一种简易的制备感受态大肠杆菌细胞的新技术

本文报道了一种制备和贮存感受态大肠杆菌细胞的新技术。该方法具有简单、省时、稳定、重复性好及转化率高等优点。所制备的感受态细胞,可用于转化和转染;对于空质粒和重组质粒,具有同样的转化效果。     

快速准确制备大肠杆菌高效感受态细胞中有关OD600值的探讨

目的 探讨在不同转速下大肠杆菌OD600值与时间的关系,为能快速而准确的制备高效感受态细胞提供OD600值的量化标准.方法 在不同转速下每隔一定时间测定大肠杆菌OD600值.结果 总结了不同转速下OD600值在0.3～0.4所需时间段,并且用此时间段培养的细菌制备的感受态细胞的转化效率可高达(6.45±0.05)×107转化子/μgDNA.结论 用此法制备的感受态细胞完全可以满足大部分在质粒中进行的常规克隆的需要.     

大肠杆菌感受态细胞制备方法及应用的研究进展

在分子生物学日益普及的今天 ,基因操作已成为一项重要的常规技术。体外连接的DNA重组体导入合适的受体细胞便能大量地复制、增殖和表达 ,从而得到大量的重组基因。其中尤以转化为主。目前可以通过两种方法得到大肠杆菌感受态细胞的储存物 :第一种是通过商业途径购买冻存的感受态细胞 ,其转化效率十分可靠 ,一般可以达到10 8的转化子 /μg质粒DNA ,但是相当昂贵 ,通常选择的是自制感受态细胞的储存物。因此 ,感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节 ,其制备质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。本文旨在对近年来国内外制…     

两种感受态细胞制备方法的比较

从方法学上对氯化钙与甘油-聚乙二醇法制备JM105感受态细胞进行了比较。常规氯化钙法制备的细胞感受态仅维持3d（4℃条件下），而甘油-聚乙二醇法制备细胞其感受态可维持180d以上（-30℃条件下）。且两种方法制备的感受态细胞存放16h时其转化率分别为（6．42±0．06）×108和（1．73±0．03）×1010。     

氯化铷法制备感受态细胞

目的 研究氯化铷法制备感受态细胞的转化效率和不同条件对其的影响。方法 采用氯化铷法制备感受态细胞，用不同的质粒进行转化。分析不同菌种、冻存时间对转化效率的影响，并与通常所使用的氯化钙法进行转化效率的比较。结果 氯化铷法制备感受态细胞可用于不同的质粒的转化，对于同一种质粒，不同的菌种和冻存时间对转化效率无影响，其转化效率高于氯化钙法。结论 氯化铷法制备感受态细胞是一种可以长期保存而不影响转化效率的方法。     

感受态细胞的快捷制备和转化

在分子生物学实验技术体系中 ,感受态细胞的制备和转化是基本的实验操作。目前 ,氯化钙法感受态细胞的制备和转化 ,由于相对简便和重复性好 ,得到广泛地应用 ,但该方法还不够快捷。一步法感受态细胞的制备和转化虽然快捷 ,但所用的ＰＥＧ335 0和ＤＭＳＯ远非ＣａＣｌ2 那样廉价易得。基于对感受态细胞的制备和转化原理的理解 ,我们对传统的氯化钙法进行了大胆地改进 ,使感受态细胞的制备和转化更加快捷 ,为实验者节省了宝贵的时间。本文对此进行介绍 ,以利于同行参考和使用。1　材料与方法1 1　感受态细胞的制备用接种环沾取甘油保存的ＤＨ5…     

快速高效质粒转化方法的研制

0引言质粒转化是分子生物学最常规的方法之一．质粒转化方法主要有：高压电穿孔法转化大肠杆菌（电转化法），氯化钙法制备感受态细胞的大肠杆菌转化法．电转化法转化效率高，每微克DNA可以得到10’个～10‘’个转化体．但要求一套特殊的仪器．CaCI。法不需要特殊的仪器，操作较为简便，每微克DNA可以得到5X10’个～2X10’个转化体，可以满足常规的克隆需要，已为实验室广泛采用［’j．但标准的质粒转化方法整个过程需要1．sh，操作繁琐．为此我们对质粒转化方法进行改进，建立了一种快速、高效，可以在5min内完成一次质粒转化的方法．…     

大肠埃希菌质粒氨基糖苷类耐药基因分布及多态性研究

目的 通过大规模测序研究临床分离的大肠埃希菌的质粒基因组所携带的氨基糖苷类耐药基因分布及其多态性.方法 收集4年临床分离非重复的320株大肠埃希菌.菌株分为两个部分,碱裂解法提取全部质粒,Solexa测序获得大规模的短序列.采用比较基因组学和分子进化方法分析两个样本所含的氨基糖苷类耐药基因类型及丰度的差异,研究氨基糖苷类耐药基因存在的核苷酸多态位点.结果 测序法获得两批数据,E1短序列总数为11 077 768,可以定位到参照序列上为71 528（0.646%）.E2短序列总数为9 377 792,可以定位到参照序列上是49 944（0.532%）.两个样本中共有9个氨基糖苷类耐药基因型,strB基因最多,其次是strA、aacC2.两个样本中9个氨基糖苷类耐药基因共发现67个单核苷酸多态性（SNPs）位点,约50%为非同义突变.同一个位点的A、G二核苷酸多态现象常见.结论 此次样本中大肠埃希菌质粒上分布多种氨基糖苷类耐药基因.存在着大量的SNPs.     

大肠埃希菌质粒型AmpC酶基因的检测分析

目的 调查大肠埃希菌质粒型Ampc酶基因的存在状况。方法 采用MH药敏平板对40株临床分离的大肠埃希菌进行抗菌药物敏感试验和ESBLs纸片法确诊,PcR方法检测DHA和ACT-1型Ampc酶基因。结果 40株大肠埃希菌呈多重耐药,20株ESBLs阳性菌AmpCM基因阳性率90％,20株ESBLs性菌Ampc酶基因阳性率45％,40株大肠埃希菌ACT-1和DHA基因阳性率分别为57．5％,40．0％,有12株大肠埃希菌同时携带ACT-1和DHA基因。结论 临床分离的大肠埃希菌多重耐药严重,质粒型AmpC酶基因携带率高。     

从大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中检出质粒介导的AmpC DHA-1型β内酰胺酶基因

目的 了解产质粒介导AmpC酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的耐药性和基因型.方法 收集2002年1月-2004年5月间我院呼吸科临床标本中分离的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌共110株,用酶提取物三维试验检测AmpC酶;用等电聚焦电泳、耐药质粒电转化试验、聚合酶链反应(PCR)及测序确定AmpC酶基因型.结果 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中AmpC酶检出率分剐为9.30%和4.48%.药敏试验显示产酶株对头孢西丁全部耐药,对第三代头孢菌素、酶抑制剂、氨曲南、阿米卡星及环丙沙星均有不同程度耐药,对头孢吡肟及亚胺培南较敏感.7株产AmpC酶菌株中有5株通过电转化试验可将头孢西丁耐药性传递给受体菌,经PCR扩增和测序证实为质粒介导DHA-1型AmpC酶.结论 我院临床分离的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中已经出现产质粒介导AmpC酶菌株,其耐药性能够水平传播,给临床抗感染治疗带来重大威胁.     

温度诱导模式对重组大肠杆菌质粒拷贝数的影响

对于大肠杆菌温度表达系统,温度的选择和变化对外源基因的表达至关重要,最直接的因素表现在对质粒拷贝数的影响上。本文通过重组大肠杆菌DH 5α表达载脂蛋白A I-M ilano来分析不同温度诱导模式对质粒拷贝数的影响,确立了二次升温诱导(30°C→42°C→37°C→42°C)有利于菌体质粒拷贝数的增加,从而提高目的蛋白的表达量,结果表明:二次升温诱导比一次升温诱导蛋白表达量增加80%。     

致病性大肠杆菌和出血性大肠杆菌的研究进展

致病性大肠杆菌(EPEC)是导致婴幼儿腹泻的主要病原菌，特别在发展中国家。近期研究表明，EPEC病原与宿主细胞的作用可视为三个阶段。第一阶段，局限性的粘附在上皮细胞；第二阶段，产生分泌蛋白：第三个阶段，紧密粘附和受体蛋白的作用。一些出血性大肠杆菌侵袭人的肠上皮细胞也靠粘附和损伤作用。     

大肠杆菌yigP基因启动子的定位

在已知大肠杆菌yigP基因的最小功能片段为yigPP4P2基础上,将该片段装载于无外源启动子的载体质粒上,通过功能回补yigP基因缺陷株JDP14,发现其可以代替温敏质粒,保证大肠杆菌正常生长,推断其包含完整转录单元。RTPCR结果显示该片段内部有转录产物,即yigPP4P2片段具有转录独立性。将不同长度的yigPP4P2亚片段克隆到启动子探针质粒pSPZ上,通过对重组菌进行蓝白斑筛选及β半乳糖苷酶活性测定,结果显示pP40V3Z/JM83和pP40V4Z/JM83可观测到蓝色菌斑,并检测到较弱的β半乳糖苷酶活性,由此表明大肠杆菌yigP基因启动子位于该片段上游,下游边界位于引物V4区域内。     

从基因重组大肠杆菌分离纯化重组人白介秦－2

从ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＭ５２４８（Ｂｉｏ２７５ｃＩ８５７ＨＩ）中，经发酵培养，离心，超声破碎，溶解，二次凝胶过滤层析，复性处理及冷冻干燥，一次获得了３６ｍｇ较高纯度的重组人白介素－２。