抗原特异性的T细胞克隆,~(51)Cr释放细胞毒性试验测定T细胞激活的HLA限制性和PI肽段中最小的抗原表位,用流式细胞仪分析其表型及表面肿瘤坏死因子凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apopto-sis-inducing ligand,TRAIL)的表达。[结果]建立了PI抗原特异性的CD4~+ T细胞克隆TWHPI-1,CD8~+ T细胞克隆TWH PI-2。前者为HLA DRB4 0101限制,PI最小抗原表位在PI(79～87),74.2％细胞表达 TRAIL。后者为HLA A1限制。PI最小抗原表位在PI(78～86),94.9％细胞表达TRAIL。[结论]HLA DRB4 0101-Al可能参与IDDM的致病过程,TRAIL可能是两株T细胞克隆引起胰岛细胞死亡的因子之一。     

癌胚抗原T、B细胞表位短肽诱导特异性体液免疫反应研究

目的筛选癌胚抗原含T、B细胞表位的短肽并分析其诱导机体产生体液免疫的特性。方法利用免疫信息学方法预测CEA CTL表位,结合我们早期对CEA B表位预测的结果,选择含多个CTL表位肽和B表位肽的CEA氨基酸序列580～598处短肽作为目的基因。目的基因密码子优化后采用pET32a(+)原核表达系统表达融合蛋白,经SDS-PAGE和Western blot-ting鉴定融合蛋白的抗原性;经镍螯合亲和层析柱(Ni-NTA Agarose)纯化CEA580～598全长融合蛋白,纯化蛋白用佐剂乳化后经日本大耳白家兔背部皮下多点免疫注射,采用Western blotting检测血清抗体的特异性,采用ELISA法检测血清抗体水平及变化趋势。结果含多个T、B细胞表位的短CEA580～598在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量占总蛋白的25.6%;表达产物的相对分子质量(Mr)约21kDa,与预期Mr相符;Western blotting分析结果显示,在21kDa处出现特异性条带。日本大耳白兔经CEA580～598融合蛋白免疫后产生高水平的特异性抗体,与空载体和PBS对照组比较具有显著性差异(P<0.05),制备的免疫血清不但能特异识别CEA580～598短肽,而且能特异识别天然CEA抗原。结论 CEA580～598短肽融合蛋白具有较强的免疫原性,诱导的兔免疫血清能特异性结合CEA抗原,为基于CEA表位疫苗的研究奠定理论和实验基础。