肺癌组织p16基因启动子区甲基化的研究

DNA甲基化可以引起染色体结构、DNA构型和稳定性及DNA与蛋白质分子相互作用方式的改变，从而控制基因表达。研究发现，基因缺失和启动子区异常甲基化是p16基因失活的主要原因。我们联合应用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specific PCR，MSPCR)、逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫组化方法检测肺癌组织中p16基因的异常改变，以了解p16基因在肺癌发生发展中的作用。     

胃癌组织中p16基因的甲基化

运用甲基化特异性PCR(MSP)技术,对30例胃癌组织中p16基因的甲基化状况进行检测.发现胃癌组织中p16基因甲基化率为40.0%(12/30),而正常胃组织中未检测到该基因的甲基化;p16基因甲基化与患者年龄和性别无相关性,但与肿瘤的浸润和转移有关(P＜0.05).认为p16基因甲基化是胃癌组织中常见的分子生物学事件,可能参与了胃癌的发生、发展过程.     

胃癌患者p16基因启动子甲基化检测及其临床意义

目的 探讨p16基因启动子CpG岛甲基化在胃癌发生、发展中的作用.方法 应用特异性甲基化PCR(MSP)检测58例胃癌及癌旁组织和30例正常胃黏膜组织中p16基因启动子CpG岛的甲基化状态,分析其与胃癌临床病理参数的关系.结果26例(44.8％)胃癌组织、5例(8.6％)癌旁组织也检测出甲基化的存在,30例正常胃黏膜组织标本中均未检测出p16基因甲基化的存在(P ＜0.05);p16基因甲基化与胃癌淋巴结转密切相关(P＜0.05).结论 p16基因启动子CpG岛甲基化可促进胃癌的发生、发展;此基因的异常甲基化可作为胃癌早期诊断的敏感指标.     

p16基因高甲基化在胃癌发展中的作用

目的:通过检测胃癌、癌前病变和正常对照组中p16基因启动子区CpG岛甲基化水平及其表达,并结合临床病理资料,分析他们在胃癌发生、发展中的作用.方法:用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific PCR,MSP)检测41例胃癌组织、40例癌前病变组织和38例正常对照组织中p16基因启动子5′CpG岛甲基化;应用免疫组化检测基因的蛋白表达.结果:胃癌组织中p16基因甲基化阳性率为56.1%(23/41),癌前病变组织中为17.5%(7/40),而正常对照组织中为2.6%(1/38),前组与后两组之间的差异有显著性(P<0.05).胃癌组织中p16基因表达阳性率为51.2%,癌前病变组织中为90.0%,正常对照组织中为100.0%,前组与后两组之间的差异有显著性(P<0.05).低分化型胃癌组织中的p16基因甲基化阳性率明显高于高分化型(81.3%vs 40.0%,P<0.05).有淋巴结转移的胃癌组织中,p16基因甲基化阳性率与无转移组的差异有显著性(81.0%vs 30.0%,P<0.05).浸润深达浆膜层的胃癌组织中,甲基化阳性率与未达浆膜层组无统计学差异(60.0%vs 52.4%,P>0.05).胃癌组织中p16基因甲基化阳性组的蛋白表达阳性率显著低于甲基化阴性组(26.1%vs 83.3%,P<0.01).结论:胃癌组织中存在有p16基因启动子5′CpG岛高甲基化,并导致其基因表达率显著低于正常对照及癌前病变组织.p16基因的高甲基化与胃癌分化程度、淋巴结转移相关.p16基因甲基化的发生,从正常、癌前病变到胃癌有逐渐增加的趋势,提示其基因CpG岛高甲基化有可能作为诊断早期胃癌的一项较为敏感的指标.     

HBV X蛋白对抑癌基因p16的表达和启动子甲基化的影响

目的探讨HBV X蛋白(HBx)对抑癌基因p16的表达、p16启动子甲基化的影响,从表观遗传学的角度探讨HBx参与HBV相关性HCC发生发展的相关机制。方法以人肝母细胞瘤细胞Hep G2、表达绿色荧光蛋白(GFP)的Hep G2/GFP、稳定表达HBx蛋白的Hep G2/GFP-HBx细胞为实验系统;采用Western Blot法检测Hep G2、Hep G2/GFP、Hep G2/GFP-HBx细胞中p16蛋白的表达水平。以DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂5-氮杂-2'脱氧胞苷(5-Aza-2'-DC)处理Hep G2/GFP-HBx细胞,采用甲基化特异性PCR(MSP)法检测Hep G2、Hep G2/GFP细胞及药物处理和未处理的Hep G2/GFP-HBx细胞中抑癌基因p16启动子区域的甲基化情况。计量资料多组间比较采用单因素方差分析。结果 Western Blot分析示Hep G2/GFP-HBx细胞中p16蛋白相对灰度值(23.68±3.93)显著低于Hep G2(91.23±6.87)、Hep G2/GFP(94.55±8.40)细胞,差异均有统计学意义(P值分别为0.0007、0.0014),Hep G2/GFP与Hep G2细胞中p16蛋白相对灰度值差异无统计学意义(P0.05);MSP法检测示Hep G2/GFP-HBx细胞中存在p16基因启动子区域部分Cp G位点甲基化,Hep G2、Hep G2/GFP细胞中未检出其甲基化,DNMT抑制剂5-Aza-2'-DC处理的Hep G2/GFP-HBx细胞却能恢复p16基因启动子区域的未甲基化状态。结论在肝癌细胞系中,HBx通过诱导抑癌基因p16启动子甲基化而下调其表达,DNMT抑制剂5-Aza-2'-DC能恢复p16基因启动子区域的未甲基化状态,这种可逆性修饰可为HBV相关性HCC的治疗、预防提供新思路。     

胃癌形成过程中p16IN4a、Runx3和O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶基因甲基化及其表达研究

目的 研究胃癌形成过程中p16INK4a、Runx3和O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)基因启动子区的高甲基化状态,同时检测MGMT的蛋白表达情况.探讨抑癌基因启动子区高甲基化与胃癌发生的关系.方法 选择经透明帽法进行首次黏膜病变切除者43例,其中异型增生27例,早期胃癌16例.选择胃镜活检证实为慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生者14例.另取20例正常胃黏膜活检组织作为对照.采用甲基化特异聚合酶链反应(MSP)检测每例组织中p16INK4a、Runx3和MGMT基因启动子区的甲基化状态,对所有甲基化p16INK4a产物进行测序,免疫组化检测MGMT蛋白表达情况.结果 肠上皮化生、异型增生和早期胃癌中p16INK4a基因甲基化率依次为14.3%(2/14)、22.2%(6/27)和37.5%(6/16);Runx3基因甲基化率依次为14.3%(2/14)、48.1%(13/27)和50.0%(8/16);MGMT基因甲基化率依次为7.1%(1/14)、48.1%(13/27)和50.0%(8/16).20名正常对照均未检出基因甲基化,与异型增生和早期胃癌相比差异有统计学意义(P＜0.05).Runx3和MGMT两种基因在异型增生和早期胃癌中的甲基化率显著高于肠上皮化生组(P＜0.05).各组病变中三种基因甲基化联合分析发现,异型增生和早期胃癌中甲基化的基因种类高于肠上皮化生组.差异有统计学意义(P＜0.01).基因甲基化与息者年龄、性别、幽门螺杆菌感染以及病变部位无相关性,但p16INK4a和MGMT基因甲基化与血清癌胚抗原水平升高显著相关(P值分别为0.003和0.039).MGMT基因启动子区高甲基化与其蛋白失表达密切相关(χ2=12.821,P=0.001).结论 抑癌基因启动子区高甲基化是基因失活的主要机制,可能是胃癌发生的早期分子事件.p16INK4a、Runx3和MGMT基因启动子区高甲基化在胃癌形成过程中起着重要的作用.     

胰腺癌组织中p16基因启动子区5''CpG岛甲基化及其表达研究

在胰腺癌多步骤、多阶段发生过程中有多种肿瘤相关基因参与。p16基因是其中一个重要的抑癌基因，参与细胞周期的调控，控制细胞的生长和分化。大量研究表明，多种肿瘤细胞中p16基因通过突变、缺失、高甲基化等方式失活，造成p16蛋白功能丧失，从而导致肿瘤细胞恶性生长。免疫组化研究发现，胰腺癌组织中p16蛋白失表达的比例很高，而关于胰腺原发瘤中p16基因甲基化改变及其临床病理意义的研究报道少见，本研究旨在探讨胰腺癌组织中p16基因启动子区5’CpG岛甲基化情况及其与P16蛋白表达的关系和临床意义，研究其在胰腺癌发生中的可能机制。     

幽门螺杆菌感染与胃癌组织p16基因变异的关系

目的：探讨幽门螺杆菌（Hp)感染与胃癌组织p16基因变异的关系。方法43例胃癌患者的新鲜癌手术标本、相应的癌旁正常组织及血清标本为本组研究对象,分别采用PCR及银染PCR－SSC癌组织p16基因的纯合性缺失及突变情况;幽门螺杆菌感染状况通过PCR及血清学试验确定。结果（1）43例胃癌中,Hp阳性30例,阳性率为69．77％,其中CagA阳性24例,阳性率为80％。（2）30例Hp阳性胃癌中,有12例发生p16基因变异,发生率为40％;13例Hp阴性胃癌中,4例p16基因发生变异,发生率为30．77％,Hp阳性组与阴性组相比较p16基因变异率差异无显著性（P＞0．05）。（3）30例Hp阳性胃癌中,CagA阳性与阴性组p16基因变异率分别为41．67％（10．24）及33．33％（2／6）,两组变异率比较差异无显著（P＞0．05）。结论Hp及CagA阳性Hp感染与胃癌组织p16基因变异无显著相关性,Hp感染可能不是其改变或必须因素。     

原发胃癌中p16基因及其甲基化状态、表达异常的研究

目的：检测胃癌组织中p16基因及启动了甲基化状态和p16蛋白表达情况。方法：选择p16基因及启动子区域,用PCR－SSCP、MSP（甲基化特异的PCR）法、测序和免疫组化等方法对100例胃癌患者的癌组织和癌旁组织进行检测。结果：71％的病例p16表达阴性,54％的病例具有p16基因启动子区的高甲基化,50％的病例同时有p16表达阴性和p16基因启动子区的高甲基化,无突变和纯合缺失检出。结论：提示p16基因启动子区域高甲基化是胃癌中p16基因失活的主要原因。     

p16基因甲基化与早期肺癌

肺癌是全球最常见的恶性肿瘤，也是近年来发病率最高的恶性肿瘤，并且已经成为人类疾病死亡的重要原因之一。据估计，2000年在欧洲大约有375000人患肺癌，因此而死亡347000人，其中男性280000人，女性67000人。我国是吸烟和人口大国，虽无统计数据但可以推测发病率和死亡率应该更高。依细胞类型不同，肺癌患的5年生存率亦     

p16基因甲基化联合检测在肺癌诊断中的意义

目的 探讨检测外周血血浆、痰液、支气管肺泡灌洗液(BALF)、胸腔积液以及活检组织中p16基因启动子异常甲基化对肺癌诊断的临床意叉.方法 利用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)方法检测2007年4月至2008年5月柳州市第三人民医院收治的67例怀疑肺癌患者的外周血血浆、痰液、BALF、胸腔积液以及活检组织中p16基因的甲基化状态.结果 42例确诊肺癌患者p16基因异常甲基化阳性例数在胸腔积液、活检组织、BALF、血浆和痰液中依次为10例(71.4%)、26例(61.9%)、25例(59.5%)、22例(52.4%)和20例(47.6%),各个标本的阳性率差异无统计学意义(P>0.05);25例确诊良性病变患者中除在血液、活检标本和胸腔积液中各检测到1例异常甲基化外,其余标本中均未检测到p16基因的异常甲基化,两组比较差异有统计学意义(P<0.05).联合不同标本检测p16基因甲基化能提高肺癌的诊断阳性率,以3～4个标本联合检测较好(P<0.05).结论 MSP方法检测外周血血浆、痰液、BALF、胸腔积液以及活检组织中p16基因启动子的甲基化状态,对肺癌具有辅助诊断价值;联合不同标本检测p16基因甲基化能提高肺癌诊断的敏感性.     

特异性PCR法检测胰腺癌p16基因甲基化改变

目的：探讨胰腺癌p16基因启动子区5'CpG岛甲基化改变的特点及其与临床病理特征的关系。方法：应用甲基化特异性PCR法进行甲基化检测。结果：14／36例胰腺癌标本的p16基因启动子区5'CpG岛检测到甲基化，甲基化频率为38．9％，5例癌旁组织、1例正常胰腺组织、7例慢性胰腺炎及2例胰腺粘液性囊腺瘤未发现相应区域的甲基化。结论：p16基因启动子区5'CpG岛甲基化是胰腺癌p16基因失活的机制之一，是胰腺癌细胞区别与正常细胞的分子事件。检则p16基因甲基化可能有助于胰腺癌的诊断及鉴别诊断。     

Comparison of serum aberrant methylation and conventional tumor markers in gastric cancer patients

BACKGROUND/AIMS: This study was designed to compare a methylation-specific polymerase chain reaction (MSP) assay for three genes [p16, E-cadherin, and retinoic acid receptor beta (RARbeta)] and conventional serum tumor markers using blood samples from gastric cancer patients. METHODOLOGY: Preoperative blood samples obtained from 63 consecutive patients with gastric cancer were subjected to MSP and conventional serum marker assays. RESULTS: MSP assay detected hypermethylation of p16 in 17 patients (27%), E-cadherin in 15 patients (24%), and RARbeta in 11 patients (17%). Altogether, 32 patients (51%) showed hypermethylation in serum samples. By contrast, only 21 (33%) patients exhibited elevations of serum carcinoembryonic antigen or carbohydrate antigen 19-9. There was no correlation between MSP results and conventional tumor markers. CONCLUSIONS: The detection rate for MSP was higher than that of conventional tumor markers in serum of gastric cancer patients. Both assays can serve as complementary markers that allow for selection of cases requiring more intensive screening or aggressive postoperative treatment.     

An inverse correlation between Interleukin-6 and select gene promoter methylation in patients with gastric cancer

BACKGROUND: Both serum IL-6 levels and CpG island methylation have been shown to have prognostic significance in gastric cancer, it was suggested that an important link existed between IL-6 and methylation of cancers. AIM: To investigate the prognostic value of IL-6 serum level and the association between serum IL-6 levels and CpG island methylation at p16, DAPK, MGMT and E-cadherin in patients with gastric cancer. PATIENTS AND METHODS: Methylation status was assessed by MSP in 75 surgical specimens of gastric adenocarcinoma. IL-6 serum levels were measured by chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA). RESULTS: Methylation of p16, DAPK, MGMT, and E-cadherin were present in 53, 48, 32, and 59% of patients. Patients with tumors methylated at p16 and DAPK had lower serum levels of IL-6 compared to unmethylated tumors (1.8 vs. 4.8 pg/ml, p = 0.01 for p16; 1.5 vs. 6.2 pg/ml, p = 0.0001 for DAPK). But there was no difference with MGMT and E-cadherin methylation status. Serum IL-6 levels were also associated with TNM stage (p = 0.001), depth of tumor invasion (p = 0.002), lymphatic invasion (p = 0.01), vascular invasion (p = 0.008), metastasis (p = 0.002) and signet cell histology (p = 0.001). Conclusion: IL-6 is of prognostic value for patients of gastric cancer. Low serum IL-6 levels were associated with p16 or DAPK gene methylation in patients with gastric cancer.     

胃癌组织中E—cadherin基因启动子异常甲基化状态观察

目的观察胃癌组织中E—cadherin基因启动子异常甲基化状态。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）技术检测54例胃癌及其癌旁正常组织中的E—cadherin基因启动子异常甲基化状态,并分析E-cadherin基因启动子异常甲基化状态与胃癌临床病理参数的关系。结果胃癌组织中的E-cadherin基因启动子异常甲基化发生频率为48．10％（26／54）,明显高于癌旁正常组织中的11．11％（6／54）。E—cadherin基因启动子异常甲基化频率与胃癌分化程度、病理类型、浸润深度以及淋巴结转移、临床分期有关（P均〈0．05）。结论胃癌组织中E-cadherin基因启动子异常甲基化频率较高,并与胃癌浸润、转移有关。     

Metastatic suppressor genes inactivated by aberrant methylation in gastric cancer

AIM： TO screen out the differentially methylated DNA sequences between gastric primary tumor and metastatic lymph nodes, test the methylation difference of gene PTPRG between primary gastric tumor and metastatic lymph nodes, and test the regulatory function of 5-aza2-deoxycytidine which is an agent with suppression on methylation and the level of methylation in gastric cancer cell line. METHODS： Methylated DNA sequences in genome were enriched with methylated CpG islands amplification （MCA） to undergo representational difference analysis （RDA）, with MCA production of metastatic lymph nodes as tester and that of primary tumor as driver. The obtained differentially methylated fragments were cloned and sequenced to acquire the base sequence, which was analyzed with bioinformatics. With methylation-specific PCR （MSP） and RT-PCR, methylation difference of gene PTPRG was detected between primary tumor and metastatic lymph nodes in 36 cases of gastric cancer. Methylation of gene PTPRG and its regulated expression were observed in gastric cancer cell line before and after being treated with methylation-suppressive agent. RESULTS： Nineteen differentially methylated sequences were obtained and located at 5＇ end, exons, introns and 3＇ end, in which KL59 was observed to be located at 9p21 as the first exon of gene p16 and KL22 to be located at promoter region of PRPRG. KL22, as the probes, was hybridized with driver, tester and 3-round RDA products respectively with all positive signalsexcept with the driver. Significant difference was observed in both methylation rate of gene PTPRG and PTPRG mRNA expression rate between primary tumor and metastatic lymph nodes. Demethylation of gene PTPRG, with recovered expression of PTPRG mRNA, was observed after gastric cancer cell line being treated with methylation-suppressive agent. CONCLUSION： Difference exists in DNA methylation between primary tumor and metastatic lymph nodes of gastric cancer, with MCA-RDA as one of the good analytical methods. Significant