两种叶酸偶联物的合成及体外靶向性研究

合成叶酸偶联物并将其应用于叶酸靶向脂质体制备，考察其在体外肝癌HepG2细胞中的靶向性。通过酰胺反应将叶酸、胆固醇琥珀酸单酯与两种不同相对分子质量的聚氧乙烯二胺材料连接，合成两种两亲性的叶酸-聚乙二醇-胆固醇琥珀酸单酯（Folate-PEG₂₀₀₀-CHEMS和Folate-PEG₄₀₀₀-CHEMS），并利用核磁共振氢谱（¹H NMR）和超高分辨率复杂体分离鉴定质谱系统对其进行了结构表征。选取钙黄绿素为模型药物，采用薄膜分散法分别利用Folate-PEG₂₀₀₀-CHEMS和Folate-PEG₄₀₀₀-CHEMS制备了钙黄绿素脂质体FA-PEG₂₀₀₀-L与FA-PEG₄₀₀₀-L。利用激光粒度仪检测FA-PEG₂₀₀₀-L与FA-PEG₄₀₀₀-L的粒径、Zeta电位；利用流式细胞仪和激光共聚焦扫描显微镜，考察了脂质体FA-PEG₂₀₀₀-L与FA-PEG₄₀₀₀-L在HepG2细胞体外摄取实验中的药物递送效果。结果显示，钙黄绿素脂质体的平均粒径为（205.8 ± 10.2） nm，经电位测试脂质体的Zeta电位为-（1.19 ± 0.31） mV。FA-PEG₄₀₀₀-L靶向脂质体的荧光强度分别约为普通脂质体、FA-PEG₂₀₀₀-L的3.6和3.1倍（P < 0.01），FA-PEG₄₀₀₀-L在HepG2细胞中的递送效率明显高于FA-PEG₂₀₀₀-L与非靶向组，说明Folate-PEG₄₀₀₀-CHEMS可应用于脂质体制备，并可促进体外HepG2细胞对脂质体的摄取。     

补中益气汤协同Siβ-catenin调控Wnt/β-catenin信号通路干预肺腺癌顺铂耐药性的分子机制研究

目的 探讨补中益气汤含药血清协同Siβ-catenin调控Wnt/β-catenin信号通路干预A549/DDP细胞顺铂耐药性的分子机制研究。方法 采用siRNA干扰沉默β-catenin的表达,Western blot检测正常血清组、顺铂组、siCTNNB1-235组、siCTNNB1-510组、siCTNNB1-547组A549/DDP细胞的β-catenin蛋白的相对表达量;干扰β-catenin后,Western blot检测各组A549/DDP细胞β-catenin和Survivin的蛋白表达量,MTT法检测各组A549/DDP细胞对顺铂的IC₅₀,Annexin V/PI染色法检测各组A549/DDP细胞顺铂诱导的凋亡率。结果 相较于正常血清组（1.00）,siCTNNB1-235组（0.323±0.021）对β-catenin表达抑制率达67%（P=0.000）。RNAi技术沉默β-catenin后,与正常血清组（1.00）相比,补中益气汤联合顺铂组的Survivin（0.247±0.015）和β-catenin（0.257±0.015）蛋白的表达下调更为明显（P=0.000,P=0.000）。IC50和正常血清组（28.330±1.029） μmol/L相比,单独补中益气汤含药血清（20.350±1.155） μmol/L或单独瞬时转染siCTNNB1-235组（15.577±1.535） μmol/L均可降低A549/DDP细胞顺铂的IC₅₀（P=0.000,P=0.000）,2者联合（10.453±0.999） μmol/L使用可进一步降低顺铂的IC₅₀（P=0.000）。与正常血清组（9.130±0.384）%相比,瞬时转染siCTNNB1-235联合顺铂组（64.393±0.244）%和补中益气汤联合顺铂组（70.120±0.400）%的总凋亡率均升高（P=0.000,P=0.000）。结论 补中益气汤含药血清和瞬时转染siβ-catenin在抑制Wnt/β-catenin信号通路改善肺腺癌顺铂耐药性方面具有协同效应,且补中益气汤具有siβ-catenin瞬时转染样效应。     

甘草次酸-丹参酮IIA复方脂质体处方优化及制备工艺研究

目的 研究甘草次酸（GA）-丹参酮II_A（Tan II_A）复方脂质体（GT-Lip）的制备工艺。方法 以大豆卵磷脂（SPC）和胆固醇（Ch）为膜材,薄膜分散探头超声法制备GT-Lip。通过单因素考察确定水合温度和探头超声功率,正交设计法优化处方工艺;低速离心法测定脂质体中GA与Tan II_A包封率,动态光散射粒径仪测定脂质体粒径与Zeta电位,透射电镜测定脂质体形态。结果 优化处方工艺为SPC-Ch质量比6∶1,SPC-Tan II_A物质的量之比30∶1,SPC-GA物质的量之比24∶1,水合温度为30 ℃,探头超声条件为380 W超声5 min;制备得到的GT-Lip中Tan II_A、GA的包封率分别为（81.50±0.76）%、（98.63±0.90）%（n＝3）,平均Zeta电位为（?19.00±0.98）mV（n＝3）,平均粒径为（120.5±1.62）nm（n＝3）。结论 优化的GT-Lip制备工艺稳定可行。     

芹菜素诱导肺癌A549细胞凋亡及其机制研究

目的 研究芹菜素诱导肺癌A549细胞凋亡效应及其机制。方法 常规培养肺癌A549细胞,分别用10、20、40、80 μmol/L芹菜素作用于A549细胞;MTT法检测A549细胞增殖率;Western blotting检测聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）、Bcl-2的蛋白表达水平;RT-PCR检测bcl-2 mRNA的表达;Annexin V/PI双染法检测A549细胞凋亡率。结果 随着芹菜素浓度的增高,A549细胞的增殖抑制率明显增高,具有统计学意义（P＜0.05）;Western blotting显示PARP的剪切带逐渐增加,Bcl-2表达呈减少趋势;RT-PCR结果显示bcl-2 mRNA转录减少;0、10、20、40、80 μmol/L芹菜素对A549细胞凋亡率分别为（2.41±0.072）%、（10.56±0.054）%、（15.32±0.071）%、（28.98±0.012）%、（78.24±0.064）%,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 芹菜素通过抑制Bcl-2的表达有效地诱导肺癌A549细胞凋亡。     

大鼠静脉注射康莱特注射液的药动学研究

目的：研究康莱特注射液在正常大鼠体内的药动学。方法：采用甘油三酯试剂盒检测康莱特注射液经尾iv后大鼠血清中外源性甘油三酯的浓度变化,外源性甘油三酯浓度为测定血样中甘油三酯扣除本底后的浓度,采用3P97药代软件计算药动学参数。C_max为实测值,AUC计算采用梯形法。结果：康莱特注射液10、5 mL/kg剂量的主要药动学参数：C_max分别为（8.532±1.031）、（5.418±0.764）mmol/L,AUC_0-t分别为（13.248±3.692）、（5.339±1.219）mmol/L?h,V_c分别为（1.030±0.131）、（0.756±0.150）L²/（kg·mol）,CL_s分别为（0.838±0.319）、（0.975±0.330）L²/（kg·mol·h）,t _1/2α 分别为（0.481±0.168）、（0.322±0.109）h,t _1/2β分别为（1.452±0.776）、（1.384±0.404）h。结论：康莱特注射液经尾iv给药后在大鼠体内的药动学过程经拟合为二室模型。     

新型CDDO-Me类似物的合成及抗肿瘤活性

以齐墩果酸(OA)为起始原料,经9步反应合成了C环含有α,β-不饱和酮结构的2-氰基-3,12-二氧代齐墩果烷-1,9(11)-二烯-28-酸甲酯(CDDO-Me)活性类似物1,再将不同的脂肪羧酸和芳杂环羧酸分别与其C-3位羟基酯化,设计、合成了新型CDDO-Me类似物(2a~2e),并进一步将C-1位溴代,得到化合物3a~3e。采用MTT法测定了目标化合物对肺癌细胞A549、肝癌细胞HepG2以及肺上皮细胞BEAS-2B的增殖抑制活性。结果表明,目标化合物对HepG2细胞和A549细胞的增殖均显示了不同程度的抑制,其中化合物3b和3c的抑制活性最强［IC₅₀=(6.13±1.16)μmol/L,IC₅₀=(5.49±1.03)μmol/L］,优于先导物1,与CDDO-Me相当。此外,目标化合物对正常细胞BEAS-2B的抑制活性显著小于对上述两种肿瘤细胞的抑制活性,显示了较高的肿瘤细胞选择性,其中3e对HepG2的选择性最高,其抑制作用是正常细胞的10倍,值得进一步研究。     

苦参总生物碱及其单体在Caco-2细胞模型的吸收特征研究

目的 建立同时测定Caco-2细胞模型中苦参碱、氧化槐果碱和氧化苦参碱的HPLC方法,探讨苦参总生物碱在Caco-2细胞模型的吸收机制。方法 利用人源结肠腺癌细胞系Caco-2细胞单层模型,研究苦参碱、氧化槐果碱和氧化苦参碱由细胞绒毛膜面供给侧（AP）→基底外侧（BL）和BL→AP侧两个方向的转运过程;HPLC-UV法测定上述3个生物碱的量;计算转运参数和表观渗透系数（P_app）。结果 苦参总碱给药后,苦参碱、氧化槐果碱和氧化苦参碱由AP→BL侧的P_app分别为（1.098±0.092）×10^?5、（1.434±0.098）×10^?5、（3.87±0.64）×10^?6cm/s,由BL→AP侧的P_app分别为（1.104±0.098）×10^?5、（1.034±0.079）×10^?5、（2.75±0.33）×10^?6 cm/s,与文献报道的单体化合物给药相比,氧化槐果碱和氧化苦参碱双向转运的P_app明显增大。苦参碱、氧化槐果碱和氧化苦参碱的表观渗透率值分别为1.01、0.72、0.71。结论 苦参总生物碱中苦参碱、氧化槐果碱和氧化苦参碱仍主要以被动吸收方式进入体内,但比各单体给药吸收更好。     

姜黄素固体脂质纳米粒的制备及表征

目的：制备姜黄素（Cur）固体脂质纳米粒（SLN）。方法：用薄膜超声法制备Cur-SLN,以m_cur︰m_{单硬脂酸甘油酯}、m_{单硬脂酸甘油酯}︰m_卵磷脂、聚山梨酯-80质量浓度、超声时间为考察因素,以包封率为指标,用正交试验优选处方,并考察其粒径分布、Zeta电位。结果：当m_cur︰m_{单硬脂酸甘油酯}=1︰3、m_{单硬脂酸甘油酯}︰m_卵磷脂=1︰2.5、聚山梨酯-80质量浓度2.5%、超声时间12 min时,所制得的Cur-SLN平均粒径为（145.6±5）nm,Zeta电位为（－31.9±1.5）mV,包封率为（97.42±0.39）%,载药量为(7.92 ± 0.05)%。结论：采用薄膜-超声法制备Cur-SLN可行,为开发姜黄素新型给药系统提供试验依据。     

注射用苦参素纳米球与普通粉针剂在大鼠体内药动学比较

目的 比较注射用苦参素纳米球（KU-PLGA-NS）与注射用苦参素普通粉针剂（KUI）在大鼠体内的药动学特性。方法 建立HPLC法检测大鼠血浆中苦参素,采用ANOVA法选择房室模型,将所测得的血药浓度-时间数据,采用DAS程序进行分析,根据F值与AIC选择房室模型求算药动学参数。结果 等剂量KU-PLGA-NS和KUI的AUC_0-t分别为（785.57±170.92）、（342.43±54.49）mg·L^?1·min,C_max为（18.51±2.47）、（28.48±5.40）mg/L,t_1/2Ke为（91.69±1.94）、（11.51±2.47）min。结论 KU-PLGA-NS在大鼠体内的药动学特性与KUI比较AUC和C_max增加,t_1/2延长。     

杜鹃素在大鼠体内的药动学研究

目的 研究杜鹃素在正常大鼠体内的药动学特征。方法 杜鹃素单剂量ig给予大鼠后,采用HPLC法测定给药后不同时间点大鼠血浆中的杜鹃素,通过DAS软件程序模拟计算,得出杜鹃素在大鼠体内相应的药动学参数。结果 杜鹃素在大鼠体内的药动学模型符合二室模型,主要药动学参数为：t_1/2α＝（0.33±0.10）h,t_1/2β＝（15.22±8.98）h,CL/F＝（14.89±3.45）L/(h?kg),C_max＝（1.61±0.14）mg/L,T_max＝（0.25±0.01）h,MRT_(0-t)＝（2.35±0.08）h,AUC_(0-t)＝（3.06±0.16）mg?h/L。结论 本研究建立的HPLC方法专属性强,简便、准确,可用于杜鹃素在大鼠体内的药动学研究;大鼠ig给予杜鹃素后,其在血浆中分布较快,半衰期较短。     

Cytotoxic and apoptotic effects of caffeate derivatives on A549 human lung carcinoma cells

BackgroundCaffeate derivatives have been reported to exhibit antioxidant, anti-inflammatory, and anticancer activities. To reveal the cytotoxic and apoptotic effects of caffeate derivatives, we studied the effects of octyl, phenylpropyl, and decyl caffeates on cell growth and apoptosis in A549 human lung carcinoma cells.MethodsA549 human lung carcinoma cells were treated with 0–100 μM of caffeate derivatives for 0–48 hours. The cytotoxic and apoptotic effects were evaluated by a 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay for cell viability, propidium iodide staining method for cell morphology, mitochondrial membrane potential analysis, and Western blot for protein expression.ResultsOctyl, phenylpropyl, and decyl caffeates all significantly decreased the cell viability of A549 cells with 50% inhibitory concentration values of 54.2 ± 10.1 μM, 80.2 ± 1.3 μM, and 74.9 ± 2.1 μM, respectively. Propidium iodide staining revealed that apoptotic bodies appeared when cells were treated with octyl and decyl caffeates. Treatment of A549 cells with octyl and decyl caffeates caused the loss of mitochondria membrane potential. Western blots revealed that octyl and decyl caffeates stimulate an increase in the protein levels of Fas, FasL, and Apaf-1. Moreover, these compounds changed the levels of pro- and antiapoptotic Bcl-2 family members and induced the activation of caspase-12, -9, and -3, which was followed by cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase.ConclusionThese results demonstrate that octyl and decyl caffeates induce cell apoptosis in A549 human lung carcinoma cells.     

注射用黄芪多糖对耐顺铂人肺腺癌细胞A549/DDP耐药逆转作用研究

目的 探讨注射用黄芪多糖药物血清在体外对耐顺铂（DDP）人肺腺癌A549/DDP细胞株的耐药逆转作用。方法 通过建立小鼠肿瘤模型,运用血清药理学方法,以人肺腺癌敏感细胞A549和耐药细胞A549/DDP为研究对象,采用细胞毒实验（MTT）方法,探讨注射用黄芪多糖对耐顺铂人肺腺癌细胞A549/DDP的耐药逆转作用。结果 注射用黄芪多糖药物血清高、中、低剂量组分别与DDP合用时对A549/DDP细胞的耐药逆转倍数分别为1.24、1.41、1.34;且中、高剂量组与阳性对照DDP组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 注射用黄芪多糖能明显增加A549/DDP耐药细胞对DDP的敏感性,提高细胞死亡率,具有耐药逆转作用。     

注射用黄芪多糖对耐顺铂人肺腺癌细胞A549/DDP耐药逆转作用研究

目的 探讨注射用黄芪多糖药物血清在体外对耐顺铂（DDP）人肺腺癌A549/DDP细胞株的耐药逆转作用。方法 通过建立小鼠肿瘤模型,运用血清药理学方法,以人肺腺癌敏感细胞A549和耐药细胞A549/DDP为研究对象,采用细胞毒实验（MTT）方法,探讨注射用黄芪多糖对耐顺铂人肺腺癌细胞A549/DDP的耐药逆转作用。结果 注射用黄芪多糖药物血清高、中、低剂量组分别与DDP合用时对A549/DDP细胞的耐药逆转倍数分别为1.24、1.41、1.34;且中、高剂量组与阳性对照DDP组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 注射用黄芪多糖能明显增加A549/DDP耐药细胞对DDP的敏感性,提高细胞死亡率,具有耐药逆转作用。     

CDDO-Me羧酸酯前药的设计、合成及抗炎活性

以齐墩果酸(OA)为起始原料,合成了2-氰基-3,12-二氧代齐墩果烷-1,9(11)-二烯-28-酸甲酯(CDDO-Me),继而经DMF/K₂CO₃作用,制备了该化合物A环上的1,4加成物(1),再用不同的脂肪羧酸和取代芳香羧酸分别与其C-3位羟基反应,合成了CDDO-Me羧酸酯前药(2~8),以期得到活性较强、毒性较小的抗炎药物。采用LPS诱导小鼠巨噬细胞(RAW 264.7)释放一氧化氮(NO)的模型来评价目标化合物抗炎活性。结果表明,化合物2~8对细胞中NO释放显示了不同程度的抑制,其中化合物2［IC₅₀=(2.34±0.67)nmol/L］和7［IC₅₀=(3.83±0.97)nmol/L］抑制活性最强。此外,用MTT法评价了目标化合物对巨噬细胞RAW 264.7增殖的影响,发现它们的抑制活性显著低于CDDO-Me,提示其毒性小于CDDO-Me。     

靶向IGF-1R的siRNA增强肺癌细胞对Trail诱导凋亡敏感性的研究

目的 研究IGF-1R特异RNA干扰后肺腺癌细胞A549增殖和凋亡的改变以及其对Trail的敏感性。 方法 化学合成IGF-1R特异siRNA转录模板,与表达载体连接,转染大肠杆菌扩增后提取质粒,酶切鉴定和DNA测序分析。转染A549细胞后筛选稳定表达IGF-1R-siRNA细胞株,FQ RT-PCR、Western blot和免疫组织化学检测IGF-1R基因表达。MTT法和流式细胞仪测定Trail作用前后转染和非转染A549细胞增殖活性和凋亡率。 结果 成功构建IGF-1R-siRNA表达载体并筛选出稳定表达IGF-1R-siRNA单克隆细胞。和空白对照相比IGF-1R蛋白和IGF-1RmRNA表达分别下降79.01%(0.17±0.06 vs.0.81±0.15)(P＜0.01)和76.05%(1.36±0.26 vs.5.68±0.45)(P＜0.01)。免疫组织化学显示IGF-1R表达降低。Trail作用于IGF-1R-siRNA的A549,细胞增殖速度降低(P＜0.05);凋亡率明显增加(P＜0.01)。 结论 IGF-1R-siRNA表达载体具有RNA干扰作用。IGF-1R表达下降后A549细胞增殖速度减慢,对Trail诱导的细胞凋亡敏感性增加。      

PKM2基因沉默对人肺癌细胞生物学特性的影响

目的 探讨M2型丙酮酸激酶（pyruvate kinase M2,PKM2）下调对人肺癌A549细胞生物学特性的影响。方法 采用免疫荧光技术检测A549细胞中PKM2蛋白的表达;将构建有PKM2-shRNA的重组质粒转入A549细胞;分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测PKM2 mRNA和蛋白表达水平;CCK-8法检测PKM2基因沉默对A549细胞增殖能力的影响;采用葡萄糖测定试剂盒测定细胞对葡萄糖的消耗量;Transwell实验检测细胞穿过人工基膜的能力。结果 肺癌A549细胞的细胞质及细胞核中均有PKM2表达;PKM2-shRNA质粒转染A549细胞48h后,可明显下调A549细胞中PKM2 mRNA及蛋白的表达水平,并且明显抑制A549细胞增殖;PKM2 shRNA可减少A549细胞葡萄糖的消耗,还可抑制细胞侵袭能力。结论 在肺癌细胞A549中,抑制PKM2表达可显著抑制细胞增殖、侵袭和糖代谢能力。     

消岩汤剂拆方配伍对A549肺腺癌细胞体外生长抑制作用研究

[目的] 探讨消岩汤及各拆方组对人肺腺癌 A549细胞的体外生长的作用机制,探究消岩汤剂中最有效的作用成分和浓度。[方法] 消岩汤全方和根据功效拆分的清热解毒组、活血化瘀组、益气扶正组,以CCK-8检测A549肺腺癌细胞的细胞增殖活性。[结果] 各组均有明显的抑制细胞活性作用,抑制强度依次为:全方组、清热解毒组、活血化瘀组、益气扶正组。[结论] 消岩汤及其拆方组在体外实验中均能抑制A549肺腺癌细胞细胞生长,消岩汤全方组当浓度达到50 g/L时达到最大抑制率为85.60%。清热解毒组药物在抗肿瘤作用方面,与全方接近,提示清热解毒组中药为体外实验中全方抗肿瘤作用最有效组分。     

熊果酸对肺癌细胞株A549及SPCA1细胞周期的抑制作用

目的 研究熊果酸(ursolic acid,UA)对肺癌细胞株A549及SPCA1细胞周期的抑制作用,探讨其分子机制。方法 采用MTS法检测不同浓度UA作用不同时间对A549及SPCA1细胞的增殖抑制作用;光镜下观察细胞形态学变化;流式细胞仪检测不同浓度UA对A549及SPCA1细胞周期分布的影响;实时荧光定量PCR分析UA作用下A549及SPCA1的相关分子表达情况。结果 MTS结果显示UA对A549及SPCA1细胞具有增殖抑制作用,且呈时间和剂量依赖性。经UA作用后,光镜下可见A549及SPCA1细胞增殖受到抑制,细胞出现变圆、回缩和脱落。流式细胞仪结果显示在UA作用后,A549及SPCA1细胞周期抑制在G₀/G₁期,S期和G₂/M期的比例降低。实时荧光定量PCR结果表明,UA作用后A549及SPCA1细胞cyclinD1 mRNA、cyclinE mRNA、Ankrd17 mRNA表达水平降低,p27 mRNA、p16 mRNA表达增加,Ankrd17 mRNA表达变化差异无统计学意义。结论 UA能明显抑制A549及SPCA1细胞增殖,呈时间和剂量依赖性,该作用是通过将细胞周期抑制在G₀/G₁期实现的。其分子机制可能与上调p27和p16的表达,下调cyclinD1和cyclinE的表达有关。     

Smad3对非小细胞肺癌A549细胞和宫颈癌HeLa细胞迁移的影响

目的过表达、敲低或抑制Smad3的活性,探讨Smad3对非小细胞肺癌A549细胞和宫颈癌He La细胞迁移的影响。方法设计扩增Smad3基因全长编码序列c DNA的引物,通过分子克隆技术构建p CMV-MycSmad3过表达载体,同时设计并合成靶向Smad3的siRNA序列,在A549和He La细胞中过表达或敲低Smad3,或者利用Smad3的抑制剂SIS3 2μM处理细胞,采用细胞划痕的方法研究Smad3对A549和He La细胞迁移的影响。结果利用分子克隆技术成功构建p CMV-Myc-Smad3过表达载体。过表达Smad3促进A549和He La细胞的迁移。敲低Smad3抑制A549和He La细胞的迁移。SIS3抑制Smad3的活性导致A549和He La细胞的迁移速率变慢。结论Smad3促进A549和He La细胞的迁移。