早期异基因骨髓间充质干细胞局部移植修复重度碱烧伤角膜的实验研究

目的探讨结膜下异基凶骨髓问充质干细胞（MMSC）移植修复重度碱烧伤角膜的可行性。方法MMSC移植组大鼠28只（其中10只DiI标记MMSC）,对照组大鼠18只。观察角膜透明度及新生血管。免疫荧光法观察角膜上皮细胞角蛋白12（CK12）及缝隙连接蛋白43（Cx43）的表达和分布。RT—PCR分析白介素-1受体拮抗剂（IL-1RA）的表达。结果4周时移植组角膜新生血管减少,透明度未见改善。角膜缘少量MMSC,未表达CK12、Cx43。角膜近中央区和中央区未见迁移的MMSC。移植组2周、4周IL-1RA高表达,2周时差异最明显。结论结膜下异基因MMSC移植可以抑止重度碱烧伤角膜新生血管的生成,可能与减轻炎症反应有关。     

自体骨髓间充质干细胞移植改善重度眼表损伤临床观察

目的 评价自体骨髓间充质干细胞在严重眼表损伤移植后的治疗效果.方法 选取了化学烧伤4例,Stevens-Johnson综合征2例.骨髓间充质干细胞取自患者,细胞培养14 d后,经细胞检测鉴定为骨髓间充质干细胞,将细胞种植在羊膜表面,细胞扩增融合达90％后使用.手术切除表面结膜化组织达角膜缘外3 mm,将羊膜上培养的自体骨髓间充质干细胞移植到角膜及角膜缘表面,术后予抗生素、激素、人工泪液点眼治疗;病人定期随访,进行裂隙灯显微镜及印迹细胞学检查.结果 6例患眼均覆盖了含有自体骨髓间充质干细胞的羊膜片,术后1周角膜上皮完整.3例患者视力有改善,2例患者视力保持术前水平,1例患者视力下降.术后所有患者眼表面光滑程度有所改善,但新生血管没有明显减少.术后12周印迹细胞学检查结果,1例患者角膜表面可检测到上皮样细胞及杯状细胞.结论 自体骨髓间充质干细胞移植可以改善眼表条件,有潜在应用于治疗角膜缘功能障碍的价值.     

培养角膜缘干细胞羊膜移植治疗碱烧伤动物的实验研究

目的 观察培养生长于羊膜的角膜缘干细胞移植的治疗角膜缘碱烧伤伤的效果。方法 将兔角膜缘干细胞在的代培养后接种于羊膜,对新西兰大白兔角膜缘碱烧伤动物模型行角膜缘干细胞羊膜移植术,并对治疗后的角膜进行临床及病理学检查。结果 体外培养的兔角膜缘士细胞可在羊膜上继续增殖、分化为密集的角膜上皮细胞层;角膜缘干细胞移植术后兔角膜缘轻度充血、角膜上皮完整基质细胞浸润减轻、新生血管减少。组织病理学染色证实,角膜缘     

兔骨髓间充质干细胞及人羊膜上皮细胞移植治疗兔角膜缘干细胞缺损的研究

背景角膜缘干细胞缺乏可引起致盲性眼病,但传统的治疗方法疗效欠佳。最近的研究表明,骨髓间充质干细胞（BMSCs）和人羊膜上皮细胞（AECs）有分化成多种细胞的能力,但其对角膜缘于细胞缺乏的疗效仍有待研究和评价。目的观察和对比兔BMSCs和人AECs移植治疗兔角膜缘干细胞缺损的治疗效果。方法将18只新西兰白兔采用随机数字表法分为羊膜基质（AS）移植组、兔BMSCs移植组和人AECs移植组,每组6只。将浸有NaOH溶液的滤纸贴附于角膜表面建立碱烧伤角膜缘干细胞缺损的动物模型。抽取兔髂窝处骨髓并收集人胎盘组织分别分离、制备兔BMSCs和人AECs,通过密度梯度离心加贴壁培养法及胰蛋白酶多次分步消化法获取兔BMSCs和人AECs,采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法对培养细胞进行鉴定,再接种于人去上皮AS上,按照动物的分组分别将上述材料缝合至动物模型的角膜表面。术后28d,对各组动物的角膜新生血管（CNV）评分以及角膜混浊度评分进行对比,对角膜组织行组织病理学检查并针对角膜上皮细胞特异性标记物细胞角蛋白3（CK3）行免疫组织化学染色。结果第3代兔BMSCs接种于AS载体上12h后贴附生长,第1代人AECs接种于AS载体上48h后呈单层膜状生长,传代细胞经RT—PCR鉴定符合目标细胞的特征。兔BMSCs移植组术后28d,免疫组织化学染色结果显示,兔BMSCs移植组和人AECs移植组的角膜表面细胞CK3均呈阳性表达,而AS组CK3表达阴性。与AS移植组比较,兔BMSCs移植组和人AECs移植组CNV评分以及角膜混浊度评分明显降低,差异均有统计学意义（BMSCs：Z=-2．983,P=0．003;Z=-2．844,P=0．004;AECs：Z=-2．817,P=0．005;Z=-2．041,P=0．041）。组织病理学检查显示,AS组兔角膜组织有较多的炎性细胞生长,胶原纤维排列紊乱。兔BMSCs组术后角膜表层形成了角膜上皮样的复层结构,无明显杯状细胞,角膜基质内无新生血管生长,炎性细胞减少,胶原纤维排列更加规则,且兔BMSCs移植组角膜透明度明显优于人AECs移植组,差异有统计学意义（Z=-2．091,P=0．037）,而2组间CNV评分的差异无统计学意义（Z=-0．267,P=0．789）。结论移植至兔角膜缘干细胞缺损角膜表面的兔BMSCs和人AECs均能分化为角膜上皮细胞样细胞,可抑制CNV,减轻角膜混浊。在改善角膜透明度方面,兔BMSCs优于人AECs。     

人脐带间充质干细胞移植治疗角膜碱烧伤的实验研究

目的:研究人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)移植治疗兔角膜碱烧伤的疗效,分析多形核中性白细胞(PMNs)的浸润和血管内皮生长因子(VEGF)的表达变化。方法:将75只健康日本白兔随机分成A、B、C组,每组25只,均建立右眼角膜碱烧伤模型。A组兔右眼角膜碱烧伤后立即行角膜病灶区羊膜负载hUCMSCs覆盖术;B组兔右眼角膜碱烧伤后立即行角膜病灶区羊膜覆盖术;C组兔右眼角膜碱烧伤后未进行处理。角膜碱烧伤后3、7、14、21、28d,裂隙灯下观察实验兔角膜恢复情况并照相,对角膜新生血管(CNV)生长情况进行评分,并分离角膜组织制作病理切片,通过苏木素-伊红(HE)染色观察PMNs浸润情况,采用免疫组化染色法测定VEGF的表达。结果:角膜碱烧伤后14d时,A组CNV较B组生长明显缓慢,A组病灶区周围CNV生长评分明显低于B组(P<0.05)。碱烧伤后3d时,角膜PMNs数量增加,浸润角膜基质层,7d时稍有下降,14d时达到峰值,后渐进性下降,碱烧伤后早期浸润在病灶区角膜基质内,后期浸润范围与溃疡面积相同,碱烧伤后各时间点A组和B组角膜PMNs密度均明显低于C组(P<0.05),且1...     

骨髓间充质干细胞移植对兔碱烧伤角膜新生血管形成的抑制作用

目的　观察角膜碱烧伤兔行骨髓间充质干细胞（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ,ＢＭＳＣ）移植后不同时间受损角膜新生血管（ｃｏｒｎｅａｌｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ,ＣＮＶ）发生情况,探讨ＢＭＳＣ移植后对碱烧伤ＣＮＶ的抑制作用。方法　取日本大白兔２４只,随机分为实验组和对照组各１２只,实验组进行烧伤后ＢＭＳＣ移植,体外分离培养得到ＢＭＳＣ,制备中度角膜碱烧伤模型,随后行ＢＭＳＣ移植。对照组不进行移植。分别于移植后３ｄ、１４ｄ、２８ｄ观察ＣＮＶ生长状态、计算ＣＮＶ面积、采用ＲＴ-ＰＣＲ检测角膜中基质金属蛋白酶-２（ＭＭＰ-２）和肿瘤坏死因子α（ＴＮＦ-α）的表达情况。结果　ＢＭＳＣ贴壁生长,呈长梭形,ＣＤ９０呈现高表达（表达率９７．９４％）,ＣＤ３１低表达（表达率０．１５％）。ＢＭＳＣ移植后２８ｄ时实验组角膜较对照组明显透亮,新生血管面积显著减小（Ｐ＜０．０５）。ＢＭＳＣ移植后１４ｄ、２８ｄ,实验组ＭＭＰ-２基因条带的灰度值均低于对照组（均为Ｐ＜０．０５）,实验组ＭＭＰ-２ｍＲＮＡ表达低于对照组且１４ｄ时差异最明显（Ｐ＜０．０１）。ＢＭＳＣ移植后３ｄ,实验组ＴＮＦ-α基因条带灰度值较对照组低,实验组ＴＮＦ-αｍＲＮＡ的表达明显受到抑制,且两组间差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）;１４ｄ时,实验组ＴＮＦ-α基因表达仍低于对照组（Ｐ＜０．０５）,２８ｄ时实验组与对照组ＴＮＦ-αｍＲＮＡ表达量相当,差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。结论　ＢＭＳＣ通过抑制ＭＭＰ-２的表达,减少细胞外基质的溶解,抑制ＣＮＶ的形成;通过降低炎性细胞因子ＴＮＦ-α的表达,减轻局部炎症反应,从而抑制ＣＮＶ的生长。     

间充质干细胞在角膜重建中的应用研究进展

角膜重建指的是各种外伤、炎症、变性性疾病引起的角膜上皮损伤、新生血管形成、角膜瘢痕等损伤之后,角膜结构完整性及角膜透明性的恢复。目前角膜重建的基础研究中,间充质干细胞逐渐成为研究的热点。本文对间充质干细胞在角膜重建中作用及进展予以综述,将为角膜重建的深入研究提供一定的参考资料。     

骨髓间充质干细胞移植治疗眼表损害的初步实验研究

目的观察体外培养的人骨髓间充质干细胞（hMSCs）移植到碱烧伤的兔角膜表面后,干细胞的成活、迁移和分化情况。方法采用NaOH溶液制作兔角膜碱烧伤模型,1个月后将培养有hMSCs的羊膜缝合到碱烧伤的兔角膜表面,以羊膜作为对照组,在裂隙灯显微镜下观察角膜的临床改变。术后1个月,摘除眼球,石蜡切片,苏木素-伊红（HE）染色观察角膜组织结构的变化,并进行抗人核抗体和细胞角蛋白12（CK12）的免疫组化染色以观察hMSCs的分布和分化情况。结果兔眼碱烧伤1个月后,角膜表面和基质层均可见大量血管,角膜呈瓷白色混浊,表面粗糙干燥,出现大量杯状细胞。hMSCs移植1个月后,角膜表面粗糙程度减轻,新生血管略有减少,但是角膜混浊未见明显改善,角膜表面杯状细胞消失;角膜表面和基质浅层存在抗人核抗体染色阳性的细胞;角膜表面细胞CK12染色阳性,而基质层未见CK12阳性细胞。对照组在羊膜移植1个月后,角膜状况较移植前无明显改善,角膜表面仍可见杯状细胞,角膜各层均未见抗人核抗体和CK12染色阳性的细胞。结论hMSCs移植到碱烧伤兔角膜表面后,能够成活并向角膜基质迁移,未发生移植排斥反应。hMSCs由于所在部位不同,可以在周围组织的诱导下向不同方向发生分化,角膜表面的细胞向角膜上皮细胞分化。而基质层中的细胞未分化为角膜上皮细胞。移植后角膜表面结膜化程度有所减轻。     

羊膜移植对碱烧伤大鼠角膜缘干细胞的影响

目的观察羊膜移植对碱烧伤大鼠角膜缘干细胞的影响。方法SD大鼠40只制作眼碱烧伤模型,单眼行眼碱烧伤;随机选取20只大鼠（20眼）为实验组,20只大鼠（20眼）为对照组;实验组行新鲜羊膜移植,对照组不处理,观察大鼠眼表情况。并于术后1周、2周、3周、4周取角膜缘组织,采用免疫组化技术观察p63蛋白在角膜缘干细胞的表达情况。结果p63在实验组和对照组的角膜缘干细胞中均有表达,位于角膜缘上皮细胞基底层的细胞核内。但实验组明显高于对照组,两者比较有统计学意义（P〈0．05）。且随着烧伤时间的延长,p63的表达呈线性下降趋势。结论眼碱烧伤后行羊膜移植,能促进角膜缘干细胞的增生、分化,利于角膜上皮的修复。     

碱烧伤诱导兔部分性角膜缘干细胞失代偿模型

目的：探讨诱导兔部分性角膜缘干细胞失代偿(limbal stem cell deficiency,LSCD)动物模型的一种新方法。

方法：分别采用C57小鼠和新西兰白兔制作完全性和部分性角膜缘干细胞失代偿动物模型。小鼠(n=30)采用1mol/L氢氧化钾溶液浸泡的滤纸片(直径3mm)置于左眼中央角膜表面30s,随后用生理盐水冲洗。白兔(n=19)切除瞬膜(第三眼睑)后,采用1mol/L氢氧化钾溶液浸泡的滤纸片(直径5mm)置于左眼颞上方角膜表面30s,随后用生理盐水冲洗。烧伤眼术后采用0.5%盐酸左氧氟沙星滴眼液4次/d。烧伤前、烧伤后第1、2、4wk,2mo采用裂隙灯显微镜观察、摄像,记录角膜溃疡、穿孔等并发症。术后2mo采用印迹细胞学检测角膜杯状细胞分布,根据裂隙灯显微镜检查所见和角膜印迹细胞学检查判断LSCD严重程度。术后2mo处死动物,角结膜切片观察角膜新生血管、杯状细胞分布。意外死亡动物不计入总数,计算并比较完全性LSCD和部分性LSCD的模型诱导成功率。

结果：30只小鼠中6只意外死亡,2只于烧伤后出现角膜穿孔,其余22只发生完全性LSCD,诱导成功率92%,烧伤后2mo小鼠角膜可见新生血管广泛分布于角膜浅层及深基质层,病理切片可见角膜新生血管。19只白兔,7只意外死亡,其余12只发生不同程度LSCD(部分性LSCD,平均累及1.17±0.39个象限),未发生角膜穿孔情况,诱导成功率100%(P=0.543)。正常角膜区域无杯状细胞,LSCD区域角膜上皮印迹细胞学PAS染色可见杯状细胞,平均密度58.60±12.58个细胞/HP。

结论：中央角膜碱烧伤可以诱导产生完全性LSCD,部分动物会因为角膜溃疡穿孔而导致模型诱导失败,LSCD往往比较严重,且合并深层角膜新生血管。颞上方角膜碱烧伤可以诱导产生部分性LSCD,合并较少的角膜病变,角膜新生血管位于浅层。     

新鲜羊膜移植对碱烧伤大鼠角膜缘干细胞增殖效应的影响

目的：观察新鲜羊膜移植对碱烧伤大鼠模型角膜缘干细胞增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达的影响。

方法：SD大鼠40只40眼制作眼碱烧伤模型; 随机选取20只20眼行新鲜羊膜移植为实验组,对照组为不处理的烧伤模型眼。于术后1,2,3,4wk取角膜缘组织,采用免疫组化技术观察PCNA在角膜缘干细胞的表达情况。

结果：PCNA在实验组和对照组的角膜缘干细胞中均有表达,位于角膜缘上皮细胞基底层的细胞核内,但羊膜移植组显著高于对照组,两者比较有统计学意义(P<0.05); 羊膜移植术后1,2,3,4wk时PCNA蛋白在角膜缘干细胞的表达不一致,呈线性趋势,1wk达到高峰,以后逐渐降低。

结论：眼碱烧伤后行羊膜移植术可促进角膜缘干细胞的增殖表达,利于角膜上皮的修复。     

干细胞与角膜眼表重建研究进展

角膜是眼表的重要防护屏障和光学系统的重要组成部分,其完整性和透明性是实现有效视功能的重要前提。各种原因造成的眼表疾病未经及时有效治疗都有可能发展到终末阶段———角膜缘干细胞功能障碍,包括角膜缘干细胞数目的减少和微环境的病理改变。自体角膜移植无疑是治疗角膜缘干细胞功能障碍最有效的方法。但是供体角膜来源十分有限,且切除健眼组织行角膜移植可能会对健眼造成长期损害。随着干细胞研究的不断深入和组织工程技术的兴起,组织工程角膜应运而生,并且迅速发展。其基本原理为选用生物性能良好的支架材料,体外模拟角膜缘干细胞微环境,诱导各类种子干细胞分化为角膜类上皮,然后再行角膜眼表重建。常用种子细胞包括角膜缘干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞、骨髓间充质干细胞、皮肤干细胞、口腔黏膜干细胞。本文就上述干细胞在角膜眼表重建中的应用作一综述。     

兔角膜碱烧伤后角膜基质注射脐带间充质干细胞的疗效

目的　观察角膜基质注射脐带间充质干细胞（ｕｍｂｉｌｉｃａｌｃｏｒｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ,ＵＭＳＣｓ）治疗兔角膜碱烧伤的效果。方法　健康新西兰大白兔随机分为３组,每组１２只,每只兔左眼为角膜碱烧伤模型眼。Ａ组兔左眼在碱烧伤２ｄ后角膜基质内注射含有２×１０６个ＵＭＳＣｓ的磷酸盐缓冲液２μＬ,Ｂ组注射相同剂量的磷酸盐缓冲液,Ｃ组为角膜碱烧伤后未进行处理组,在注射后不同时间对角膜混浊程度、新生血管生长情况、角膜上皮缺损情况等进行临床观察并评分,同时进行综合评分。结果　注射后１４ｄＡ组新生血管生长较Ｂ组明显缓慢,Ａ组、Ｂ组注射隧道周围角膜新生血管生长评分分别为０分、２分,差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。注射后２ｄ和６ｄＡ组角膜混浊程度较Ｂ组明显轻,注射后２ｄＡ组、Ｂ组角膜混浊程度评分分别为２分、４分,注射后６ｄ评分与２ｄ相同,差异均具有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）。注射后２ｄ、７ｄ角膜上皮荧光素染色评分各组之间差异均无统学意义（均为Ｐ＞０．０５）。结论　碱烧伤后角膜基质注射ＵＭＳＣｓ可减少新生血管的形成,为抑制碱烧伤后角膜血管化提供参考,碱烧伤后角膜基质注射ＵＭＳＣｓ可在一定程度上恢复角膜透明度。     

复合自体脂肪干细胞的脱细胞猪角膜基质移植治疗兔角膜碱烧伤

目的:研究复合脂肪干细胞的脱细胞猪角膜基质对碱烧伤角膜的治疗效果。方法:制备晾干的脱细胞猪角膜基质,取第3代体外培养的兔自体脂肪干细胞,体外种植到脱细胞猪角膜基质上,培养3d后用于板层角膜移植。结果:板层角膜移植2mo后,术眼角膜基本恢复透明,未发生排斥反应,新生血管较少,3mo后新生血管基本消退。结论:复合自体脂肪干细胞的脱细胞猪角膜基质对兔碱烧伤角膜具有良好的修复能力。     

左旋肉碱促进碱烧伤后角膜上皮修复的作用及机制

目的：探讨在角膜碱烧伤所致高渗和炎症环境中,左旋肉碱(LC)对角膜上皮修复的作用及其调控的分子机制。

方法：将96只健康C57/6J小鼠随机分为空白对照组、磷酸缓冲盐溶液(PBS)组和LC组,空白对照组不做任何处理、LC组及PBS组制备急性碱烧伤模型。自模型制作前1d,LC组给予60mmol/L LC滴眼液,PBS组给予磷酸缓冲盐溶液连续每天点眼,每天6次。建模后0h,3、7d裂隙灯显微镜下荧光素钠染色观察角膜上皮修复情况。在第3d,取眼球进行冰冻切片免疫荧光检测Ki-67、IL-1β蛋白表达情况; 提取角膜上皮全蛋白进行Western blot检测P63、NLRP3、Caspase-1的表达及STAT3的活化水平。

结果：角膜荧光素钠染色结果显示在碱烧伤后3、7d时PBS组与LC组比,残留角膜上皮缺损面积占原始缺损面积的百分比分别为(29.38±6.83)% vs(17.78±4.11)%、(14.23±4.51)% vs(4.10±2.10)%(P<0.01)。LC组比PBS组角膜上皮修复快。造模后3d,与空白对照组比,碱烧伤处理的各组小鼠角膜上皮中焦亡相关蛋白NLRP3、Caspase-1表达上调,P63表达降低,p-STAT3/STAT3水平升高,除cleaved Caspase-1空白对照组vs LC组,差异均有意义。与PBS组比,LC组的NLRP3、pro Caspase-1、cleaved Caspase-1蛋白表达降低,P63表达量上调,p-STAT3/STAT3水平升高,差异均有意义。免疫荧光显示,碱烧伤后3d,PBS组和LC组与空白对照组比IL-1β、Ki-67表达上调。与PBS组比,LC组Ki-67蛋白表达上调,IL-1β表达降低。

结论：LC可通过抑制细胞焦亡信号通路,促进STAT3信号通路的活化,促使小鼠角膜上皮干/祖细胞增生,进而促进碱烧伤后角膜上皮的修复。     

Corneal surface reconstruction using adult mesenchymal stem cells in experimental limbal stem cell deficiency in rabbits

Purpose: To investigate the ability of mesenchymal stem cells (MSC) to transdifferentiate to corneal epithelial cells in experimental limbal stem cell deficiency in rabbits. Methods: Total limbal stem cell deficiency was produced in 21 right eyes of 21 New Zealand rabbits; 6 eyes served as controls (group 1, G1). After removal of the conjunctival overgrowth, five eyes received amniotic membrane transplantation (AMT; G2). In four eyes, autologous limbal stem cell transplantation from the healthy eye was performed with AMT (G3). In another six eyes, enriched autologous MSC were injected under the amniotic membrane (AM) (G4). Within 280 days, corneoscleral discs were analysed for goblet cells, cytokeratin (CK) 3/12, connexin 43, β₁‐integrin, CK 19, α‐enolase, p63 and ATP‐binding cassette transporter subtype G‐2 (ABCG‐2) distribution patterns. Results: Cultivated MSC were positive for CK 3/12 and α‐enolase, but negative for ABCG‐2, p63 and connexin 43. On rabbit corneas, CK 3/12 was expressed in all corneal regions in all groups, but with significantly different intensities. Among all other parameters, expression levels of ABCG‐2, β₁‐integrin and connexin 43 were significantly different between the transplanted groups and the control group. After a mean follow‐up time of 172 (47–280) days, goblet cells were rarely present in the central cornea (G1‐4). Conclusion: CK 3/12 is not highly specific for differentiated corneal epithelium. Further, goblet cells are not a reliable marker for conjunctivalization in rabbits. Expression of ABCG‐2, β₁‐integrin and connexin 43 after mesenchymal stem cell transplantation may indicate their ability to maintain their stem cell character or to transdifferentiate to epithelial progenitor cells.     

骨髓间充质干细胞与角膜损伤修复的研究现状

骨髓间充质干细胞是一种主要存在于骨髓中具有自我更新和多向分化潜能的干细胞.目前大量国内外研究证实,骨髓间充质干细胞可以分化为角膜上皮细胞、角膜内皮细胞、角膜缘干细胞,并对眼表损害的修复有重要作用.本文旨在总结骨髓间充质干细胞在角膜损伤修复的基础研究和临床治疗等方面的研究进展.