体外定向诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞向许旺细胞样细胞分化的研究

目的  探讨体外定向诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)向许旺细胞样细胞转化的有效方法。 方法  分别进行成年大鼠许旺细胞原代培养和BMSC分离培养。根据诱导方法不同, 分为化学诱导组和共培养诱导组。采用显微镜观察许旺细胞和BMSC的生长情况, 分别采用免疫荧光化学染色法[检测神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体和S-100抗体等许旺细胞标志蛋白]和流式细胞术鉴定两种细胞; 显微镜下动态观察两组细胞的形态和生长情况; 共培养诱导组共培养3 d后, 化学诱导组诱导作用4 h、1 d后分别采用免疫荧光化学染色的方法评估两组细胞的诱导分化情况。 结果  化学诱导组诱导后的细胞发生了明显的许旺细胞样细胞形态改变, 预诱导4 h后即出现GFAP抗体表达阳性, 维持诱导1 d后, GFAP抗体阳性表达率为(80.9±3.5)%, S-100抗体阳性表达率为(59.0±1.1)%。诱导2 d后分化细胞开始出现脱落死亡, 3 d后大部分分化细胞脱落死亡。共培养诱导组共培养3 d后, 被诱导的BMSC未出现类似化学诱导组明显的细胞形态改变, GFAP抗体阳性表达率为(89.8±2.4)%, S-100抗体阳性表达率为(80.9±1.7)%。共培养诱导组S-100、GFAP抗体阳性表达率均高于化学诱导组, 差异均有统计学意义(均为P < 0.01)。 结论  共培养诱导法不仅对BMSC向许旺细胞样细胞定向分化具有明确的效果, 而且对BMSC的存活和增殖均有促进作用, 因此该法相对于化学诱导法更加安全和有效。     

丙戊酸钠对体外培养许旺细胞增殖及相关蛋白GAP-43、MAG和MBP表达的影响

目的 观察丙戊酸钠(VPA)对体外培养的大鼠坐骨神经许旺细胞的影响,探讨其促进周围神经再生的作用机制.方法 取SD幼鼠坐骨神经体外培养许旺细胞,应用免疫荧光技术鉴定许旺细胞纯度.将体外培养的许旺细胞分为实验组和对照组,分别给以含与不含VPA( 1.0 mmol)的血清培养液,处理后分别于0、12、24、36、48和72 h采用4-甲偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,免疫组化法检测雪旺细胞特异性蛋白(S-100)、生长相关蛋白(GAP-43)、髓鞘相关蛋白(MAG)和髓鞘碱性蛋白(MBP)表达,以及蛋白免疫印迹(Western blotting)法检测GAP-43、MAG和MBP表达.结果 与对照组相比,在24、36 h和48 h实验组许旺细胞增殖率显著增加,以48 h两组差别最为明显(P＜0.01);在24、36 h和48 h实验组GAP-43和MAG蛋白表达水平显著增加(P＜0.05);在36 h和48 h实验组MBP蛋白表达水平显著增加(P＜0.05).结论 临床使用剂量的VPA促周围神经再生的作用机制可能与其诱导许旺细胞增殖、上调GAP-43、MAG和MBP蛋白表达水平有关.     

脂肪干细胞体外诱导分化成神经细胞的研究

目的 观察脂肪干细胞( ADSCs)体外诱导分化成神经细胞的潜能,为恢复阴茎海绵体神经受损导致勃起功能障碍的研究建立基础.方法 取SD雄性大鼠脂肪组织进行原代培养.流式细胞仪检测ADSCs,体外诱导成脂肪细胞和神经细胞并进行鉴定.结果 ADSCs表面分子阳性率:CD44(+)96.4％、CD45(-)1.7％、CD34(-)0.9％.成脂细胞油红O染色脂滴染成红色.神经细胞荧光染色胶原纤维酸性蛋白(GFAP)、β-微管蛋白(β-tubulin)Ⅲ蛋白表达阳性,方法1[表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)+吲哚美辛、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)]和方法2(EGF、bFGF+吲哚美辛、胰岛素、IBMX)诱导率分别为(74.0±3.3)％、(65.3±2.1)％和(51.0±1.2)％、(41.0±1.1)％,且阳性细胞数差异有统计学意义(P＜0.01).结论 ADSCs在方法1作用下向神经细胞分化诱导率高,时间短;ADSCs可能成为治疗神经性勃起功能障碍的较理想干细胞.     

外源性TGF-β1及IGF-1诱导大鼠脂肪干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的探讨大鼠脂肪干细胞(ADSCs)的分离、培养、扩增方法及单层培养条件下外源性转化生长因子TGFβ-1和胰岛素样生长因子IGF-1诱导ADSCs向软骨细胞定向分化的可能性及两者的协同作用分析。方法取大鼠大网膜及肾周脂肪囊等处脂肪组织,酶消化法分离培养脂肪干细胞;免疫荧光测定CD29和CD44抗原的表达;分别用4组诱导培养基定向软骨方向诱导;诱导2周后细胞爬片行免疫荧光鉴定Collagen II表达;RT-PCR、Western blot对定向诱导后的细胞的表达进行检测。结果自大鼠脂肪组织中可分离出脂肪干细胞,体外生长形态类似成纤维细胞,可长期增殖,CD29和CD44抗原表达阳性,定向诱导后IGF-1组、TGFβ-1组及TGFβ-1 IGF-1组细胞可表现出软骨细胞的特性,TGFβ-1和IGF-1共同作用组软骨特异性基质的分泌明显高于单独诱导组。结论从大鼠脂肪组织中可分离出脂肪干细胞,生物学特性稳定,TGFβ-1和IGF-1均能定向诱导ADSCs向软骨方向分化,两者共同诱导时具有协同作用。     

脑源性神经营养因子基因修饰脂肪间充质干细胞治疗大鼠急性脊髓损伤

目的 观察脑源性神经营养因子(BDNF)基因修饰脂肪间充质干细胞(ADSCs)治疗大鼠急性脊髓损伤效果.方法 获取大鼠ADSCs细胞,观察其生物学特征,行溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记及腺病毒BDNF基因转染.将36只SD大鼠随机分为3组:脊髓损伤对照组(A)、ADSCs治疗组(B)及BDNF转染的ADSCs治疗组(C).在脊髓损伤部位行相应处理:A组植入明胶海绵;B组植入含3.0μl(3×1010/L) ADSCs的明胶海绵;C组植入含3.0μl(3×1010/L)转染ADSCs的明胶海绵.行为学评分及观察免疫荧光染色.结果 成功分离并培养ADSCs,可于体外稳定增殖.术后7、14、28 d,C组运动功能评分为(10.55±0.80、14.39 ±0.25、19.71 ±2.14)分,明显高于A组(5.35 ±0.68、7.93±0.45、10.78 ±1.18)分、B组(7.01 ±0.39、10.33±0.27、14.87 ±0.37)分.免疫荧光染色显示移植ADSCs脊髓组织内,均可见不同程度的分布有BrdU阳性标记细胞;荧光染色结果提示部分BrdU阳性的移植细胞同时呈胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性.结论 ADSCs在移植后能在宿主体内存活、迁移并分化.移植ADSCs之后,运动功能可见改善,证实ADSCs移植能改善中枢神经系统功能.     

不同方法诱导脂肪干细胞向神经元样细胞分化研究

目的 通过比较化学和生长因子两种不同诱导方法,观察评估脂肪干细胞(ADSCs)向神经元样细胞(NLCs)分化,并探讨诱导分化机制.方法 取SD大鼠腹股沟和腹膜后脂肪分离培养获得ADSCs,取其第3代细胞进行流式细胞表型鉴定(CD29、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105)并进行实验诱导.分为化学诱导组[DMEM/F12 +5 mmol/L β-巯基乙醇(β-BME)+2％二甲基亚砜(DMSO)+ 200 μmol/L丁酸酯羟基茴香醚(BHA)]和生长因子分步诱导组[第1步:DMEM/F12+20 μg/L表皮生长因子(EGF)+20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) +2％ B27;第2步:DMEM/F12+ 10 μg/L脑源性神经营养因子(BDNF)+ 10 μg/L胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)+1 μmol/L维甲酸(RA)].每天在光镜下观察其形态变化,并在第3天用免疫荧光法检测诱导后神经细胞特异标志物巢蛋白(Nestin)、神经元核蛋白(NeuN)、抗微管相关蛋白-2(MAP-2)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达,并行统计学分析.结果 流式细胞仪检测结果显示,第3代ADSCs细胞表型CD34(0.57％)、CD45(0.67％)、CD29(99.38％)、CD90(96.21％)、CD73(99.80％)和CD105(97.97％).化学诱导组在诱导24 h后即出现神经元样细胞形态,表达Nestin和MAP-2,但其诱导后形态在第5天出现逆转且在第7天有部分细胞开始死亡;生长因子诱导组诱导3d时Nestin表达,1周后MAP-2、Neun和GFAP表达逐渐增加,诱导生成稳定NLCs.结论 化学诱导ADSCs向神经元样细胞分化速度较快,但其性质不够稳定,形态出现逆转且伴随细胞死亡;生长因子法能够实现稳步诱导,诱导生成的NLCs更符合组织工程种子细胞的要求.     

与雪旺细胞共培养诱导脂肪来源干细胞向神经元样细胞分化的实验研究

目的探讨非接触共培养条件下,大鼠SCs对脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的诱导分化效应,为神经组织工程寻找理想种子细胞提供参考。方法取新生1~2 d SD大鼠双侧坐骨神经,酶消化法分离培养SCs,并行S-100免疫荧光染色鉴定。取成年雄性SD大鼠腹股沟和腹膜后脂肪组织,差速贴壁法纯化获得ADSCs并传代,流式细胞仪检测第3代细胞表型CD29、CD34、CD45、CD73、CD90和CD105。取原代SCs和第3代ADSCs按2∶1比例于Transwell共培养系统共培养(实验组),以单纯培养ADSCs作为对照组。倒置相差显微镜下观察细胞形态学改变,培养14 d流式细胞仪检测神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)表达,免疫荧光染色观察微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP2)、神经元核蛋白(neuronal nuclei protein,Neu N)和胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)神经元特异性标志物表达情况,并计算阳性细胞率。结果成功分离培养ADSCs并能连续传代,流式细胞仪检测示其高表达CD29、CD90、CD73和CD105,低表达CD34和CD45。倒置相差显微镜下见,实验组共培养后原本呈梭形的ADSCs以胞核为中心收缩,胞体折光性增强,胞体伸出多个长而粗的突起;对照组ADSCs形态无显著变化。流式细胞仪及免疫荧光染色示,共培养后14 d实验组均表达神经元特异性标志物NSE、MAP2、Neu N、GFAP,且阳性细胞率显著高于对照组(P0.01)。结论 SCs与ADSCs非接触共培养,两者不仅能够共生,且SCs能显著促进ADSCs向神经元样细胞分化。     

腺病毒介导的BMP-2基因诱导脂肪间充质干细胞向成骨细胞定向分化

目的探讨人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因通过腺病毒转染青山羊脂肪间充质干细胞(ADSCs)的可行性及其向成骨细胞定向分化的能力。方法取麻醉状态下青山羊腹股沟脂肪组织,经体外分离培养获得ADSCs,转染以腺病毒介导的人BMP-2基因。倒置相差显微镜观察细胞形态,MTT法检测ADSCs生长增殖情况,免疫细胞化学法对ADSCs细胞进行碱性磷酸酶(ALP)活性测定,SABC法检测ADSCsⅠ型胶原的表达,通过RT-PCR、Western blot法检测BMP-2基因的表达水平。结果转染人BMP-2基因的ADSCs形态规则;细胞生长速度快,且随培养时间的延长逐渐增多(P0.05);成骨诱导后,转染组细胞ALP活性和Ⅰ型胶原表达强度明显高于未转染组(P0.05);转染组ADSCs BMP-2基因m RNA水平和蛋白含量均明显强于未转染组(P0.05)。结论经腺病毒介导的人BMP-2基因转染的青山羊ADSCs在体外诱导培养中可以向成骨细胞定向分化,并保持较强的增殖能力;转染后细胞BMP-2目的基因表达增高。     

大鼠脂肪干细胞体外定向诱导为血管内皮细胞的研究

目的研究大鼠脂肪干细胞(Adipose-Derived Stem Cells, ADSCs)体外定向诱导分化为血管内皮细胞(vascular endothelial cells, VECs)的可行性.方法取SD大鼠腹股沟区脂肪组织获取ADSCs进行体外培养并检测其多向分化能力,取4代细胞在血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)诱导下向内皮方向分化,检测内皮细胞标志物血管性假血友病因子(Von Willebrand Factor, vWF)表达.结果 ADSCs在体外能迅速扩增,具有多向分化的能力.在 VEGF、bFGF 诱导下,ADSCs能迅速分化为VECs,大多数细胞vWF阳性表达,与阳性对照组相似.结论 ADSCs在特定诱导环境下可以分化为VECs,有望成为组织工程领域内治疗勃起功能障碍(erectile dysfunction, ED)新的种子细胞来源.     

骨髓基质干细胞定向分化为神经细胞及分化后细胞功能特征的研究

目的 探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)定向分化为神经细胞的潜能及分化后细胞的功能特征.方法 体外分离、扩增、纯化Sprague-Dawley大鼠BMSCs,取第6代细胞接种并随机分为4组,实验组A、B、C组开始每组加预诱导夜(含预诱导剂碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子),6d后A组继续加预诱导夜,其余两组在预诱导后加定向诱导剂(音猬因子和维甲酸)时选择是否保留预诱导液分为B组(保留)和C组(去除);D组不做任何干预,为空白对照组.采用细胞免疫荧光化学法检测分化后神经样细胞的形态和功能标志.结果 接种后的细胞迅速贴壁,加预诱导液6 d细胞增殖迅速,且可以观察到有类似神经干细胞的克隆团形成.在诱导剂的特定组合和时序的诱导下,A、B、C组均出现胞体收缩和突起伸出,呈现神经元细胞样改变.D组细胞形态基本没有变化.6～12 d,B组微管相关蛋白-2(MAP-2)阳性细胞率为59.17%±1.84%,胶质酸性蛋白(GFAP)阳性细胞率为22.10%±1.03%;C组MAP-2阳性细胞率为29.35%±4.85%,GFAP为36.35%±4.85%,A组和D组均未检测到上述细胞标志物.12～18 d,A组仅出现少量GFAP阳性细胞;B组MAP-2、GFAP阳性细胞率分别为72.54%±1.02%、21.54%±1.02%;C组MAP-2、GFAP阳性细胞率分别为31.02%±2.37%、23.45%±3.74%.神经细胞的功能标志胆碱乙酰转移酶、囊泡乙酰胆碱通道只有B组表达,12～18 d后阳性细胞率分别为45.11%±3.04%、28.22%±1.72%.结论 BMSCs在体外能定向诱导为具有一定功能的神经细胞,为脊髓损伤后细胞移植治疗奠定了基础.     

DNT细胞对肿瘤细胞作用的研究进展

DNT细胞(CD4-CD8-double-negative T cells)是新发现的一种免疫细胞,其特点是细胞表而既不表达CD4分子同时也不表达CD8分子.近年来,通过免疫疗法可以使肿瘤患者的愈后及生存质量得到很大的改善和提高.免疫细胞可以通过免疫调节或直接杀伤的途径作用于肿瘤细胞,因此研究DNT细胞对肿瘤细胞的作用将有重要意义.     

肿瘤干细胞与肝癌干细胞

肿瘤起源于干细胞的假说正在各种人类肿瘤中得到证实,肿瘤不单是一种基因病,而且是一种干细胞病,基因突变作用于干细胞,干细胞突变成为肿瘤干细胞,这是肿瘤发生、再生、转移和复发的关键。肝细胞癌是最常见的恶性肿瘤之一,其中是否存在“肝癌干细胞”的问题一直倍受人们关注。该文介绍肿瘤干细胞与肝癌干细胞的研究情况。     

骨髓间充质干细胞定向肝细胞样分化的研究

目的探讨骨髓间充质干细胞定向肝细胞样分化的诱导条件，为肝组织工程提供新的种子细胞来源。方法分离小鼠骨髓间充质干细胞，在特定肝细胞培养液中用肝细胞生长因子(HGF)和表皮细胞生长因子(EGF)定向诱导。在倒置显微镜下观察细胞形态。应用免疫荧光法鉴定细胞性质。结果骨髓间充质干细胞经HGF和EGF诱导7d后变为肝细胞样圆形；2周后免疫荧光染色可见分化后细胞表达肝细胞标志物CK18和白蛋白。结论骨髓间充质干细胞在特定条件诱导下可以向肝细胞方向分化。有可能作为肝组织工程的种子细胞来源。     

Dendritic cells

Dendritic cells (DC) are the most effective or 'professional' of the antigen-presenting cells (APC) that initiate primary immune responses. They are located at surveillance sites where they capture and process antigens. They then initiate and regulate T- and B-cell responses by expressing lymphocyte costimulatory molecules, migrating to lymphoid organs and secreting biologically active molecules. Dendritic cells not only activate lymphocytes to induce the immune response, but they also minimize autoimmune reactions by tolerizing T cells to self-antigens. Recent Phase I and II clinical studies have shown promise in the use of antigen-pulsed autologous DC for vaccination of cancer patients. Dendritic cells also have applications in preventing rejection after transplantation, immunization against viral infections and immunosuppression in autoimmune diseases.     

干细胞诱导分化为雄激素分泌细胞的研究进展

睾丸间质细胞是男性体内产生雄激素的主要细胞。干细胞可被诱导分化为具有雄激素分泌功能的睾丸间质样细胞,从而使其功能受到下丘脑与垂体调控,精确分泌维持生理功能需要的激素。故建立一套可靠高效的将干细胞诱导为雄激素分泌细胞的方法,对于治疗由于睾丸间质细胞异常引起的性腺功能低下意义重大。本文对近年来关于干细胞诱导分化为雄激素分泌细胞的研究进展予以综述。     

T cells and B cells in lupus nephritis

T and B lymphocytes play diverse roles at multiple stages in the development and progression of lupus nephritis. Disruption of T- and B-cell regulatory functions by environmental and genetic influences permits pathogenic effectors to emerge in disease. New insights into the biology of these multifunctional cells offer novel targets for intervention in lupus nephritis and systemic autoimmunity.     

Stem cells and progenitor cells in renal disease

Stem cells and progenitor cells are necessary for repair and regeneration of injured renal tissue. Infiltrating or resident stem cells can contribute to the replacement of lost or damaged tissue. However, the regulation of circulating progenitor cells is not well understood. We have analyzed the effects of erythropoietin on circulating progenitor cells and found that low levels of erythropoietin induce mobilization and differentiation of endothelial progenitor cells. In an animal model of 5/6 nephrectomy we could demonstrate that erythropoietin ameliorates tissue injury. Full regeneration of renal tissue demands the existence of stem cells and an adequate local "milieu," a so-called stem cell niche. We have previously described a stem cell niche in the kidneys of the dogfish, Squalus acanthus. Further analysis revealed that in the regenerating zone of the shark kidney, stem cells exist that can be induced by loss of renal tissue to form new glomeruli. Such animal models improve our understanding of stem cell behavior in the kidney and may eventually contribute to novel therapies.