白癜风相关黑素细胞膜抗原的检测及分析

目的 检测和分析白癜风相关的黑素细胞膜抗原,为纯化和克隆白癜风相关的黑素细胞膜抗原打下基础。方法 用活细胞ELISA法筛选白癜风血清,获得抗黑素细胞膜的强阳性IgG血清;体外培养正常人黑素细胞,裂解黑素细胞并作免疫印迹。共检测分析了30例强阳性白癜风血清。结果 免疫印迹显示,全部被筛选出的强阳性血清均有阳性条带,对照仅1例阳性(10%);抗体结合多种抗原成分,相对分子质量约为150000、90000、75000、50000、40000~45000。各个条带阳性率分别为70%、60%、83%、16%、23%。结论 白癜风患者血清中存在抗黑素细胞膜抗体,膜抗原相对分子质量主要为150000、90000、75000,以往发现的一些小分子抗原可能为大分子抗原的降解产物。     

TRP-1编码基因反义核酸对黑素细胞增殖及功能的影响

目的 构建酪氨酸相关蛋白-1(TRP-1)反义真核表达载体并转染TRP-1高表达的黑素细胞及恶性黑素瘤细胞,进一步研究其对黑素细胞及恶性黑素瘤细胞增殖及功能的影响。方法 将TRP-1基因反向亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1,转染黑素细胞及恶性黑素瘤细胞。以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测TRP-1mRNA水平的变化,免疫印迹法检测TRP-1蛋白水平的改变。通过流式细胞仪检测细胞周期的变化,并用L-多巴测定酪氨酸酶活性的改变。结果 成功构建重组反义表达载体pcDNA3.1/TRP-1(-),转染细胞稳定表达TRP-1反义核酸。RT-PCR提示TRP-1mRNA水平显著下降,免疫印迹提示其TRP-1蛋白表达水平降低。流式细胞检测表明反义TRP-1转染细胞发生细胞周期G1期阻滞。转染组黑素细胞及黑素瘤细胞酪氨酸酶活性抑制率分别达46%和54%。结论 TRP-1在黑素细胞及黑素瘤细胞的增殖及功能方面发挥重要作用,TRP-1反义核酸转染细胞细胞周期受到阻滞,酪氨酸酶活性明显降低。     

女贞子对培养的黑素细胞酪氨酸酶活性和黑素合成的影响

目的 研究女贞子单体酪醇和齐墩果酸对人黑素细胞的增殖、酪氨酸酶活性及黑素合成的影响。方法 采用MTT法测定细胞增殖情况,多巴氧化法测定酪氨酸酶活性,氢氧化钠裂解法测定黑素含量,半定量RT-PCR检测药物对黑素细胞酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白-1 mRNA表达的影响。结果 加入酪醇72h后,各组黑素细胞的酪氨酸酶活性和合成黑素能力明显增强,且呈浓度依赖性;酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白-1 mRNA表达量分别比空白对照增加39.10%和99.26%;齐墩果酸也能明显激活酪氨酸酶(P<0.01),促进黑素合成(P<0.05),并使黑素细胞酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白-1mRNA表达量分别比加入无水乙醇的对照增加31.88%和17.73%。结论 酪醇和齐墩果酸可能通过上调酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白-1 mRNA的表达而增强正常人黑素细胞的黑素合成和酪氨酸酶活性:两者可能是女贞子中影响黑素细胞生物学活性的主要成分。     

表达人乳头瘤病毒6b和11型E6/E7基因的小鼠肿瘤细胞株的建立

目的 构建含有人乳头瘤病毒(HPV)6b和11型E6/E7基因的表达质粒和建立这些基因的转染细胞株。方法 分别将HPV6bE6、HPV6bE7、HPV11E6和HPV11E7克隆于含绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pcDNA3.1,经脂质体介导转染B16细胞,以G418筛选阳性克隆,荧光显微镜观察,RT-PCR鉴定mRNA转录。结果 通过酶切鉴定和基因测序证实,构建质粒中目的基因片段序列完全正确。转染后荧光显微镜下可观测到B16细胞发出绿色荧光。以G418筛选的抗性细胞克隆提取RNA并经RT-PCR扩增出与目的基因大小一致的基因片段。结论 建立的小鼠肿瘤细胞B16表达HPV6bE6、HPV6bE7、HPV11E6和HPV11E7基因。提示转染的细胞株可移植于小鼠,利于体内研究这些基因的生物学作用和免疫学机制。     

丹皮酚在体外对人黑素细胞酪氨酸酶活性及黑素生成的影响

目的探讨丹皮酚对人表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养体系酪氨酸酶活性及黑素生成的影响。方法培养人表皮黑素细胞及人表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养体系,利用四甲基偶氮唑蓝(MTT)还原法测定细胞活力,采用酶学方法测定酪氨酸酶活性,475nm比色法测定黑素含量。结果50,100和200μmol/L丹皮酚对于黑素细胞及共培养细胞酪氨酸酶活性及黑素生成均有较强的剂量相关性抑制作用,100及200μmol/L丹皮酚与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论丹皮酚对于共培养体系酪氨酸酶活性及黑素生成有较强的剂量相关性抑制作用。     

甘草黄酮对黑素细胞生物学作用的比较

目的 研究甘草黄酮对体外培养的鼠黑素瘤B16细胞及人表皮黑素细胞的生物学作用。方法 建立正常人表皮黑素细胞培养体系和培养黑素瘤B16细胞,添加甘草黄酮后,测定黑素细胞活力、酪氨酸酶活性以及黑素含量的变化,并与氢醌的作用结果进行比较。结果 两种黑素细胞对药物的反应有所不同。与氢醌比较,甘草黄酮具有较强的浓度依赖性黑素合成抑制作用,且对黑素细胞的细胞毒性较小。结论 用体外培养的人黑素细胞作为研究对象与鼠黑素瘤B16细胞比较具有一定的差异;甘草黄酮可作为一种安全有效的皮肤美白物质。     

甲氧沙林对人毛囊黑素细胞增殖、活化和黑素合成作用的研究

目的 研究甲氧沙林对人毛囊黑素细胞活化、增殖和黑素合成的影响.方法 体外培养正常人毛囊黑素细胞,观察不同浓度甲氧沙林(10～500μmol/L)对毛囊黑素细胞形态、增殖、酪氨酸酶活性和黑素合成的影响.结果 50μmol/L甲氧沙林处理细胞7d后,毛囊黑素细胞树突明显增多延长,胞浆内出现较多棕褐色颗粒,酪氨酸酶活性和黑素含量增加显着高于对照组(P<0.01).结论 甲氧沙林能诱导毛囊黑素细胞树突增多延长,酪氨酸酶活性和黑素含量增加.     

TOPO定向克隆和表达Ⅱ型单纯疱疹病毒gG基因的免疫优势表位片段

目的 通过基因工程技术,克隆和表达Ⅱ型单纯疱疹病毒gG基因的免疫优势表位片段。方法 以PCR法扩增HSV-2的gG基因的免疫优势表位片段;将PCR产物与TOPO定向表达载体连接;然后鉴定含有目的基因的重组表达载体;并转化BL21Star^TM菌株诱导表达目的蛋白;以免疫印迹法检测表达的目的蛋白。结果 PCR法扩增出616bp的DNA片段;通过PCR法及测序法证实重组质粒中含有616bp的DNA片段,其中99.5%序列与目的基因序列一致。SDS-PAGE结果显示重组蛋白在3h时的表达产量最高。免疫印迹法通过抗gG的单克隆抗体,证实重组蛋白在大肠杆菌中的表达。结论 Ⅱ型单纯疱疹病毒的gG免疫优势表位基因片段的成功表达,为制备国产的HSV-2血清诊断试剂提供资料。     

Ro60 cDNA的克隆及其重组杆状病毒表达载体的构建

目的 构建人Ro60cDNA的杆状病毒表达载体。方法 采用逆转录-PCR技术从Hela细胞RNA中扩增Ro60cDNA,定向插入杆状病毒转移载体pFastBacHTc,转化大肠杆菌DH10Bac进行转座,提取重组Bacmid,通过蓝白斑筛选和PCR进行鉴定。结果 成功从Hela细胞RNA中扩增出1.56kbRo60,所克隆的Ro60cDNA与已公布的序列完全符合,证明本克隆为Ro60cDNA的精确拷贝,并证实其目的基因与重组载体发生了特异转座和病毒重组,成功地构建了重组杆状病毒表达载体Bacmid-Ro60。结论 本实验成功克隆了Ro60cDNA并构建了其杆状病毒表达载体,为进一步表达Ro60蛋白和研究此抗原在红斑狼疮的发病机制奠定了基础。     

SV40TAg基因和Cre/loxP系统诱导正常人黑素细胞可逆性永生化的初探

目的:研究Cre/loxP系统和SV40TAg基因在体外对人正常黑素细胞的可逆性永生化诱导作用。方法:将Cre-ERT2反转录病毒导入包装细胞PA317,获得的病毒上清感染SV40TAg基因诱导转化的永生化黑素细胞,三苯氧胺(tamoxifen)诱导Cre重组酶表达,分别在第6天和第10天用PCR、反转录(RT)-PCR和免疫组化方法检测SV40TAg基因在感染病毒上清的永生化黑素细胞内的表达,并采用左旋多巴(L-Dopa)染色、透射电镜、软琼脂克隆试验等检测细胞的生物学性状和功能。结果:Cre重组酶反转录病毒上清感染永生化黑素细胞经嘌呤霉素筛选和三苯氧胺诱导Cre重组酶表达,第6天时可检测到感染细胞中有SV40TAg基因的表达,第10天后则在细胞中检测不到SV40TAg基因表达;L-Dopa染色、透射电镜等鉴定结果表明,感染细胞具有与原代黑素细胞相同的生物学性状和功能。结论:联合应用Cre/loxP系统和SV40TAg基因可以成功地诱导具有良好生物学安全性的人源性可逆性永生化黑素细胞。     

SV40TAg和Cre/loxP系统诱导的正常人可逆性转化黑素细胞在豚鼠体内的存活能力和复色实验

目的 研究SV40TAg基因和Cre/loxP系统在体外诱导正常人黑素细胞的可逆性转化以及转化细胞在豚鼠体内的存活能力和复色效果。方法 用Cre-ERT2病毒上清感染经SV40TAg基因转化的正常人黑素细胞（MCT）,诱导Cre重组酶表达（MCTC）;过氧化氢法建立黄褐色雄性豚鼠白癜风动物模型,按黑素细胞移植方法进行原代黑素细胞和MCTC移植,观察MCTC在豚鼠体内的存活能力及复色效果。结果 MCTC细胞移植实验结果显示,1个月左右移植区即可见色素沉着,连续观察3个月,可见0.5 ～ 1 cm的黑色斑片或褐色斑片形成,移植成功率为82.5%,原代黑素细胞移植成功率为76.7%。病理观察移植区有明显黑素沉积,部分毛囊内也可见黑素沉积。结论 联合应用SV40TAg基因和Cre/loxP系统可以成功地诱导具有良好生物学安全性的人源性可逆性永生化黑素细胞,具有与原代黑素细胞相似的在体存活率,具备在体黑素合成功能,可以达到良好的复色效果。     

微小RNA-let-7a对黑素瘤细胞系A375细胞凋亡的影响

目的 研究微小RNA（microRNA）-let-7a对黑素瘤细胞系A375细胞凋亡的影响及其作用机制。方法 采用实时荧光定量PCR法（TaqMan探针法）检测microRNA-let-7a在A375细胞及黑素细胞的表达差异;然后用microRNA-let-7a的模拟物转染A375细胞,流式细胞仪检测其凋亡的改变;最后采用Western印迹检测转染后半胱天冬酶-3（caspase-3）蛋白的变化。结果 与黑素细胞相比,microRNA-let-7a在A375细胞中表达下降了0.462倍;采用microRNA-let-7a的模拟物转染后,与阴性对照（细胞凋亡率16.9%）相比,A375细胞凋亡（细胞凋亡率47.4%）增加;转染后caspase-3蛋白表达下调。结论 microRNA-let-7a可促进黑素瘤细胞系A375的凋亡,同时下调caspase-3蛋白的表达。     

皮肤黑素瘤中miRNA-34c的表达对促血管新生因子VEGF-A、VEGFR-1的影响

目的探讨皮肤黑素瘤中miRNA-34c的表达以及其对促血管新生因子VEGF-A和VEGFR-1的影响。方法 Northern blotting检测原代人黑素瘤细胞、黑素瘤细胞株A375和原代人表皮黑素细胞miRNA-34c表达。构建miRNA-34c基因过表达与基因敲低的黑素瘤细胞株A375细胞系即高表达miRNA-34c组和低表达miRNA-34c组,以空载体转染黑素瘤细胞株A375作为空载体对照组。CCK-8法检测各组细胞增殖活性。qRT-PCR和Western blotting分别检测各组VEGF-A、VEGFR-1 mRNA和蛋白表达。结果与原代人表皮黑素细胞相比,黑素瘤细胞株A375和原代人黑素瘤细胞中miRNA-34c的表达降低(P<0.05)。高表达miRNA-34c组、低表达miRNA-34c组和空载体对照组细胞增殖活性无明显差异(P>0.05)。高表达miRNA-34c组VEGF-A、VEGFR-1的mRNA和蛋白表达较空载体对照组降低(P<0.05)。低表达miRNA-34c组VEGF-A、VEGFR-1的mRNA和蛋白表达较空载体组升高(P<0.05)。结论 miRNA-34c在皮肤黑素瘤中呈现特异性下调,miRNA-34c可能通过对促血管新生因子VEGF-A、VEGFR-1的下调参与皮肤黑素瘤的发生与发展。     

siRNA抑制生存素基因对恶性黑素瘤细胞A375凋亡的影响

目的 探讨RNA干扰技术抑制恶性黑素瘤细胞株A375生存素基因表达后,对A375细胞凋亡的影响。方法 构建针对凋亡抑制基因生存素的siRNA真核表达载体pU-生存素-siRNA,用电穿孔法转染A375细胞,采用蛋白质印迹技术检测生存素的表达,并用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。结果 转染pU-生存素-siRNA后,生存素在A375细胞中的表达(0.24±0.02)较对照组(0.98±0.21)明显下降,试验组细胞的凋亡率(83%)较对照组(28%)明显增加。结论 通过RNA干扰技术可抑制生存素的表达,诱导A375细胞的凋亡增加。     

原代人黑素细胞Wnt5A基因沉默的研究

目的 优化Wnt5A特异性siRNA转染原代人黑素细胞的实验条件,建立沉默Wnt5A基因的模型.方法 培养原代人黑素细胞,将不同浓度(0、20.0、33.3、40.0、60.0 nmol/L)的阳性参照基因GAPDH特异性siRNA通过脂质体法介导转染原代人黑素细胞,实时荧光定量PCR(qPCR)筛选转染效率最高的siRNA浓度;合成3条Wnt5A-siRNA(Wnt5A-siRNA-793、Wnt5A-siRNA-943、Wnt5A-siRNA-1743),分别转染原代人表皮黑素细胞,qPCR法选择干扰特异性最佳的Wnt5A-siRNA;用最佳Wnt5A-siRNA转染原代人黑素细胞,分别于培养24、48、72 h提取总mRNA及总蛋白,通过qPCR及Western印迹法确定转染效率最高的时间点.结果 0、20.0、33.3、40.0、60.0 nmol/L GAPDH-siRNA转染原代人黑素细胞后,GAPDH mRNA相对表达量分别为1.009±0.161、0.086±0.010、0.140±0.016、0.285±0.095、0.012±0.007,组间比较,差异有统计学意义(F=69.469,P＜0.05).60 nmol/L siRNA组GAPDH表达低于其他各组(均P＜0.05),干扰效率最佳;各Wnt5A-siRNA组及空白组Wnt5AmRNA相对表达量分别为0.331±0.010、2.229±0.029、0.078±0.006、1.000±0.024,差异有统计学意义(F=7 006.094,P＜0.05).Wnt5A-siRNA-1743组目标分子表达量低于其他3组(均P＜0.05),干扰效率最佳.Wnt5A-siRNA-1743转染原代人表皮黑素细胞后24、48、72 h及空白组Wnt5A mRNA相对表达量分别为0.396±0.002、0.026±0.008、0.131±0.079、1.025±0.276,组间比较,差异有统计学意义(F=29.215,P＜0.05),干扰后48 h低于干扰后24、72 h及空白组(均P＜0.05);Wnt5A蛋白相对表达量分别为112.798±0.218、77.765±0.415、30.540±0.219、130.025±0.158,组间比较,差异有统计学意义(F=79 122.889,P＜0.05),干扰后72 h低于干扰后24、48 h及空白组(均P＜0.05).结论 成功建立siRNA沉默人黑素细胞Wnt5A基因的模型.     

HPV-11 E7重组腺病毒体外转染树突细胞对其功能的影响

目的 研究腺病毒载体介导HPV-11 E7基因转染树突细胞(DC)对其表型和功能的影响。方法 用最佳感染滴度(MOI)重组腺病毒pAD-E7转染成熟DC,流式细胞仪检测转染前后DC表型变化,并用~3H-TdR掺入法检测转染前后DC刺激同种淋巴细胞增殖的能力及ELISA检测DC、T细胞共同培养上清中细胞因子的水平。结果 MOI 100为pAD-E7转染DC最佳滴度,pAD-E7转染成熟DC前后对细胞表面的特征性表型CD1a、CD83及CD40、HLA-DR无影响,转染后的DC仍具有较强的刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力,能刺激T细胞分泌大量IFN-γ、IL-12。结论 pAD-E7转染成熟DC对其功能无明显影响,转染后的DC与T细胞共孵育能诱导T细胞向Th1细胞极化。     

Ag85B真核表达载体的构建及其生物活性的研究

目的:研究Ag85B蛋白促PPD 人外周血单个核细胞的增殖活性。方法:用PCR技术扩增Ag85B基因,构建重组pcDNA3-Ag85B,并将其转染B16细胞株,用RT-PCR鉴定阳性细胞克隆,用Westernblotting鉴定其在阳性细胞克隆内的表达,用3H-TdR掺入法来检测Ag85B的促增殖活性。结果:获得了阳性B16细胞克隆,并鉴定在阳性细胞克隆内有Ag85B成熟蛋白表达;此阳性细胞克隆对PPD 人的PBMC具有较明显地促PBMC增殖活性。结论:转染了pcDNA3-Ag85B的B16阳性细胞克隆对PPD 人的PBMC具有较明显地促PBMC增殖活性,为Ag85B诱发抗肿瘤免疫应答及其机制的研究奠定了基础。     

人酪氨酸酶抗原表位肽的表达、纯化及生物学活性分析

目的 探讨人酪氨酸酶抗原表位肽在白癜风患者自身抗体检测中的表达.方法 目的基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌BL21菌株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,通过SDS-PAGE分析和蛋白质印迹鉴定目的蛋白表达,ELISA检测其生物学活性.结果 成功构建重组表达载体,SDS-PAGE和蛋白质印迹结果表明,重组蛋白成功表达.应用凝胶分析系统分析蛋白表达量发现,目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的90%.融合蛋白经过试剂盒纯化后,其蛋白纯度达95%以上.ELISA检测纯化蛋白的生物学活性,结果表明,纯化蛋白具有结合白癜风患者IgG的能力.结论 成功表达了人酪氨酸酶抗原表位肽,其表达蛋白具有生物学活性.