MDR1反义RNA表达质粒的构建及其在多药耐药细胞抗药机理研究中的应用

ＭＤＲ１反义ＲＮＡ表达质粒的构建及其在多药耐药细胞抗药机理研究中的应用曹江，胡汛，潘锵荣，郑树Ｋ５６２／Ｄｏｘ为一典型的多药耐药（ＭＤＲ）细胞株［１］，常规培养于含阿霉素（Ｄｏｘ）０．１μｇ／ｍｌ的培养液内。我们将高表达反义ＭＤＲｌ－ＲＮＡ（核糖核酸...     

急性髓系白血病H-ras、凋亡及多药耐药的研究

目的研究急性髓系白血病（ＡＭＬ）Ｈｒａｓ／Ｐ２１、抗凋亡基因（ｂｃｌ２）、细胞凋亡与多药耐药基因（ｍｄｒ１／Ｐｇｐ）对疗效的影响,并证实流式细胞术（ＦＣＭ）检测Ｐｇｐ和逆转录多聚酶链反应（ＲＴＰＣＲ）检测ｍｄｒ１ｍＲＮＡ间的相关。方法用ＦＣＭ检测８５例初治ＡＭＬ患者的Ｈｒａｓ／Ｐ２１、ｂｃｌ２、细胞凋亡和ｍｄｒ１产物Ｐｇｐ的表达;用ＲＴＰＣＲ检测其中４７例的ｍｄｒ１／ｍＲＮＡ。结果Ｐ２１＋／Ｐｇｐ＋者完全缓解（ＣＲ）率明显低于Ｐ２１－／Ｐｇｐ－者（分别为５８．１％和１００％,Ｐ＜０．０２５）,高ｂｃｌ２／Ｐｇｐ＋的ＣＲ率明显低于低ｂｃｌ２／Ｐｇｐ－者（分别为６０％和９６．３％,Ｐ＜０．００５）。Ｐｇｐ＋３１例中２９例ｍｄｒ１ｍＲＮＡ阳性,Ｐｇｐ－１６例中仅２例ｍｄｒ１ｍＲＮＡ阳性。结论Ｐｇｐ＋同时Ｐ２１＋、高ｂｃｌ２者ＣＲ低,ＦＣＭ检测Ｐｇｐ和ＲＴＰＣＲ检测ｍｄｒ１ｍＲＮＡ相关性良好     

环孢菌素A与细胞因子联合逆转白血病多药耐药性的体外研究

目的 探讨环孢菌素Ａ（ＣｓＡ）联合细胞因子对耐药细胞系Ｋ５６２／Ａ０２的逆转作用,方法 以甲基四唑蓝法测定柔红霉素（ＤＮＲ）的细胞毒性,用流式细胞仪技术测定细胞内罗丹明（Ｒｈ１２３）浓度,用ＲＴ－ＰＣＲ及ＪＳＢ－１抗体分别检测多药耐药（ＭＤＲ１）ｍＲＮＡ及其Ｐ糖蛋白的表达。结果 １μｍｏｌ／ＬＣｓＡ,５００Ｕ／ｍｌ干扰素２００Ｕ／ｍｌ白介素２（ＩＬ－２）均能增加ＤＮＲ对耐药细胞系Ｋ５６２／Ａ０２的     

K_（562）细胞及K_（562）／ADM耐药细胞内cAMP及cGMP含量的测定

测定正常人淋巴细胞内环磷腺苷（ｃＡＭＰ）、环磷鸟苷（ｃＧＭＰ）含量和人红白血病细胞株（Ｋ５６２）及其耐阿霉素细胞株（Ｋ５６２／ＡＤＭ）的增殖状况和细胞内ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ含量。结果Ｋ５６２与Ｋ５６２／ＡＤＭ细胞内ｃＡＭＰ含量均低于正常人淋巴细胞内ｃＡＭＰ，但无显著差异，Ｋ５６２与Ｋ５６２／ＡＤＭ之间细胞内ｃＡＭＰ的含量有显著差异，ｃＧＭＰ含量均未见差异。Ｋ５６２／ＡＤＭ细胞的增殖状况与ｃＡＭＰ含量呈负相关（ｒ＝－０．５８２３，Ｐ＜０．０５），加入逆转耐药的药物潘生丁、维拉帕米后，其增殖速度下降且差异显著（Ｐ＜０．０５），ｃＡＭＰ含量呈上升趋势；Ｋ５６２细胞也有此改变，但两种药物对两种细胞的影响程度不同。     

C-myc反义核酸对内皮素诱导的人肺动脉平滑肌细胞增殖抑制作用的研究

应用不同浓度的Ｃ－ｍｙｃ反义寡核苷酸处理体外培养的经１０－８ｍｏｌ／Ｌ内皮素－１（ＥＴ－１）诱导的人肺动脉平滑肌细胞,通过细胞计数和３Ｈ－ＴｄＲ掺入值观察该反义核酸对细胞增殖及ＤＮＡ合成的抑制作用,应用斑点杂交法检测平滑肌细胞Ｃ－ｆｏｓ和Ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ的表达水平。结果表明,１０、２０、５０μｇ／ｍｌ反义寡核苷酸对细胞计数和３Ｈ－ＴｄＲ掺入值与对照组相比抑制率分别为１１．９％和１２．３％（Ｐ＜０．０５）,２１．６％和１４．７％（Ｐ＜０．０１）,３６．３％和２７．２％（Ｐ＜０．０１）;对Ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ表达抑制率分别为７１．３％（Ｐ＜０．０５）,８０．７％（Ｐ＜０．０５）,９２．５％（Ｐ＜０．０１）;５０μｇ／ｍｌ反义核酸对Ｃ－ｆｏｓｍＲＮＡ表达抑制率是７９．７％,１０、２０μｇ／ｍｌ组无抑制作用。Ｃ－ｍｙｃ反义核酸能显著抑制内皮素诱导的人肺动脉平滑肌细胞增殖,其作用系依赖反义核酸的序列特异性和剂量依赖。     

K_（562）和L_（210）耐高三尖杉酯碱细胞系的建立及其耐药机制的初步研究

通过逐渐递增高三尖杉酯碱（ＨＨＴ）剂量的方法，分别克隆筛选出两株耐ＨＨＴ１６．７和１３．４倍的Ｋ５６２和Ｌ１２１０白血病细胞系。各命名为Ｋ５６２ＨＨＴ和Ｌ１２１０ＨＨＴ。二者对阿霉素、长春新碱、柔红霉索和马法兰等抗肿瘸药物均呈不同程度的交叉耐药。斑点杂交的结果表明二者的多药耐药基因（ＭＤＲ－１）表达明显增强，且用ＭＤＲ－１基因表达产物Ｐ１７０糖蛋白特异性的ＪＳＢ－１单克隆抗体检测Ｋ５６２ＨＨＴ细胞，结果呈强阳件反应，而敏感株为阴性。此外，二者的谷胱甘肽－Ｓ－转移酶（ＧＳＴ）α和π基因ｍＲＮＡ水平均有提高，而ＧＳＴμ无明显改变。     

一种有效的肿瘤耐药逆转剂─汉防己甲素逆转白血病耐药的实验研究

用ＭＴＴ法检测ＤＮＲ及ＨＨＴ对白血病细胞的毒性作用，并观察中药汉防己甲素（ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ，ＴＴＤ）对两种化疗药物细胞毒性的影响。结果ＴＴＤ可明显提高ＤＮＲ及ＨＨＴ对耐药细胞（Ｋ５６２／Ａ０２，Ｋ５６２／ＨＨＴ）的毒性作用，ＩＣ５０值分别下降１５．８及１９．１倍（Ｐ＜０．０５）；而ＴＴＤ对Ｋ５６２／Ｓ敏感细胞无明显影响（Ｐ＞０．０５）。同时进行了异搏定的对照实验。推测ＴＴＤ可能是通过抑制耐药肿瘤细胞膜上Ｐ－１７０糖蛋白的功能而起作用的。     

人转铁蛋白-阿霉素结合物对耐阿霉素K562细胞的体外杀伤作用

目的 探讨阿霉素（ＡＤＭ）与人转铁蛋白（Ｔｆ）结合物对耐阿霉素Ｋ５６２细胞株的体外杀伤作用。方法 采用葡聚糖（ＤＥＸ）Ｔ－１０作为中介体、联接Ｔｆ与ＡＤＭ制备结合物Ｔｆ－ＡＤＭ,用ＭＴＴ法比较结合物对耐ＡＤＭ及ＡＤＭ敏感的Ｋ５６２细胞的体外杀伤作用强度。结果 结合物对耐ＡＤＭ的Ｋ５６２细胞株７２ｈ培养、ＭＴＴ法测定结合物对耐ＡＤＭ的Ｋ５６２细胞ＩＣ５０为４．９μｍｏｌ,游离ＡＤＭ的ＩＣ５０〉１７．２４μｍｏｌ,Ｔｆ对这两种细胞都没有体外杀伤作用。结论 结合物Ｔｆ－ＡＤＭ可提高ＡＤＭ对耐ＡＤＭ的Ｋ５６２细胞株的杀伤作用,此作用与Ｔｆ无明显关系。     

阳离子脂质体Lipofectin^TM对WT1反义酸在K562细胞的摄 …

目的 探讨阳离子脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ＾ＴＭ对ＷＴ１反义寡核苷酸（反义核酸）细胞摄入胞内分布的影响。方法 采用阳离子脂质介导ＷＴ１反义核酸转染Ｋ５６２细胞,应用流式细胞仪、荧光显微镜分别观察反义核酸的细胞摄入和胞内分布,ＲＴ－ＰＣＲ检测处理前后ＷＴ１ｍＲＮＡ表达水平。结果 （１）脂质体提高Ｋ５６２细胞对反义核酸的摄入,细胞摄入率达７０．９％,平均荧光强度提高６倍以上;脂质体介导转染反义核酸对其     

P-170在亲本S-180和抗药S-180-R瘤细胞中的表达

①目的探讨ＭＤＲ基因产物Ｐ－糖蛋白（Ｐ－１７０）在亲本Ｓ－１８０及抗阿霉素Ｓ－１８０－Ｒ瘤细胞中的表达。②方法用ＡＢＣ免疫组化方法，按日本ＤＡＫＯ公司免疫药盒程序进行，单抗为Ｃ２１９，ＬｉｎＫｉｎｇｒｅａｇｅｎｔ１∶４００，Ｓｔｒｅｐｔａｉｖｉｄｉｎｒｅａｇｅｎｔ１∶４００，ＤＡＢ染色，苏木精复染。③结果Ｓ－１８０－Ｒ瘤细胞中，有明显的Ｐ－１７０表达，亲本Ｓ－１８０细胞则无此表达。抗阿霉素Ｓ－１８０－Ｒ瘤细胞比抗阿霉素Ｐ３８８／ＡＤＲ细胞有更多的Ｐ－１７０表达。④结论ＭＤＲ基因产物Ｐ－１７０的过表达是抗阿霉素细胞系Ｓ－１８０－Ｒ的抗药标志之一。     

反义寡脱氧核苷酸对脯氨酸4—羟化酶mRNA表达的抑制作用

观察反义寡脱氧核苷酸对脯氨酰４－羟化酶两种亚基ｍＲＮＡ表达的影响。方法采用定量ＲＴ－ＰＣＲ技术检测培养的人皮肤成纤维细胞中Ｐ４ＨｍＲＮＡ的相对含量。含量：不同浓度（０．１,０．２,０５,１．０μｍｏｌ／Ｌ）反义ＯＤＮ处理组,人皮肤成纤维细胞中Ｐ４ＨｍＲＮＡ表达水平均显著低于对照组及错配ＯＤＮ处理组,其中０．１、０．２μｍｏｌ／Ｌ反义ＯＤＮＡ作用２０ｈ时,抑制效应达到最大,５０－７０ｈ后,逐渐恢复到     

硒代二半胱氨酸对白血病细胞环核苷酸及细胞周期的影响

为探索硒的抗白血病机理，观察了硒代二半胱氨酸对白血病Ｕ９３７和Ｋ５６２细胞ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ及细胞周期的影响。结果表明，用３．０μｍｏｌ／Ｌ硒代二半胱氨酸作用３天后，白血病细胞生长和增殖被抑制，其细胞内ｃＡＭＰ含量增加，ｃＧＭＰ含量减少，ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ比值在Ｕ９３７和Ｋ５６２细胞分别从０．２４和２．０８提高到１．５３和４．７７，Ｓ＋Ｇ２／Ｍ期细胞百分比分别减少３．８％和１２．３％。     

小檗碱对K562细胞生长的抑制作用

目的 探讨小檗碱对Ｋ５６２细胞生长的抑制作用及对阿霉素（ＡＤＭ）耐药株Ｋ５６２／ＡＤＭ的影响。方法 细胞抑制率和细胞生长曲线测定采用台盼蓝排染法，克隆形成实验采用半固体培养基培养，镜下计数。结果 Ｋ５６２细胞经小檗碱处理后生长明显受抑，呈作用时间和剂量依赖性，ＩＣ５０为２７．２（２４ｈ），４．６９（４８ｈ），１．２２（７２ｈ）ｍｇ／Ｌ。细胞增殖速度显著降低，２０ｍｇ／Ｌ达完全抑制。克隆原细胞存活曲     

小檗碱对K562细胞生长的抑制作用

目的探讨小檗碱对Ｋ５６２细胞生长的抑制作用及对阿霉素（ＡＤＭ）耐药株Ｋ５６２／ＡＤＭ的影响。方法细胞抑制率和细胞生长曲线测定采用台盼蓝排染法，克隆形成实验采用半固体培养基培养，镜下计数。结果Ｋ５６２细胞经小檗碱处理后生长明显受抑，呈作用时间和剂量依赖性，ＩＣ５０为２７．２（２４ｈ），４．６９（４８ｈ），１．２２（７２ｈ）ｍｇ／Ｌ。细胞增殖速度显著降低，２０ｍｇ／Ｌ达完全抑制。克隆原细胞存活曲线呈指数型，可超过２个指数杀灭。小檗碱对Ｋ５６２／ＡＤＭ细胞有较强耐药性。结论小檗碱对Ｋ５６２细胞生长具有明显抑制作用，提示其可能作为抗肿瘤药。     

K562细胞及K562／ADM耐药细胞内cAMP及cGMP含量的测定

测定正常人淋巴细胞内环磷腺苷（ｃＡＭＰ）、环磷鸟苷（ｃＧＭＰ）含量和人红白血病细胞株（Ｋ５６２）及其耐阿霉素细胞株（Ｋ５６２／ＡＤＭ）的增殖状况和细胞内ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ含量。结果Ｋ５６２与Ｋ５６２／ＡＤＭ细胞内ｃＡＭＰ含量均低于正常人淋巴细胞内ｃＡＭＰ，但无显著差异，Ｋ５６２与Ｋ５６２／ＡＤＭ之间细胞内ｃＡＭＰ的含量有显著差异，ｃＧＭＰ含量均未见差异。Ｋ５６２／ＡＤＭ细胞的增殖状况与ｃＡＭＰ含量     

ICAM—1在缺氧—再氧化引起的白细胞与内皮细胞粘附中的作用

目的探讨细胞间粘附分子（ＩＣＡＭ－１）是否介导缺氧－再氧化引起的中性粒细胞（ＰＭＮ）和血管内皮细胞（ＶＥＣ）的粘附反应。方法血管内皮细胞（ＶＥＣ）经缺氧再氧化（Ｈ／Ｒ）处理后,加入ＰＭＮ,用计数法检测粘附率,以细胞免疫化学及原位杂交法检测ＩＣＡＭ－１及ＩＣＡＭ－１ｍＲＮＡ表达。结果ＶＥＣ经Ｈ／Ｒ处理后,ＰＭＮ与其粘附率增高１倍（Ｐ＜０．０１）,ＩＣＡＭ－１单克隆抗体（ｍＡｂ）与ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８ｍＡｂ可明显降低粘附率的增高,Ｈ／Ｒ能增加ＶＥＣ的ＩＣＡＭ－１及ＩＣＡＭ－１ｍＲＮＡ表达。结论ＩＣＡＭ－１介导Ｈ／Ｒ后的ＰＭＮ－ＶＥＣ间粘附反应。     

洋地黄毒甙体外抗人癌细胞株的作用

目的：探讨洋地黄毒甙体外抗肿瘤作用。方法：以台盼蓝排染法、中性红活染法和克隆形成实验测定洋地黄毒甙（ＤＴ）对多种人癌细胞株的细胞毒作用。结果：０．０１～１．２５μｇ／ｍｌＤＴ在体外能显著杀伤ＨＬ－６０．Ｋ５６２．ＳＭＭＣ－７７２１，ＳＧＣ－７９０１细胞，并呈剂量依赖性，药物作用２４ｈ．ＩＣ５０分别是０．１３２．０．１８２．０．２６５．０．４８９μｇ／ｍｌ。对正常成纤维细胞株ＨＬＦ的ＩＣ（５０）为４．２８８μｇ／ｍｌ．明显高于癌细胞，对癌细胞具有选择毒性作用。克隆形成实验中，０．０１～１．２５μｇ／ｍｌＤＴ处理１２ｈ，对ＨＬ－６０和ＳＧＣ－７９０１细胞集落形成有明显的抑制作用，ＩＣ５０分别是０．０５６．０．ｌ１９μｇ／ｍｌ。结论：应用洋地黄毒甙及其他Ｎａ＋－Ｋ＋－ＡＴＰ酶抑制剂防治肿瘤是一个值得探讨新方向。     

脂质体转染bcl-2反义核酸对HL-60细胞凋亡的影响

目的人白血病细胞系ＨＬ－６０细胞高表达凋亡抑制基因ｂｃｌ－２蛋白，是研究细胞增殖、凋亡的良好模型。通过脂质体转染ｂｃｌ－２反义核酸，观察其对细胞增殖的抑制，对ｂｃｌ－２蛋白表达影响，及诱导细胞凋亡出现。方法ＨＬ－６０细胞在３７℃、５％ＣＯ２条件下，培养于含１５％小牛血清及含青、链霉素（每毫升各１００Ｕ）的ＲＰＭＩ１６４０完全培养基中，细胞接种密度为１０７／Ｌ，反义核酸终浓度为５μｍｏｌ／Ｌ，反义核酸与脂质体比例为１．０ＯＤ：５０μｌ。脱离小牛血清转染２４ｈ，同时设置空白组、无义组、反义组、脂质体组、脂质体＋无义组，再连续培养４天，做免疫组化，检测ｂｃｌ－２蛋白表达。提取总ＲＮＡ，行ＲＴ－ＰＣＲ分析ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ表达，以及透射电镜检查，观察细胞凋亡情况及脂质体转染情形。结果脂质体转染ｂｃｌ－２反义核酸的作用：（１）抑制ＨＬ－６０细胞增殖，在转染后第五天最明显，经统计学处理，反义组与空白及无义对照组有显著性差别，脂质体转染反义核酸组与其余组均有统计上显著性差别。（２）降低ｂｃｌ－２蛋白表达水平，处理前ｂｃｌ－２免疫组化阳性率为６２±１．４８％，经转染ｂｃｌ－２反义核酸处理后，ｂｃｌ－２表达率为３２．５±１．     

p53和c—myc异常表达与胃癌细胞多药耐药性关系的研究

应用ＬＳＡＢ免疫组织化学方法研究６７例胃标本中ｐ５３和ｃ－ｍｙｃ的表达与多药耐药性（ＭＤＲ）的关系，结果显示本组胃癌中Ｐ５３阳性３２例，阳性率４７．８％；ｃ－ｍｙｃ阳性３７例，阳性率５５．２％；Ｐ－ｇｐ阳性３９例，阳性率５８．２％。Ｐ５３的异常表达与ＭＤＲ－１基因表达呈显著正相关（ｒ＝０．３７，Ｐ〈０．０５），而ｃ－ｍｙｃ和ｍｄｒ－１的表达无明显相关。提示Ｐ５３异常表达可增加ｍｄｒ－１基因的表达，     

慢性粒细胞白血病反义核酸基因治疗的实验研究

目的单独应用ｂｃｒ－ａｂｌ反义硫代磷酸寡聚脱氧核糖核酸（ＡＳＰＯ）或ｃ－ｍｙｂＡＳＰＯ作用于慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）细胞的研究已有报道，但抑制的不彻底性是个主要问题。由于ＣＭＬ的发生是多癌基因协同作用及相互影响的结果，为进一步提高ＡＳ－ＰＯ对ＣＭＬ细胞的作用效果，用互补于两种类型（ｂ２ａ２及ｂ３ａ２）的ｂｃｒ－ａｂｌ基因融合位点两侧各１３个核苷酸的ＡＳＰＯ（ｂ２ＡＳＰＯ和ｂ３ＡＳＰＯ）及ｃ－ｍｙｂ基因起始密码子２－７互补的ＡＳＰＯ（ｍＡＳＰＯ）联合作用于Ｋ５６２细胞株和原代ＣＭＬ细胞。方法硫代磷酸寡核基酸（ＰＳ－ＯＤＮ）的合成由３９２－０５型ＤＮＡ－ＲＮＡ合成仪自动合成，经ＯＰＣ柱纯化；细胞与ＰＳ－ＯＤＮ共培养后２４，４８，９６，１２０ｈ倒置显微镜下活体观察，０．４％台盼蓝拒染法进行死活细胞计数；ＣＦＵ－Ｋ５６２、ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－ＧＥＭＭ采用０．８％甲基纤维素半固体培养法；采用两对引物ＲＴ－ＰＣＲ半定量法检测细胞ｂｃｒ－ａｂｌｍＲＮＡ表达；通过流式细胞仪检测及电镜观察细胞凋亡情况。结果（１）ＡＳＰＯ能够特异性抑制ｂｃｒ－ａｂｌ基因表达；经ＲＴ－ＰＣＲ的检测发现１０μｍｏｌＡＳＰＯ作用４８ｈ，两种反义