HPLC-ELSD法测定杜仲中绿原酸和鹅掌楸苷

目的 研究脱落酸（ABA）和赤霉素（GA）相关的6个基因（NCED、CYP707A、ABI2、PP2C、GA20ox2、GA20ox3）在滇重楼种子休眠解除过程中的表达特点。方法 分别选取20 ℃层积和20 ℃转4 ℃层积处理后处于不同休眠解除阶段的滇重楼种子为材料,应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法分析不同层积处理后6个基因在胚和胚乳中的表达水平。结果 在滇重楼种子层积过程中CYP707A、NCED、GA20ox2、GA20ox3和ABI2基因在胚和胚乳中表达有差异,而PP2C表达水平无明显变化规律;CYP707A在低温层积后表达水平显著高于高温层积,尤其是在胚中,而NCED、GA20ox2、GA20ox3和ABI2在高温和低温层积后均有较高的表达水平,且在胚中的表达水平高于胚乳中。结论 所筛选出的NCED、CYP707A、ABI2、GA20ox2、GA20ox3基因参与滇重楼种子休眠解除过程,可以作为研究滇重楼种子休眠过程的重要基因。     

变温层积对解除滇重楼种子休眠及其内源激素变化的研究

目的 研究滇重楼种子破休眠的方法及其内源激素水平变化规律。方法 以变温层积处理的滇重楼种子为材料,利用高效液相色谱法（HPLC）测定种胚发育过程中植物激素赤霉素（GA）、吲哚乙酸（IAA）、脱落酸（ABA）量的变化与种子胚率的关系。结果 变温层积处理可在3个月内打破滇重楼种子休眠,其GA量显著升高,ABA量显著下降。结论 内源激素ABA和GA在滇重楼种子休眠与萌发过程中起着重要的作用。     

丹参酮ⅡA 对大鼠细胞色素 P450 酶的诱导作用

目的 研究丹参酮Ⅱ_A对大鼠细胞色素 P450 酶的诱导作用。方法 丹参酮Ⅱ_A 7、20、60、180 mg/(kg·d) 4 个剂量组,雄性 SD 大鼠连续 ig 7 d,取肝脏组织,应用体外“cocktail”方法,反转录-聚合酶链反应,免疫印迹杂交方法分别检测 CYP450 酶活性、基因表达和蛋白表达的变化。结果 丹参酮Ⅱ_A能显著诱导 CYP1A2 及 CYP2E1 的活性以及基因、蛋白表达,且呈剂量依赖性;高剂量组能增强 CYP2C19 的活性,但对基因、蛋白表达没有影响;对包括 CYP3A1 在内的其他亚型没有影响。结论 丹参酮Ⅱ_A对大鼠多种 CYP450 亚型有诱导作用。     

三七种子后熟过程中内源激素的动态变化

目的 通过对三七种子后熟过程中内源激素变化规律的研究,探索内源激素在种胚发育进程和休眠解除中的作用机制,为三七种子的处理和种源保存奠定基础。方法 采用酶联免疫法（ELISA）对三七种子后熟过程中的内源激素赤霉素（GA）、吲哚乙酸（IAA）、玉米素核苷（ZR）和脱落酸（ABA）进行动态测定。结果 三七种子后熟过程中,内源GA、IAA和ZR的量随种胚的发育进程而增加,而ABA的量则减少。结论 激素平衡的变化是解除三七种子休眠、促进萌发的决定因素之一。     

甘草次酸-丹参酮IIA复方脂质体处方优化及制备工艺研究

目的 研究甘草次酸（GA）-丹参酮II_A（Tan II_A）复方脂质体（GT-Lip）的制备工艺。方法 以大豆卵磷脂（SPC）和胆固醇（Ch）为膜材,薄膜分散探头超声法制备GT-Lip。通过单因素考察确定水合温度和探头超声功率,正交设计法优化处方工艺;低速离心法测定脂质体中GA与Tan II_A包封率,动态光散射粒径仪测定脂质体粒径与Zeta电位,透射电镜测定脂质体形态。结果 优化处方工艺为SPC-Ch质量比6∶1,SPC-Tan II_A物质的量之比30∶1,SPC-GA物质的量之比24∶1,水合温度为30 ℃,探头超声条件为380 W超声5 min;制备得到的GT-Lip中Tan II_A、GA的包封率分别为（81.50±0.76）%、（98.63±0.90）%（n＝3）,平均Zeta电位为（?19.00±0.98）mV（n＝3）,平均粒径为（120.5±1.62）nm（n＝3）。结论 优化的GT-Lip制备工艺稳定可行。     

西伯利亚白刺种子休眠和萌发特性研究

目的 探寻破除西伯利亚白刺种子休眠的方法,提高其发芽率。方法 采用温水催芽、低温沙藏、98%浓硫酸、GA等不同方法对种子进行处理后的发芽试验,测定发芽率、发芽势、到达发芽高峰期的时间。结果 温水催芽的发芽率和发芽势分别为30%和10%,种子7 d开始萌动,10 d达到发芽高峰。低温沙藏37 d的发芽率和发芽势分别为55.5%、26.5%,种子2 d开始萌动,10 d达到发芽高峰。低温沙藏95 d的发芽率和发芽势分别为86.8%、60.3%,种子2 d开始萌动,7 d达到发芽高峰。98%浓硫酸处理2 h的发芽率和发芽势均为90%,种子1 d开始萌动,4 d达到发芽高峰。98%浓硫酸处理2 h后播种在MS＋0.5 g/mL GA＋0.5 g/mL BA的暗培养基上,发芽率和发芽势均为98.1%,种子1 d开始萌动,4 d达到发芽高峰。结论 西伯利亚白刺种子休眠属种壳休眠,98%浓硫酸处理2 h后接种于MS＋0.5 g/mL BA＋0.5 g/mL GA的暗培养基上培养,打破硬实种子休眠效果最好,发芽率最高。     

滇重楼环阿屯醇合酶基因的克隆及序列分析

目的 获取滇重楼甾体皂苷合成途径关键酶环阿屯醇合酶基因（PpCAS）的全长cDNA序列,并进行序列分析。方法 利用同源克隆和RT-PCR技术获得PpCAS基因保守片段,采用RACE技术获得PpCAS基因的3’及5’末端序列,并采用生物信息学方法进行序列分析。结果 PpCAS基因全长cDNA为2 309 bp,其开放阅读框（ORF）为2 283 bp,可编码760个氨基酸的蛋白质;PpCAS推导的蛋白质相对分子质量为8.69×10⁴,等电点（pI）为6.54;其氨基酸序列与GenBank中其他植物CAS的同源性在60%～83% PpCAS蛋白。结论 从滇重楼中首次获得PpCAS基因cDNA全长序列,该基因具有CAS同源基因的典型特征。     

滇重楼皂苷成分体内外抗肺癌活性研究

目的 研究滇重楼皂苷成分滇重楼总皂苷、滇重楼皂苷Ⅰ、薯蓣皂苷元的抗肺癌活性。方法 以小鼠肺腺癌细胞株 LA795 及其宿主近交系 T739 荷瘤小鼠为研究模型，采用 MTT 法检测滇重楼总皂苷、滇重楼皂苷Ⅰ和薯蓣皂苷元的细胞毒活性，荷瘤小鼠实验检测抑瘤率、组织病理形态变化及瘤细胞转移情况。结果 MTT 结果显示滇重楼总皂苷、滇重楼皂苷Ⅰ和薯蓣皂苷元对 LA795 细胞生长有很强的抑制作用，其 IC₅₀ 分别为 24.33 μg/mL, 1.85、149.75 μmol/L；各受试药物高剂量组对 T739 荷瘤小鼠抑瘤率分别为 41.82%、29.44%、33.94%；滇重楼总皂苷给药组可不同程度抑制肿瘤细胞的肺转移和肝转移。结论 滇重楼总皂苷成分在体外、体内皆有强的抗肺癌作用。     

羌活种胚后熟过程中内源激素的动态变化

目的阐述羌活种胚后熟过程中内源激素与种胚发育和休眠解除的关系。方法激素测定用HPLC法,外标法定量,质量分数以μg/100 g表示。结果羌活种胚后熟过程中,玉米素(Z)有2个高峰和2个低谷,第1个峰值出现在层积20 d时,第2个峰值出现在层积100 d时;第1个低谷出现在层积70 d时,第2个低谷出现在层积150 d时。吲哚乙酸(IAA)层积20 d时出现高峰,层积100 d和层积150 d时没能检测到。脱落酸(ABA)的变化和IAA相似,不同在于层积220 d未完成生理后熟和层积220 d发芽的种子中都不能检测到ABA的量。赤霉素(GA3)的量比其他激素高很多,出现2个峰值,第1个出现在层积20 d,第2个出现在层积150 d时;完成生理后熟种子中的GA3量比未完成生理后熟种子中的高。结论层积20 d后Z、IAA、ABA和GA3量的增加启动了羌活种胚的发育。Z能促进羌活种胚的发育和萌发。GA3可能对打破羌活种子休眠没有直接的作用,但是能促进种胚的生长。层积中后期没有检测到ABA的量,ABA可能不是羌活种子萌发的主要抑制物质。     

维甲酸诱导基因I对氧固醇7α羟化酶的调控作用研究

【立论依据】 基因芯片结果显示,敲除维甲酸诱导基因I(RIG-I)的小鼠体内氧固醇7α羟化酶(下文称CYP7B1)基因水平发生变化,说明两者存在慢反应联系,本实验目的旨在探究这两个基因之间是否存在直接调控的快反应联系。 【设计思路】 本实验首先需要对基因芯片的结果进行确定,随后通过多种方式改变RIG-I的表达水平(干扰素刺激、质粒转染等),观察CYP7B1是否存在明显的协同表达变化。如果能确定两者之间确实存在直接调控关系,将进一步探究调控的具体机制,从分子水平阐释调控的环节。 【实验内容】 利用real-time PCR检测基因芯片结果;利用IFNγ上调RIG-I表达水平,并运用real-time PCR检测CYP7B1的表达水平变化;构建载有RIG-I基因的质粒并进行质粒转染,运用real-time PCR和蛋白质印迹法检测CYP7B1的基因表达和蛋白表达变化情况;转染RIG-I promoter,探究其调控CYP7B1的具体机制。 【材料】 细胞:293T细胞、Hela细胞、HepG2细胞等;其他:RIG-I、CYP7B1引物、一抗、二抗及其他常规所需试剂。 【可行性】 预实验中已经确定了RIG-I与CYP7B1间存在慢反应调控关系,同时也确定了相关文献中IFN-γ对RIG-I的上调作用,实验器材、试剂齐备。 【创新性】 本实验首次提出RIG-I基因与CYP7B1及其所参与的脂代谢过程有调控关系,对胆固醇代谢、神经甾体代谢、及CYP7B1缺乏所引起的一系列疾病的研究也可以提供一定的实验依据和理论支持。     

RP-HPLC法测定固公果中蔷薇酸和委陵菜酸

目的：利用RP-HPLC方法测定彝族药物固公果中蔷薇酸、委陵菜酸的量。方法：采用Ultimatex B-C₁₈（美国Welch公司,150 nm × 4.6 mm,5 μm）色谱柱,以甲醇-1.5%磷酸水溶液（33︰67）为流动相,体积流量1.0 mL/min,检测波长210 nm。结果：固公果中蔷薇酸与委陵菜酸能得到很好的分离。测定线性范围分别为：蔷薇酸77.4～774.3 μg/mL,r＝0.999 9;委陵菜酸54.7～546.9 μg/mL,r＝0.999 9。蔷薇酸平均回收率为102.5%（n＝9）,委陵菜酸平均回收率为103.7%（n＝9）。结论：该法便捷、灵敏、准确,重复性好,可以控制该药材的质量。     

HPLC法同时测定杜仲皮中京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷和松脂醇二葡萄糖苷

目的 HPLC法同时测定杜仲皮中京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷4种有效成分的量,为更好控制杜仲皮质量提供依据。方法 采用Kromasil C₁₈柱（200 mm×4.6 mm,5 μm）,乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）梯度洗脱,0～7 min,7% A;7～35 min,14% A;35～45 min,15% A。体积流量1.0 mL/min,检测波长235 nm,柱温30 ℃。结果 在该色谱条件下,京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷分别在0.102 5～0.512 5（r＝0.999 9）、0.092 5～0.462 5（r＝0.999 9）、0.120 0～0.600 0（r＝0.999 6）、0.090 0～0.450 0 μg/mL（r＝0.999 8）内与色谱峰峰面积呈现良好的线性关系,加样回收率分别为98.97%、98.71%、98.20%、100.44%,RSD分别为1.54%、1.30%、0.76%、1.13%。结论 该分析方法快速准确、重现性好,可为杜仲药材的质量控制与标准的完善提供可靠的检测依据。     

HPLC法测定还阳参药材中绿原酸

目的 建立高效液相色谱法测定还阳参药材中绿原酸的方法。方法 采用Sino Chrom DDS-BP色谱柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）,流动相为乙腈-0.4%磷酸水溶液（13∶87）,体积流量1.0 mL/min,检测波长327 nm,柱温25 ℃。结果 绿原酸进样量在0.046～0.644 μg与峰面积呈良好的线性关系（r＝1）,样品平均加样回收率为101.9%,RSD值为1.22%（n＝6）;检出限和定量限分别为0.01 ng和0.04 ng。结论 此方法简便、准确、重复性好,可用于还阳参药材的质量控制。     

刺老苞根皮黄酮类化合物对维甲酸致大鼠骨质疏松的影响

目的 研究刺老苞根皮黄酮类化合物对维甲酸致大鼠骨质疏松的影响。方法 将60只大鼠随机分成对照组,模型组,刺老苞根皮黄酮类化合物高、中、低剂量（10、20、30 mg/kg）组和仙灵骨葆胶囊（20 mg/kg）阳性对照组,每组10只。各组以ig维甲酸70 mg/kg造模后,各给药组分别ig给予相应药物,每日1次,连续8周。取血清检测相关生化指标,进行骨组织切片检查和骨生化指标检测,测定股骨长度、宽度及质量。结果 与对照组比较,模型组大鼠股骨质量、尺骨羟脯氨酸（Hyp）和骨钙的量明显降低,胫骨骨髓腔中脂肪组织增多（P＜0.01）,血浆胆固醇（TC）水平升高、碱性磷酸酶（ALP）和高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-C）水平降低（P＜0.01）。与模型组比较,刺老苞根皮黄酮类化合物各剂量组能有效增加骨质量和提高骨质的量（P＜0.01）,减少骨髓腔中脂肪的量,升高ALP和HDL-C的量（P＜0.01）。结论 刺老苞根皮黄酮类化合物可有效对抗维甲酸引起的大鼠骨生长抑制及骨丢失。     

总藤黄酸亲水凝胶骨架片制备与体外释放度考察

目的 研究总藤黄酸亲水凝胶骨架片体外释药速率的影响因素并考察其体外释放特性。方法 以藤黄酸（GA）释放度为考察指标,采用单因素试验法,考察填充剂用量、黏合剂类型、制备方法、压片压力和转速对药物体外释放行为的影响,并采用正交试验设计对处方进行优选,确定最佳制备工艺条件。结果 以羟丙基甲基纤维素（HPMC K₁₅M）为骨架材料,预胶化淀粉和乳糖为填充剂,制备了12 h缓释片。该制剂2 h释放约35%,6 h释放约65%,10 h释放约85%,12 h释放约95%,满足缓释片释放要求。结论 本方法制备的总藤黄酸缓释片外观及可压性良好,具有良好的释放性能。且工艺简单易行,生产成本低。     

斑唇马先蒿化学成分的研究

目的 研究斑唇马先蒿Pedicularis longiflora var. tubiformis的化学成分。方法 采用正相硅胶柱色谱、反相RP₁₈硅胶柱色谱、凝胶柱色谱方法进行分离纯化,利用理化性质及波谱数据分析鉴定化合物结构。结果 从斑唇马先蒿的乙醇提取部位中分离得到20个化合物,分别鉴定为正二十六烷醇（1）、正三十六烷醇（2）、正三十九烷醇（3）、β-谷甾醇（4）、己二烯二酸（5）、肉桂酸（6）、对甲酰基肉桂酸（7）、β-胡萝卜苷（8）、芹菜素（9）、刺槐素（10）、木犀草素（11）、金圣草黄素（12）、苜蓿素（13）、东莨菪素（14）、1-羟基呫吨酮（15）、木犀草素-5-O-β-D-葡萄糖苷（16）、荭草苷（17）、槲皮素- 4′-O-D-半乳糖（18）、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷（19）、毛蕊花苷（20）。结论 化合物1～8、10、14～18和20均为首次从该植物中分离得到。     

大鼠灌服炙甘草汤后甘草次酸药动学研究

目的 建立大鼠ig炙甘草汤后体内甘草次酸的LC-MS/MS测定方法。方法 采用醋酸乙酯沉淀蛋白处理血浆样品,选用白藜芦醇为内标,采用LC-MS/MS法测定,色谱条件为ORBAX SB-C₁₈反相色谱柱（Agilent,50 mm×2.1 mm,1.8 μm）,乙腈-水（80∶20,含0.2%甲酸）为流动相,体积流量0.2 mL/min,柱温30 ℃。样品经电喷雾离子（ESI）源负离子化后,通过Agilent 6410三重四级杆串联质谱仪,采用多反应监测（MRM）对甘草次酸进行测定,分别选用m/z 469.4→425.4和227.1→143.0作为甘草次酸和内标物白藜芦醇的检测离子对。结果 甘草次酸在33.4～8 560.0 ng/mL线性关系良好（R²＝0.997 1）,日内（n＝6）、日间（n＝6）精密度、稳定性RSD均小于10%。甘草次酸高、中、低3个质量浓度平均提取回收率分别为75.3%、78.2%、78.5%。在此方法下得到大鼠ig炙甘草汤后血浆中甘草次酸的药动学参数分别为t_max＝（8.00±1.13）h,C_max＝（811.02±300.25）ng/mL,AUC_0～24＝（11 439.21±3 367.36）ng/mL·h。结论 该方法灵敏、准确、快速、选择性高,可用于甘草次酸血药浓度监测和药动学研究。     

长药隔重楼化学成分研究

目的 研究长药隔重楼Paris polyphylla var. pseudothibetica根茎中的化学成分,为阐明其有效成分及扩大重楼属植物的药用资源提供科学依据。方法 利用正相硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20、正反相制备色谱等手段进行分离纯化,并通过¹H-NMR、¹³C-NMR、ESI-MS等波谱技术进行结构鉴定。结果 从长药隔重楼中分离得到了12个化合物,分别鉴定为：薯蓣皂苷元（1）、薯蓣皂苷元-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷（2）、偏诺皂苷元-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷（3）、偏诺皂苷元-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷（4）、偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷（5）、β-谷甾醇（6）、豆甾醇（7）、胡萝卜苷（8）、豆甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（9）、山柰酚（10）、β-蜕皮激素（11）、蔗糖（12）。结论 化合物1～9为首次从该植物中分离得到。     

土茯苓内生芒果球座菌的次级代谢产物及其抗肿瘤活性研究

目的 研究土茯苓内生芒果球座菌Guignardia mangiferae的次级代谢产物及其抗肿瘤活性。方法 采用硅胶柱、反相硅胶柱、凝胶柱和制备薄层色谱等色谱技术进行分离纯化,通过现代波谱技术进行结构鉴定;以神经胶质瘤细胞SF-268、乳腺癌细胞MCF-7、大细胞肺癌细胞NCI-H460为供试细胞株,采用SRB法对化合物进行体外抗肿瘤活性研究。结果 从土茯苓内生芒果球座菌的100 L液体发酵提取物中分离得到12个化合物,经波谱数据分析鉴定其中10个化合物,分别为15-hydroxyl tricycloalternarene 5b（1）、guignardiaene D（2）、guignardiaene C（3）、guignardone A（4）、guignardone B（5）、3-(4-甲苯氧基)-丙酸（6）、2, 4-壬二醇（7）、麦角甾酮（8）、酪醇（9）、对羟基苯甲醛（10）。杂合萜类化合物1～5对SF-268细胞具有选择性的抑制作用,化合物6、7对MCF-7细胞具有选择性的抑制作用。结论 化合物6～10均为首次从该属真菌中得到,其中化合物6、7为新的天然产物。     

药用杭菊扦插育苗技术研究

目的 探索适合杭菊扦插繁殖的条件。方法 考察质量浓度分别为250、500、750、1 000 mg/L的吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）对杭菊2个不同部位的插穗扦插的影响。结果 嫩梢和茎段扦插的生根数分别为13.63和5.96,根系效果指数分别为3.13和1.4。采用激素处理过的插条生根效果显著好于对照,其中以750 mg/L IBA处理后的生根效果最好,生根效果指数为17.8。结论 本研究为杭菊的扦插繁殖提供参考。