人脐带组织间充质干细胞研究进展及应用前景

近年来对间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的研究越来越多,MSCs可以从骨髓、脂肪组织、肾和各种胎儿组织中提取,并能横向分化成成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞等不同胚层的细胞。人脐带组织间充质干细胞是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞,与其他来源的MSCs相比,具有来源广泛,易于采集、保存和运输,无异体排斥,避免伦理争议等诸多优点。本文就其生物学特征、优势以及临床应用前景等予以综述。     

骨髓间充质干细胞的生物学特性

从人骨髓中分离人间充质干细胞（ＭＳＣｓ）,台盼蓝拒染法测定细胞增殖状态,ＭＴＴ实验检测不同细胞因子对细胞增殖的影响。应用流式细胞学技术测定细胞周期及细胞表面抗原特征并观察细胞组织化学特点。结果：ＭＳＣｃ具有独特的表征,即ＣＤ２９,ＣＤ４４,ＣＤ１６６阳性,ＣＤ３４,ＣＤ４５,ＨＬＡ－ＤＲ和荆豆素阴性。细胞化学结果显示,几乎所有细胞酸性萘酚醋酸酯酶（ＡＮＡＥ）及糖原（ＰＡＳ反应）阳性,酸性磷酸酶（Ａ     

人脐带间充质干细胞的生物学特性、分化及应用研究

间充质干细胞是一类存在于多种组织、具有高度自我更新能力和多向分化潜能的细胞。由于作为间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）经典来源的骨髓组织,可随老化而致干细胞含量及其增殖能力显著降低^[1],而且其标本需要通过骨髓穿刺来获取,是一个侵袭性、有创伤、易污染的过程。因此,寻找新的MSC来源有着重要意义。     

脐带间充质干细胞与类风湿性关节炎

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种病因不明的慢性、消耗性、反复发作、以关节症状为主的自身免疫性疾病。多发于女性,其发病率国内尚无精确的统计,估计在1.08%左右,欧美国家的发病率约为0.5%～3.0%。典型的临床表现为反复发作的对称多发性小关节炎,以手、腕、足、膝等关节最常受累。早期可有红、肿、热、痛和关节功     

脐带间充质干细胞移植治疗糖尿病周围神经病变的疗效观察

目的观察人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUC-MSCs)移植治疗糖尿病周围神经病变的疗效。方法 32例糖尿病周围神经病变患者,经HUC-MSCs移植,分别于移植前、移植后1、3、6个月测血糖、餐后2 h血糖、糖化血红蛋白、TCSS评分及神经电生理检查,比较各指标改善情况并观察不良反应。结果 3次随访结果显示,空腹血糖、餐后2 h血糖、糖化血红蛋白、TCSS评分及神经电生理中的正中神经的运动末梢潜伏期、尺神经的感觉传导速度和运动末梢潜伏期,胫后神经感觉传导引出率、腓总神经的感觉传导引出率和运动末梢潜伏期均较移植前改善,且未见明显不良反应,以治疗后1个月疗效最明显,6个月内均有持续疗效。结论 HUC-MSCs移植可改善糖尿病周围神经病变的临床症状及神经电生理,是一个安全、有效的治疗糖尿病周围神经病变的新方法。     

脐带全层源间充质干细胞分离培养及向成软骨细胞分化的实验研究

目的从人脐带全层中分离培养间充质干细胞(MSCs),并进行成软骨诱导分化,为组织工程软骨和软骨损伤后修复提供种子细胞。方法采用胶原酶消化法从脐带全层中分离培养间充质干细胞,显微镜下观察细胞形态,细胞计数法绘制细胞生长曲线,采用流式细胞仪检测细胞周期及细胞表型,采用微团细胞培养在软骨诱导液中向软骨细胞分化,阿尔辛蓝及甲苯胺蓝染色检测细胞分化情况,RT-PCR法检测诱导后细胞表达聚集蛋白聚糖(ACAN)基因情况。结果人脐带全层来源的MSCs呈成纤维样形态漩涡状贴壁生长,细胞高表达HLA-I类分子、CD73、CD90、CD166及CD105,不表达CD34、CD45、CD14、CD31、CD80、CD86及HLA-DR。细胞诱导分化21d后,阿尔辛兰及甲苯胺蓝染色阳性;RT-PCR检测诱导后的细胞表达ACAN,而对照组无表达。结论人脐带全层为成体MSCs提供一种新而方便的来源,人脐带间充质干细胞(hucMSCs)体外培养能够向软骨细胞分化。     

人脐带间充质干细胞治疗早发性卵巢功能不全系统评价

目的 探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)对小鼠早发性卵巢功能不全(POI)治疗效果的影响。方法 利用计算机检索主要的医学相关中英文数据库,检索从建库至2023年6月的小鼠动物研究,再通过人工检索纳入研究中的参考文献以进一步确定其他符合条件的实验研究。两名研究者分别根据检索词对医学数据库进行独立检索及筛选、评估,使用SYRCLE偏倚风险工具评估动物研究的偏倚风险。所有统计分析均采用Review Manager 5.4软件。结果 共纳入9项研究。在POI小鼠模型中,与对照组比较,实验组采用hUC-MSCs可提高血清雌激素水平(均差=22.05,95%可信区间7.37～36.74,P<0.01)和抗苗勒管激素水平(均差=166.12,95%可信区间48.29～283.95,P<0.01),降低血清卵泡刺激素水平(均差=-2.77,95%可信区间-4.45～-1.10,P<0.01),增加初级卵泡数量(均差=11.02,95%可信区间10.56～11.47,P<0.01)和次级卵泡数量(均差=7.49,95%可信区间1.90～13.08,P<0.01),减...     

人脐带源间充质干细胞体外成脂、成骨、成软骨诱导分化

目的体外分离培养脐带来源间充质干细胞,确定其向脂肪、骨、软骨细胞的分化能力。方法取新鲜的脐带组织,剔除脐动静脉,剩余部分剪成极为细小的组织块,02%Ⅱ型胶原酶37℃静止消化17 h,用含10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基/Ham′s F12培养基终止消化,培养3~5 d后得到较为均一的贴壁细胞。取第3代细胞做流式检测,并定向诱导分化,14 d后成脂、成骨染色鉴定,21 d后取诱导分化的细胞团做冰冻切片,阿尔法蓝染色软骨鉴定。结果体外培养的间充质干细胞高表达CD29、CD13、CD90、CD105、CD44等间充质细胞标志物,不表达CD34、CD45、人类白细胞抗原DR等造血细胞标志物;诱导分化后油红O染色、冯库萨染色均为阳性,冰冻切片阿尔法蓝染色呈明显阳性。结论人脐带间充质干细胞在体外能够培养并定向分化为脂肪、骨、软骨细胞。     

人骨髓间充质干细胞体外分离培养、鉴定及标记

目的探讨人骨髓间充质干细胞(hMSCs)体外分离培养、鉴定和标记的方法以及生物学特性。方法无菌条件下穿刺人髂后上嵴抽取骨髓,采用直接贴壁法分离纯化hMSCs,体外扩增,用免疫细胞化学法及流式细胞仪分别对培养的hMSCs进行鉴定,同时检测第3代和同代溴脱氧尿嘧啶(5-bromo-2’-deoxyuridine,BrdU)标记的hMSCs细胞周期。结果体外培养的原代hMSCs在培养24小时内可见少量贴壁细胞,7天达到融合,免疫细胞化学示CD44和CDl05表达阳性,CD34表达阴性,流式细胞仪示CD44阳性率为89．64％,CD34为0．11％。大部分hMSCs核抗BrdU染色阳性,阳性率达90％。细胞周期显示第3代和同代BrdU标记的hMSCs约有90％的细胞处于G0／GI期,第10代为80％。结论hMSCs在体外很容易分离培养和扩增,但随着传代次数的增加,hMSCs变得宽大扁平且增殖速度减慢,出现衰老现象;用BrdU标记hMSCs对其细胞周期无明显影响,可作为标记细胞的一种有效手段。     

脐带间充质干细胞制剂的质量管理及有效性和安全性

在临床应用时,脐带间充质干细胞制剂的质量直接影响其安全性和有效性。在脐带间充质干细胞分离纯化、制剂制备、储存以及运输等环节,需要建立相应的质量标准、质量检测方法和质量管理流程,确保制剂中干细胞的数量、活性达到临床要求,并且不含有细菌、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病病毒、EB病毒、巨细胞病毒、人类嗜T淋巴细胞病毒、真菌、支原体、衣原体、梅毒螺旋体、寄生虫、内毒素等病原体以及其他未经批准用于临床的物质。脐带间充质干细胞可用于自身免疫性疾病、退行性疾病、衰老性疾病、遗传缺陷性疾病、放射性疾病、炎症、组织器官损伤等病症的治疗,并且具有明确的疗效。脐带间充质干细胞用于临床治疗是安全的,除极少数患者轻度腰部酸痛、头昏、头痛、发热外,无其他任何严重不良反应。但是,也有一些患者不宜进行脐带间充质干细胞治疗。     

人脐带Wharton胶中间充质干细胞的分离、培养与鉴定

目的研究人脐带Wharton胶中间充质干细胞(MSCs)的生物学特性。方法去除新鲜人脐带动静脉和脐带外膜组织,获得Wharton胶,分别采用酶消化法和组织块培养法获得脐带Wharton胶中的干细胞,通过细胞传代培养、生长曲线测定、活细胞鉴定进行细胞生长动力学研究,流式细胞仪分析细胞表面分子特点,组织化学和免疫组化染色鉴定软骨特征性标志物表达情况。RT-PCR检测Sox-9及Col-2A1mRNA表达情况。结果采用酶消化法可以快速分离Wharton胶中MSCs,且细胞迅速贴壁生长;组织块法培养获得种子细胞时间较长。流式细胞仪检测显示所获得的细胞表达CD44、CD105等MSCs标志物,HLA-ABC表达阳性,HLA-DPDQDR表达阴性。经过冻存复苏后免疫表型无显著变化。组织化学和免疫组化染色显示脐带Wharton胶MSCs弱表达软骨特征性标志。RT-PCR显示Wharton胶MSCs表达Sox-9和Col-2A1。结论人脐带Wharton胶MSCs不向造血系分化,且具有前软骨细胞的特性,有望作为软骨组织工程新型的种子细胞。     

体外连续传代培养脐带间充质干细胞染色体核型的稳定性

目的分析不同代次人脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stern cells,UC—MSCs）的染色体核型,初步评价UC—MSCs在体外连续传代培养过程中染色体结构的稳定性。方法采用胶原酶消化法分离UC—MSCs,贴壁培养传代,通过细胞形态、免疫表型及多向分化潜能等生物学特性进行鉴定,利用G显带分析第3、5、7代细胞的染色体核型。结果染色体核型分析显示,第3、5、7代UC-MSCs为正常二倍体核型,G显带未见染色体结构异常。,UC—MSCs呈成纤维样形态生长,高表达CD73、CD90、CDl05,不表达CD34、CIM5、CD40、CD80、CD86、CDl54、HLA—DR;在特定的体外诱导条件下可以向骨、脂肪、软骨分化。结论UC-MSCs在体外连续传代培养7代以内染色体结构稳定,为临床应用UC—MSCs的安全性提供了遗传学方面的实验依据。     

人脐带间充质干细胞来源的外泌体免疫调节功能异质性研究

目的 研究不同供者来源的人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)分泌的外泌体免疫调节能力的异质性.方法 培养5株不同供者来源的hUC-MSC,收集无血清培养上清提取外泌体,流式细胞术检测其表面特异性标志CD9、CD63、CD81、CD44的表达,BCA法测定总蛋白含量.将外泌体和脐带血单个核细胞(UBMC)共培养72 h,MTT实验检测细胞增殖活性, ELISA测定共培养上清中干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量.离心重悬UBMC和K562细胞按5∶1的比例共培养4 h,MTT实验检测细胞活性,计算UBMC的杀伤能力.结果 提取的外泌体表达CD9,CD63,CD81及CD44.不同供者来源hUC-MSC分泌的外泌体对UBMC的增殖、分泌细胞因子及K562细胞杀伤能力的作用不同.结论 不同供者hUC-MSC的外泌体免疫调节能力具有异质性.     

脐带间充质干细胞移植治疗脑瘫患儿流涎症疗效观察

 目的 探讨应用脐带间充质干细胞移植治疗脑瘫患儿流涎症的疗效。方法 25例脑瘫合并流涎症患儿被随机分入实验组和对照组。实验组每位患儿接受4次腰椎穿刺干细胞移植术,对照组不给予任何手术及药物干预治疗,实验组于移植前及移植后1、3、6个月进行流涎频率及严重程度评分(SF)、唾液称重(W)、流涎商测定(DQ)。对照组于入组时及入组后1、3、6个月分别行SF、W、DQ评定。结果 实验组与对照组相比较,实验组SF、DQ在术后1、3、6个月均明显低于对照组(P<0.05),差异具有统计学意义;SF指标显示术后1、3、6个月治愈率分别为61.54%、23.08%、23.08%;DQ指标显示术后1、3、6个月治愈率分别为69.23%、46.15%、23.08%;SF、DQ术后1、3、6个月有效率均为69.23%。W指标显示术后1、3个月,实验组明显低于对照组(P<0.05),差异具有统计学意义,术后1、3个月实验组治愈率分别为69.23%、38.46%,有效率均为69.23%;术后6个月实验组与对照组差异不具有统计学意义,但实验组患儿个体比较,术后6个月与术前相比治愈率为23.08%,有效率为69.23%。结论 脐带间充质干细胞移植可以显著改善脑瘫患儿流涎症,从而提高患儿生活质量。     

人脐带间充质干细胞来源的外泌体促进小鼠成骨前体细胞增殖与分化

 

目的 提取人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hucMSCs)来源的外泌体(hucMSC-exo),观察其对小鼠成骨前体细胞(mouse osteoblast progenitor cells, mOPCs)的作用。方法 体外分离培养hucMSCs,超速离心法收集外泌体;采用CCK8试剂盒检测不同浓度梯度hucMSC-exo对mOPCs增殖的影响,碱性磷酸酶活性检测以及茜素红染色观察不同浓度梯度hucMSC-exo对mOPCs矿化的影响。结果 成功提取hucMSCs,呈现旋涡状贴壁式生长,形态呈长梭形,具有多向诱导分化潜能。HucMSCs来源的外泌体呈圆形、椭圆形,大小在80 nm左右最多,阳性表达CD9,CD63。CCK8法结果显示5、10 μg/ml的hucMSC-exo可以显著地促进mOPCs在体外的增殖(P<0.05),碱性磷酸酶和茜素红染色结果发现5、10 μg/ml的hucMSC-exo组可以明显提高mOPCs碱性磷酸酶活性及钙化结节的形成,且10 μg/ml的外泌体浓度作用强于5 μg/ml,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 成功提取了hucMSCs及hucMSC-exo,hucMSC-exo可以以浓度依赖的方式促进mOPCs的增殖与成骨分化。

     

特定微环境诱导人脐带沃顿胶间充质干细胞向汗腺样细胞分化的实验研究

目的鉴定人脐带沃顿胶间充质干细胞(hUCWJ-MSCs)经汗腺诱导培养基培养后向汗腺样细胞分化的潜能。方法酶消化法分离培养人正常汗腺细胞,热休克汗腺细胞后收集培养基上清液,按10%的体积分数配制汗腺分化诱导培养基。酶消化法分离获取hUCWJ-MSCs,流式细胞仪分析细胞表型特征;成骨诱导培养基和成脂诱导培养基中培养2～3周后采用碱性磷酸酶染色和油红-O染色对其分化潜能进行鉴定;在汗腺诱导培养基中培养3周,倒置显微镜观察细胞形态变化,分别收集培养1、2、3周时的细胞,采用免疫组织化学和流式细胞术检测汗腺标记物CEA、CK14、CK19的表达,RT-PCR检测汗腺发育基因(EDA)的表达。结果正常汗腺细胞呈铺路石状克隆样增生。hUCWJ-MSCs呈梭形、成纤维细胞样,流式细胞分析显示其CD44、CD105、CD34、CEA阳性率分别为97.37%9、6.26%、0.56%0、.52%;经成骨诱导培养基和成脂诱导培养基培养2～3周后,可诱导成为油红-O染色阳性的脂肪细胞和碱性磷酸酶染色阳性的骨细胞;在汗腺诱导培养基中培养3周后,细胞具有类似汗腺样结构,免疫组织化学DAB显色结果显示分化后的hUCWJ-MSCs表达汗腺细胞标记物CEA、CK14、CK19,流式细胞仪检测其阳性率分别为54.37%、60.25%、62.13%,RT-PCR结果显示其可较高水平地表达EDA基因。结论 hUCWJ-MSCs具有向汗腺样细胞分化的潜能。     

成人骨髓间充质干细胞培养上清对人脐血间充质干细胞体外培养及扩增的支持作用

目的：研究人骨髓间充质干细胞培养上清对人脐带血（HUCB）中所含有间充质干细胞（MSCs）的影响。方法：取脐带血，肝素抗凝，Percoll淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，低糖DMEM培养获得贴壁细胞层。与人骨髓间充质干细胞培养上清共孵育。流式细胞仪检测表面抗原。结果：脐带血的单个核细胞与人骨髓间充质干细胞培养上清共孵育经体外培养贴壁后出现形似纤维状细胞形态并表达与MSCs相关的抗原（CD13，CD44，CD71，CD166）。但不表达造血细胞抗原（CD34，CD45），这与源于骨髓的MSCs一致。结论：人脐血间充质干细胞与骨髓间充质干细胞培养上清共孵育，对脐血间充质干细胞体外分离培养及扩增有支持作用。     

脐带间充质干细胞鞘内移植治疗不完全性颈髓损伤的疗效和安全性

 目的 评估脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSCs)移植治疗不完全性颈髓损伤的疗效和安全性。方法 对39例不完全性颈髓损伤患者进行4次鞘内UC-MSCs移植术, 术前及术后6个月应用美国脊髓损伤协会(American Spinal Injury Association, ASIA)制定的神经功能评分标准、日常生活活动能力评分标准(Barthel指数评分),对患者移植前后运动、感觉功能、肌张力及日常生活活动能力的改善情况进行评估。记录治疗期间的不良反应。结果 干细胞移植后6个月,患者感觉、运动功能、肌张力及日常生活活动能力,与术前相比均具有统计学差异,其中运动功能方面改善最为明显,ASIA评分治疗前61±22,治疗后70±18。均未发生术区感染、脑脊液漏、中枢神经系统感染等并发症,但有6例(15.4%)于术后24 h内出现发热,3例(7.7%)术后出现低颅压症状,2例(5.1%)术后出现腰部及下肢疼痛、麻胀感。结论 UC-MSCs鞘内移植可以改善不完全性颈髓损伤患者的感觉、运动、二便及自主神经功能等多方面的神经缺失症状,疗效较理想且安全。