在小鼠骨髓移植中CCR5与急性移植物抗宿主病的相关性研究

本研究评价供者CCR5在经过强化预处理的骨髓移植动物模型受者体内的作用,为今后的异基因造血干细胞移植的临床应用提供科学依据.经过致死剂量照射的BALB/c小鼠接受异基因C57BL/6小鼠的骨髓移植.根据回输的细胞不同实验分为4组:B6 CCR5 KO组,受者接受C57BL/6 CCR5-/-小鼠骨髓和脾脏细胞;B6 WT组,受者接受野生型C57BL/6小鼠骨髓和脾脏细胞;B6 CCR5 KO BMC组,受者只接受C57BL/6 CCR5-/-小鼠骨髓细胞;B6 WT BMC组,受者只接受野生型C57BL/6小鼠骨髓细胞.结果表明:较之B6 WT组,B6 CCR5 KO组小鼠以更快的速度死于急性GVHD;其受者体内的CD8+T细胞更大量的增殖;其T细胞恢复后产生更多的INF-γ和TNF-α并且由于其T细胞有丝分裂原刀豆素水平处于较高水平,从而进一步促进T细胞的增殖,提示CCR5的作用之一是下调参与排异反应的供者CD8+T细胞的增殖.组织学评价提示,移植剔除CCR5基因受者细胞的小鼠肾脏出现了病理损伤并且肝脏存在有更为严重的病理变化.结论:剔除CCR5基因的异基因骨髓移植使GVHD发病率的增加,供者CD8+T细胞在受者体内增殖增加以及肝肾损害加重,这提示CCR5在异基因骨髓移植中起着重要作用.     

小鼠调节性树突状细胞分泌的外泌体诱导免疫耐受的实验研究

本研究探讨小鼠调节性树突状细胞（rDC）分泌的外泌体（regulatory exosomes，rDex）诱导免疫耐受的作用，并与正常未成熟树突状细胞的外泌体（immature exosomes，iDex）诱导免疫耐受的作用进行比较。取C57BL／6（H-2^b）小鼠骨髓细胞诱导未成熟树突状细胞（iDC），TGF—β1联合IL-10诱导调节性树突状细胞（rDC），流式细胞术检测两种DC的表型。采用超速离心结合膜超滤的方法分别提取rDex和iDex。建立小鼠皮肤移植模型．以C57BL／6小鼠为供者，以BALB／c（H-2^d）小鼠为受者，按对受者处理的不同实验分3组，iDex组术前7、3天受者经尾静脉注射10μg供者的iDex，rDex组术前7、3天受者经尾静脉注射10μg供者的rDex，另设PBS对照组，观察移植皮肤存活情况。通过单向混合淋巴细胞反应（MLR）观察供者及非亲缘异基因供者DBA／2对同种异基因小鼠T细胞增殖情况。结果表明：TGF—β1、IL-10可下调DC表面共刺激分子CD80、CD86、CD40的表达。移植皮片平均存活时间（MST），在对照组为7、8天，iDex组为10．7天，rDex组为18．8天；iDex组的移植皮片MST明显长于对照组（P〈0．05）；rDex组的移植皮片MST明显长于iDex组（P〈0．01）。MLR结果证明iDex组和rDex组B／C小鼠均对C57小鼠的脾细胞产生特异性耐受，尤其是rDex组；对非亲缘异基因DBA供者的脾细胞两组仍表现出强烈的免疫应答。结论：iDex和rDex均有诱导免疫耐受的作用，且rDex作用较iDex作用好。     

供者自然杀伤细胞减轻GVHD并提高移植成活率的实验研究

本研究观察激活的供、受者NK细胞能否减轻骨髓移植后GVHD和增加移植成活率。以C57BL／6小鼠作为供者，将接受6．5Gy^60COγ射线全身照射的BALB／c受鼠随机分为4组，对照1组（无任何处理）、对照2组（骨髓移植）、实验1组（骨髓移植同时输注激活的受者NK细胞）和实验2组（骨髓移植同时输注激活的供者NK细胞），观察每组小鼠的活存期、嵌合率、GVHD临床和病理改变。结果表明：对照1组全部活存，实验1组比对照2组活存期短（P〈0．05），实验2组比对照2组活存期延长（P〈0.01）。实验1组GVHD临床及病理评分高于对照2组（P〈0.05），实验2组GVHD临床及病理评分明显低于对照2组（P〈0.01）。实验1组和实验2组嵌合率均较对照2组高（P〈0．05），实验2组的嵌合率比实验1组明显增加（P〈0．01）。结论：激活的供者NK细胞能延长实验小鼠的活存期，降低GVHD严重程度，增加移植成活率；而激活的受者NK细胞却缩短实验小鼠的活存期，加重GVHD严重程度。受者NK细胞也增加移植成活率，但比供者NK细胞作用小。     

异基因骨髓源间充质干细胞移植形成稳定的嵌合体并诱导免疫耐受的研究

目的　探讨器官移植中间充质干细胞诱导免疫耐受的可能性。方法　雌性C57BL/6小鼠致死量照射后 ,移植同基因骨髓细胞和异基因骨髓源间充质干细胞 ,150d后以流式细胞仪检测其骨髓及脾脏的T细胞嵌合状态 ;以H3 TdR混合淋巴细胞反应 (MLR)和刀豆蛋白A(ConA)诱导增殖实验检测细胞移植组小鼠对供者来源细胞和有丝分裂原的反应性 ;以皮肤移植实验观测细胞移植组小鼠对供者来源组织器官移植物的反应性。结果　在细胞移植组小鼠脾脏中检测到供者来源T细胞占受者脾细胞 5 97% ;MLR反应中 ,细胞移植组小鼠的平均刺激指数 (SI)为 1 79,未处理组小鼠的平均SI为 7 2 8;在ConA诱导增殖实验中 ,细胞移植组小鼠的平均SI为 3 1 92 ,未处理组小鼠的平均SI为 3 4 99。细胞移植组小鼠供者来源皮肤移植物存活 >90d ,未处理组平均为 8d。结论　异基因骨髓源间充质干细胞移植后可形成稳定嵌合体 ,并诱导特异性免疫耐受的产生 ,使供者来源的皮肤移植物长期存活     

致敏动物模型的建立及其对造血干细胞植入的影响

本研究目的是建立致敏的动物模型，探索致敏动物体内免疫功能的改变，并探讨致敏对造血干细胞植入的影响。经尾静脉分别输注不同数量的C57BL／6脾细胞（1×10^5、1×10^6、1×10^6，连续注射2次，间隔7天）于BALB／c小鼠，通过补体依赖淋巴细胞毒性实验、混合淋巴细胞反应和ELISA等方法检测致敏模型的免疫功能。致敏BALB／c模型经8Gy^60Coγ-线照射后通过尾静脉或骨髓腔移植1×10^7C57BL／6骨髓细胞，观察移植后生存情况。结果表明：致敏BALB／c模型均产生不同强度的供者反应性抗体，1×10^6及1×10^6连续注射2次，间隔1周的致敏组脾细胞体外增殖均明显高于正常小鼠。各组致敏模型小鼠经尾静脉注射C57BL／6骨髓细胞后，均于移植后第9—15天死亡，1×10^6连续注射2次，间隔1周的致敏BALB／c模型经骨髓腔注射骨髓细胞后亦于2周内死亡。结论：通过同种异基因的脾细胞输注建立不同致敏程度的动物模型，该致敏模型小鼠体内免疫功能的变化与致敏程度有关。脾细胞输注致敏使受者对供者造血干细胞产生排斥作用，而骨髓腔注射方法并不能改善植入。     

异基因NK细胞在白血病小鼠单倍体相合骨髓移植中的作用

本研究观察异基因NK细胞在白血病小鼠单倍体相舍骨髓移植中的作用。建立荷EL9611（H-2^d）红白血病细胞的CB6F1^H-2b/d小鼠动物模型,5天后将其随机分为7组,每组10只。CB6F1^2b/d受鼠为移植组,9Gy（^60Co）照射后以C57BL／6^h-2b为供鼠,进行骨髓移植。对照组分为5组：对照1组为未治疗组;对照2组为单纯照射组;对照3组为阿糖胞苷治疗组：小鼠腹腔注射阿糖胞苷50mg／kg×6d;对照4组为单纯骨髓细胞移植组：小鼠照射后4小时移植C57BL／6^h-2b小鼠骨髓细胞;对照5组为GVHD对照组：小鼠照射后4小时移植C57BL／6^H-2b小鼠骨髓细胞和脾细胞。实验组分为2组：实验A组,照射后输注C57BL／6^H-2b小鼠NK细胞1×10^6／只,4小时后移植C57BL／6^H-2b。小鼠骨髓细胞;实验B组：照射后同实验1组,4小时后移植C57BL／6^H-2b小鼠骨髓细胞和脾细胞。以血象、体重、生存期和病理组织学变化为观察指标并作组间比较。结果表明,对照1、2、3、5组小鼠生存期分别为（10．10±0．88）天、（9．80±0．92）天、（22．70±3．23）天、（20．10±1．73）天,对照4组生存期为（30．10±15．95）天,其中2只小鼠超过30天;实验A、B组小鼠生存期分别为（39．10±18．11）天、（49．30±17．24）天,实验1组4只小鼠生存期超过30天,实验2组7只生存期超过30天,其中实验1组与对照1、2、3、5组比较均有显著性差异（P〈0．01）,实验2组同其他组比较均有显著性差异（P〈0．05）。因白血病死亡的小鼠,可见肝脾明显肿大,结构破坏,有大量白血病细胞浸润。实验组长期存活的小鼠出现Y染色体（嵌合率80％-90％）。结论：在荷EL9611（H-2^d）红白血病细胞CB6F1^H-2b小鼠模型的单倍体相合骨髓移植中供者NK细胞具有杀灭白血病细胞并降低GVHD的双重作用。     

同种异基因小鼠骨髓移植后脾细胞的动力学研究

本研究建立同种异基因小鼠骨髓移植模型,监测移植后脾细胞的动力学变化,了解移植后外周免疫器官的免疫重建。供鼠为C57BL／6小鼠,受鼠为BALB／c小鼠。将受鼠分为单纯照射组（R组）、照射＋输注骨髓单个核细胞组（B组）、照射＋输骨髓单个核细胞＋输脾单个核细胞组（S组）。移植后观察小鼠体重、体位、活动性、毛发、腹泻及生存期,每周检测外周血白细胞及血红蛋白,于移植后第2、7、14、27、60天计数S组小鼠脾脏单个核细胞数,检测S组小鼠脾脏单个核细胞中CD3^＋、CD4^＋、CD8^＋、B220^＋及CD11c^＋细胞的相对计数,濒死前行肝、小肠、皮肤病理检查。结果显示：S组小鼠中89％于移植后第6—78天死于aGVHD。移植后脾脏单个核细胞迅速下降,于移植后第2天降至最低点,持续至第7天,之后逐渐回升,第14天升至移植前水平;CD8^＋细胞和B220^＋细胞于移植后第2天基本降至最低点,CD8^＋细胞恢复最快,在第7天接近移植前水平,且大多为供者型,而B220^＋细胞恢复最慢,从第2—14天持续低水平,之后逐渐回升,但直至第60天仍未恢复至移植前水平;CD3^＋细胞和CD4^＋细胞降低缓慢,于第7天开始出现少量供者型细胞,总的比例逐渐下降,至14天降至最低点,之后逐渐回升,第60天时均恢复至移植前水平;CD11c^＋细胞移植后除第14天升高外,其它时间点比例变化不明显,也是由受者型逐渐向供者型转化。结论：C57BL／6为供体,BALB／c为受体并给予7．5Gy^60 Coγ清髓的预处理条件下,输注骨髓单个核细胞1×10^7,脾单个核细胞1×10^7建立同种异基因移植模型,移植后脾细胞呈明显的动力学变化,CD8^＋细胞重建最快．茸次为CD3^＋、CD4^＋细胞．B220^＋细胞重建最慢。     

1型糖尿病小鼠同基因骨髓移植治疗后的免疫变化

摘要本研究旨在观察同基因骨髓移植（syn—BMT）治疗1型糖尿病（T1D）4、鼠前后外周血T淋巴细胞亚群、NK细胞比例的变化。探讨其在小鼠T1D的发生及同基因骨髓移植在诱导T1D小鼠恢复免疫耐受中的作用。选取C57BL／6J小鼠以链脲佐菌素腹腔注射建立T1D模型,并将成模小鼠分为病鼠移植组及病鼠对照组;另取正常C57BL／6J小鼠6只作为正常对照组。病鼠移植组小鼠于成模后第10天行同基因骨髓移植治疗;正常对照组和病鼠对照组不作处理。每10天监测1次正常对照组、病鼠对照组、病鼠移植组空腹血糖;每3天监测1次病鼠移植组小鼠移植后血象。小鼠成模后第10天即移植治疗当天及移植后30天分别取正常对照组、病鼠对照组及病鼠移植组小鼠外周血标本,用流式细胞术测定外周血T淋巴细胞亚群、NK细胞比例。结果显示,syn—BMT后,小鼠空腹血糖逐渐下降,至移植后25天,与正常对照鼠相比无差异,显著低于对照病鼠;移植后小鼠外周血白细胞和血小板计数分别在接受预处理及骨髓移植后3天和6天达最低值,此后逐渐上升,至移植后27天基本恢复正常。糖尿病小鼠外周血CD4^＋T淋巴细胞比例、CD4^＋／CD8^＋T淋巴细胞比值和NK细胞比例均较正常对照鼠明显升高（P〈0．01）,CD8^＋T淋巴细胞比例较正常对照鼠显著下降（P〈0．01）。syn．BMT后CD4^＋T淋巴细胞比例、CD4^＋／CD8^＋T淋巴细胞比值和NK细胞比例较对照病鼠不同程度的降低,CD8^＋T淋巴细胞比例较对照病鼠及正常对照鼠明显升高（P〈0．01）。结论：同基因骨髓移植可以逆转糖尿病小鼠的高血糖状态。糖尿病小鼠发病初期,外周血CD4^＋T淋巴细胞比例、CD4^＋／CD8^＋T淋巴细胞比值和NK细胞比例增高及CD8^＋T淋巴细胞比例降低,这些变化可能与糖尿病的发生有关。同基因骨髓移植可以不同程度的逆转糖尿病小鼠的免疫紊乱。     

同种与异种胎胸腺混合移植诱导供者皮肤移植免疫耐受

目的:探讨同种异种胎胸腺混合移植达到供者皮肤移植的耐受。方法:实验于2003-03/12在第三军医大学创伤、烧伤、复合伤实验室完成。将F344大鼠胎胸腺和C57BL/6小鼠胎胸腺混合移植到BALB/C裸小鼠的双肾包膜下4个月后,用流式细胞仪技术检测裸小鼠外周血中CD3+和CD4+T细胞,用单向混合淋巴细胞培养了解T细胞对ConA以及同种异种淋巴细胞的反应性,异基因皮肤移植观察皮肤移植物存活期。结果:①混合移植胎胸腺4个月后,受者裸小鼠外周血中CD3+和CD4+T细胞占总白细胞的25.9%,正常裸小鼠外周血中CD3+和CD4+量极少(2.43%)。②受者T细胞对ConA以及无关的SD鼠异种淋巴细胞的反应性强(刺激指数分别为23.23与12.75),而对供者F344及C57BL/6淋巴细胞不发生增殖反应(刺激指数分别为1.12与0.98)。③受者对供者F344及C57BL/6鼠皮肤移植物86d不发生排斥,而对无关的SD鼠皮肤移植物15d即发生排斥。结论:受体对胸腺供体来源的F344和C57BL/6皮肤及宿主本身的BALB/C皮肤移植耐受,而对无关的SD鼠皮肤移植物较短时间内即发生了排斥,并且抗DNA自身抗体水平与正常鼠相似。表明同种和异种胸腺混合移植后受体可重建有免疫功能的T淋巴细胞,并能诱导供者特异性免疫耐受的发生。     

IFN-γ对造血干细胞移植后肺部GVHD的作用

目的:探讨IFN-γ对造血干细胞移植后肺部GVHD的作用。方法:应用C57BL/6J和B6D2F1小鼠通过造血干细胞移植(HSCT)建立小鼠GVHD模型。根据移植的方式将小鼠分为3组:同基因HSCT组(C57BL/6J→C57BL/6J),异基因HSCT组(C57BL/6J→B6D2F1)及IFN-γ-/-异基因HSCT组(IFN-γ-/-C57BL/6J→B6D2F1)。移植后分析比较3组小鼠生存期、aGVHD临床评分及肺组织病理,检测肺泡灌洗液中总细胞数及小鼠IFN-γ水平。结果:同基因移植组小鼠第42天全部存活,无aGVHD临床症状。异基因移植组小鼠有aGVHD表现,24 d生存率大于50%,GVHD临床评分高于同基因移植组。在移植后第28天肺组织病理可见肺泡出血及淋巴细胞浸润。IFN-γ-/-异基因移植组小鼠出现致死性aGVHD表现,14 d内小鼠全部死亡,GVHD临床评分第1周就高达6.7±0.83,明显高于异基因移植组,小鼠肺组织发生严重的aGVHD病理改变,其支气管肺泡灌洗液中总细胞数在移植后第1周较其他两组明显增高,但其血清中IFN-γ含量明显低于异基因移植组及同基因移植组(P0.05)。结论:供者来源的IFN-γ对造血干细胞移植后肺组织起重要的免疫保护作用。     

Differential effects of the absence of interferon-gamma and IL-4 in acute graft-versus-host disease after allogeneic bone marrow transplantation in mice.

Graft-versus-host disease (GVHD), in which immunocompetent donor cells attack the host, remains a major cause of morbidity after allogeneic bone marrow transplantation (BMT). To understand the role of cytokines in the pathobiology of GVHD, we used cytokine knockout (KO) mice as a source of donor T cells. Two different MHC-disparate strain combinations were examined: BALB/c (H2(d)) donors into lethally irradiated C57BL/6 (H2(b)) recipients or C57BL/6 (H2(b)) donors into B10.BR (H2(k)) recipients. Donor cells were from mice in which either the interferon-gamma (IFN-gamma) or the IL-4 gene was selectively disrupted to understand the role of these cytokines in acute GVHD. In both strain combinations the same pattern was noted with regard to GVHD onset and morbidity. All mice exhibited the classic signs of acute GVHD: weight loss with skin, gut, and liver pathology resulting in morbidity and mortality. Surprisingly, donor cells obtained from mice lacking IFN-gamma gave rise to accelerated morbidity from GVHD when compared with cells from wild-type control donors. Similar results were obtained using normal donors when neutralizing antibodies to IFN-gamma were administered immediately after the BMT. These results suggest that IFN-gamma plays a role in protection from acute GVHD. In marked contrast, cells obtained from IL-4 KO mice resulted in protection from GVHD compared with control donors. Splenocytes from IFN KO mice stimulated with a mitogen proliferated to a significantly greater extent and produced more IL-2 compared with splenocytes obtained from IL-4 KO or control mice. Additionally, there was increased IL-2 production in the spleens of mice undergoing GVHD using IFN-gamma KO donors. These results therefore indicate, with regard to the TH1/ TH2 cytokine paradigm, the absence of a TH1-type cytokine can be deleterious in acute GVHD, whereas absence of a TH2 cytokine can be protective.     

Intestinal graft-versus-host disease is initiated by donor T cells distinct from classic cytotoxic T lymphocytes

In these studies, the role of T helper and T cytotoxic cells in generating intestinal graft-vs.-host disease (GVHD) was examined. Treatment of C57BL/6J (B6) splenocytes with L-leucyl-L-leucine methyl ester (Leu-Leu-OMe) selectively removes natural killer cells, cytotoxic T lymphocyte (CTL) precursors, and the capacity to cause lethal GVHD in irradiated B6xDBA/2 F1 (B6D2F1) mice while preserving T helper cell function. Neither control nor Leu-Leu-OMe-treated DBA/2 donor spleen and bone marrow cells were found to induce lethal GVHD in B6D2F1 recipients. However, extensive colonic GVHD developed in B6D2F1 recipients of DBA/2 bone marrow and spleen cells. Enteropathic GVHD in DBA/2----B6D2F1 mice was reduced in severity after anti-L3T4 + C treatment of donor cells, and was eliminated by anti-Thy1.2 + C or the combination of anti-L3T4 and anti-Lyt2 + C treatment of the donor cell inoculum. However, neither anti-Lyt2 + C, Leu-Leu-OMe, nor anti-Lyt2 + C and Leu-Leu-OMe treatment of donor cells significantly decreased severity of gut GVHD. Leu-Leu-OMe treatment of DBA/2 or B6 SpC was comparably effective in preventing in vitro or in vivo generation of B6D2F1-specific CTL. These findings, therefore, demonstrate that histologically severe enteropathic GVHD does not require participation of CTL and is not always associated with high mortality rates.     

非清髓造血干细胞移植后致敏供者淋巴细胞输注对嵌合状态及GVHD影响的实验研究

本研究目的是探讨经受者皮肤致敏后的异基因供者淋巴细胞输注(DLI)是否能在促进形成完全供者嵌合(CC)的同时减轻移植物抗宿主病(GVHD)。以C57BL/6小鼠(H-2b,B6)为受者,于第0天接受60Coγ线全身照射(TBI),总剂量为5.5Gy,照射当天移植经粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员后的BALB/c小鼠(H-2d,BA)外周血干细胞(2×107个),移植后第2天腹腔注射环磷酰胺200mg/kg,并分别于移植后第28天输注致敏/未致敏的供者淋巴细胞2×106。结果显示,致敏后DLI的受鼠(黑色)无1例出现GVHD,60天时转变为完全供者嵌合,表型明显呈现为供鼠(白色)特征,CD4+/CD8+T淋巴细胞比值在DLI后早期下降,半月后有所升高,但仍低于正常水平;未致敏的DLI受鼠出现不同程度的GVHD,嵌合率稍有上升,仍表现为混合嵌合体(MC),CD4+/CD8+比值在DLI后早期升高,后期降至正常水平。结论:经受者皮肤致敏后的DLI在诱导CC的同时降低GVHD发病率,CD4+/CD8+比值与GVHD发病率间具有良好的相关性。     

Bone marrow NK1.1(-) and NK1.1(+) T cells reciprocally regulate acute graft versus host disease

Sorted CD4(+) and CD8(+) T cells from the peripheral blood or bone marrow of donor C57BL/6 (H-2(b)) mice were tested for their capacity to induce graft-versus-host disease (GVHD) by injecting the cells, along with stringently T cell-depleted donor marrow cells, into lethally irradiated BALB/c (H-2(d)) host mice. The peripheral blood T cells were at least 30 times more potent than the marrow T cells in inducing lethal GVHD. As NK1.1(+) T cells represented <1% of all T cells in the blood and approximately 30% of T cells in the marrow, the capacity of sorted marrow NK1.1(-) CD4(+) and CD8(+) T cells to induce GVHD was tested. The latter cells had markedly increased potency, and adding back marrow NK1.1(+) T cells suppressed GVHD. The marrow NK1.1(+) T cells secreted high levels of both interferon gamma (IFN-gamma) and interleukin 4 (IL-4), and the NK1.1(-) T cells secreted high levels of IFN-gamma with little IL-4. Marrow NK1.1(+) T cells obtained from IL-4(-/-) rather than wild-type C57BL/6 donors not only failed to prevent GVHD but actually increased its severity. Together, these results demonstrate that GVHD is reciprocally regulated by the NK1.1(-) and NK1.1(+) T cell subsets via their differential production of cytokines.     

供体淋巴细胞在GVHD模型小鼠组织器官中迁移和分布的动态观察

本研究应用小鼠GVHD模型探讨异基因T淋巴细胞在移植受体体内的迁移和分布。将C57BL／6的骨髓细胞和转基因荧光C57BL／6小鼠的脾淋巴细胞输入经8Cy全身照射的BALB／c小鼠，建立eGFP标记供体淋巴细胞的GVHD小鼠模型；应用荧光显微镜和流式细胞术观测GVHD模型中eGFP^＋细胞的分布；ELISA法检测GVHD靶组织中趋化因子MIP—1α水平的改变。结果表明：①输入脾细胞和骨髓细胞第8天后出现GVHD临床及病理表现；②CVHD模型中，受体鼠肝、皮肤、肠、脾、肺、舌有eGFP^＋细胞浸润；③GVHD小鼠肝、脾eGFP^＋细胞中CD4^＋、CD8^＋细胞比例均逐渐升高；④GVHD鼠脾、肝组织中MIP—1α水平升高，脾中MIP-1α水平高峰出现于移植后第3天，肝中MIP—1α水平高峰出现于移植后第7天。结论：除肝、肠、皮肤外，肺、舌可能也是GVHD靶器官。肝、脾组织中供体淋巴细胞浸润伴随MIP—1α水平的升高。     

TBI和环磷酰胺选择性去除同种异基因反应供者淋巴细胞的研究

本研究用全身照射(TBI)和环磷酰胺(CY)选择性去除同种异基因反应的供者淋巴细胞,为预防移植物抗宿主病(GVHD)的发生探索新的手段。以(BALB/c×C57BL/6)F1雌性小鼠(H-2d/b)为受鼠,于第0天接受亚致死量的60Co-γ射线全身照射,总剂量为4Gy,第1天接种P388D1白血病细胞,第2天输注由C57BL/6雄性小鼠(H-2b)为供鼠提供的MHC不匹配的供者脾淋巴细胞,在造血干细胞移植前诱导移植物抗白血病效应(GVL)。第6天腹腔注射环磷酰胺(CY)200mg/kg或再次TBI9Gy,选择性去除同种异基因反应供者淋巴细胞,第7天输注(BALB/c×C57BL/6)F1雄性小鼠(H-2d/b)提供的骨髓造血干细胞。结果显示:以CY和TBI选择性去除同种异基因反应供者淋巴细胞组的小鼠无白血病和GVHD的发生,生存期超过了210天,于移植后第21天出现完全供者嵌合,然后嵌合率下降,第90天表现为混合嵌合体(MC)。对照组的小鼠出现了白血病和GVHD,出血、感染明显,生存期短,为20-36天(P<0.01)。结论:同基因骨髓移植前输注不相匹配的供者脾细胞诱导GVL效应,然后再通过TBI和CY选择性去除同种异基因反应的供者淋巴细胞来预防移植物抗宿主病(GVHD)的发生是可能的。     

PTD-mFoxp3融合蛋白对异基因骨髓移植后移植物抗宿主病的影响

本研究探讨静脉输注PTD—mFoxp3融合蛋白对同种异基因骨髓移植后移植物抗宿主病的影响。10周龄C57BL／6小鼠为受体并随机分为A、B、c3组,每组10只,移植当天（第0天）接受直线加速器x射线6．0Gy全身照射,4-6h内输注供体BALB／c鼠全骨髓细胞3×10^7＋脾细胞1．5×10^7个。A组于移植前2d和移植后0、1、3、5、7、9、11、13d间断多次输入生理盐水,B组输入mFoxp3蛋白,c组输注等量PTD．mFoxp3融合蛋白。移植后每天观察受体有无移植物抗宿主病的表现;取受体肝脏、空肠上端组织做病理学检查,判断组织损伤及淋巴细胞浸润程度;用ELISA法检测受体外周血中炎性因子IL-2及INF．1浓度;流式细胞术测定长期存活受体外周血供体细胞的比例。结果表明,照射后60d内A、B和c组受体平均生存期分别为（32．95±5．48）d、（38．00±5．45）d和（55．30±3．15）d;病理组织学观察示,A组和B组的小肠及肝脏发生明显的损伤,符合GVHD的表现,c组的病理损伤较轻;酶联免疫吸附测定表明,c组IL-2及IFN-γ浓度明显低于A和B组;长期存活的受体形成了稳定的嵌合体状态,移植后60dA、B、C组活存动物供体细胞比例分别为（79．46±1．80）％、（79．13±2．23）％和（85．92±2．82）％。结论：PTD-mFoxp3融合蛋白可有效降低同种异基因骨髓移植后移植物抗宿主病的发生,并减轻其临床表现,降低死亡率。     

体外阻断CD137-CD137L途径控制小鼠移植物抗宿主病的研究

目的探讨体外阻断活化的供鼠T淋巴细胞CD137-CD137L共刺激途径控制小鼠异基因骨髓移植（allo-BMT）后急性移植物抗宿主病（aGVHD）及其机制。方法供、受鼠的淋巴细胞体外混合培养，分别加入抗CD137L单抗或不加抗CD137L单抗培养后与供鼠骨髓细胞混合移植给受鼠。采用流式细胞术检测移植后受鼠T细胞亚群的变化，RT-PCR法检测细胞因子mRNA表达水平的变化，观察移植后受鼠GVHD的临床及病理改变。结果与未用抗CD137L单抗组相比，应用抗CD137L单抗组CD3^＋CD8^＋T细胞明显降低（P＜0．01）；IFN-γ表达水平明显减低（P＜0．01），IL-10的表达水平明显升高（P＜0．01）。移植后未预防GVHD组（A组）小鼠移植后15d内均死于aGVHD。采用甲氨蝶呤＋环孢素预防GVHD组（B组）小鼠100％发生aGVHD，但临床及病理改变程度较A组轻，平均存活时间[（9．5±2．5）d]较A组[（7．5±1．5）d]略有延长。采用抗CD137L单抗预防GVHD组（C组）受鼠aGVHD的发生率为70％，程度比A、B两组轻，与A、B两组相比生存率明显提高（P＜0．01），平均存活时间[（16．0±2．5）d]明显延长（P＜0．01），30％的小鼠生存时间大于30d。结论抗CD137L单抗体外阻断CD137-CD137L共刺激途径能有效控制小鼠GVHD，可能与影响Ⅰ类和Ⅱ类T细胞因子平衡有关。     

体外转染mFasL-cDNA小鼠骨髓细胞预防移植物抗宿主病的实验研究

为了探讨通过Fas FasL途径清除骨髓移植物中T细胞后 ,预防移植物抗宿主病 (GVHD)的可能性 ,采用脂质体转移法将FasL cDNA转染雌性BALB/c小鼠骨髓细胞 ,证实其获得表达后 ,体外与雄性BAC (BALB/c×C57BL/ 6)小鼠骨髓移植物混合培养后输注给经致死照射的BALB/c鼠 ,然后观察受体鼠GVHD的表现、死亡率 ,进行组织病理学检查 ,骨髓细胞Y染色体及CFU S检测。结果表明 :实验组 10只小鼠 ,60天死亡 2只 ,4只有GVHD改变 ;对照组 10只 ,60天死亡 7只 ,10只均有GVHD改变 ;两组骨髓细胞Y染色体分析显示均有供体鼠来源的骨髓细胞植入 ;CFU S检测表明实验组动物体内 10天即有CFU S形成 ,移植后第 2 0天即达正常水平。结论 :转染mFasL cDNA小鼠骨髓细胞能有效地预防GVHD的发生 ,并能使受体造血功能获得重建。