克隆化兔骨髓基质干细胞系的建立及其生物学特性

建立克隆化兔骨髓基质干细胞系，为组织缺损修复研究寻找理想的种子细胞提供新的途径。方法：实验于2004—09／2005—12在浙江省医学科学院生物工程研究所完成。①取3个月龄新西兰白兔，无菌抽取骨髓液，经密度梯度离心和贴壁培养，获得原代培养骨髓基质干细胞。用有限稀释法进行克隆化培养，选择单细胞克隆增殖细胞，进行扩大培养和液氮冻存保种。②取对数生长期第2，15和32代克隆化骨髓基质干细胞，用四甲基偶氮唑盐法测定其吸光值（A值），绘制生长曲线。⑧取第4和32代对数生长期骨髓基质干细胞，按常规方法制作染色体标本，进行染色体分析。④取第5代对数生长期骨髓基质干细胞，用成骨诱导试验进行体外分化潜能鉴定。⑤取第5代对数生长期的骨髓基质干细胞．按常规方法测定最适细胞接种密度。结果：①克隆化兔骨髓基质干细胞系的建立结果：获得一株克隆化兔骨髓基质干细胞系，其细胞形态为均一的长梭形，体外连续传代培养至32代，细胞仍保持旺盛的增殖能力。经-196℃冻存复苏后仍保持良好的生长状态。②生长曲线：克隆化骨髓基质干细胞的第2，15和32代细胞生长曲线基本相同，细胞增殖速度没有明显的下降趋势。⑧染色体分析：第4和32代克隆化兔骨髓基质干细胞的染色体众数均为44条，结构未见异常。显示该细胞在体外经过32代培养，仍保持稳定的二倍体核型。④最适接种密度：第5代对数生长期骨髓基质干细胞，经常规方法测定，以1&;#215;10^3／cm^2的接种密度为最适接种密度。⑤体外分化潜能：第6代克隆化骨髓基质干细胞，在向成骨细胞诱导条件下，4，8，12碱性磷酸酶的表达均显著高于对照组[（375．41&;#177;13．17）比（239．38&;#177;7．33）nkat／L，（503．77&;#177;13．34）比（249．22&;#177;5．17）nkat／L，（605．95&;#177;10．84）比（298．73&;#177;8．17）nkat／L．P〈0．01]；茜素红染色显示有钙化结节形成，对照组为阴性。表明克隆化兔骨髓基质干细胞具有体外诱导分化潜能。结论：采用克隆化分离技术，成功获得了单细胞克隆的具有旺盛增殖能力和分化潜能，遗传性能稳定的兔骨髓基质干细胞系。     

人骨髓基质干细胞的单细胞克隆培养与鉴定

背景：骨髓基质干细胞缺乏特异的表面识别分子,其鉴定一直是研究中的难题。目的：探索人骨髓基质干细胞培养条件,获得体外克隆化培养的成人骨髓基质干细胞,并对其进行表型分析及分化潜能鉴定。方法：外科手术取髂骨术中抽取骨髓,采用密度梯度离心法初步分离骨髓基质干细胞,用极限稀释法进行克隆化培养;流式细胞仪对克隆化培养的骨髓基质干细胞进行细胞表面标志检测,并进行体外成软骨、成骨及心肌细胞诱导,免疫组织化学及RT-PCR检测成软骨、成骨及心肌细胞表达,确定其表型及分化潜能。结果与结论：单个细胞来源骨髓基质干细胞在体外1：3传代一般可以传28代左右,24代以前生长状态良好;经流式细胞仪检测,骨髓基质干细胞表达CD29,CD44,CD106,不表达CD14,CD34,CD45,HLA-DR;骨髓基质干细胞体外可向成骨、成软骨及心肌细胞分化,提示体外克隆化培养的骨髓基质干细胞能维持良好的成体干细胞生物学特性。     

Transwell小室环境下兔成骨样细胞与骨髓基质干细胞的共培养及成骨分化

背景:以往在体外采用地塞米松、生长因子或用成骨样细胞与骨髓间充质干细胞按1∶1混合培养诱导成骨均存在种种局限。目的:观察在 Transwell小室环境下成骨样细胞与骨髓基质干细胞体外共培养及成骨样细胞定向诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的可行性。方法:取第 3代乳兔成骨样细胞与第3代兔骨髓基质干细胞接种共培养于Transwell小室内,成骨样细胞接种于培养板底层,骨髓基质干细胞接种于 Transwell膜内膜上作为实验组。以骨髓基质干细胞单独接种于Transwell 小室内,下层为基础培养液作为对照组。结果与结论:实验组共培养骨髓基质干细胞明显向成骨细胞分化,细胞碱性磷酸酶活性显著高于对照组(P < 0.05)。实验组骨髓基质干细胞茜素红染色强阳性,可见呈红色结节,经PT-PCR扩增后,可见成骨启动基因核心结合因子α1的表达;对照组未见矿化结节。说明应用Transwell小室可实现成骨样细胞与骨髓基质干细胞体外共培养,并能定向诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化。     

体外培养羊骨髓来源间充质干细胞的生物学特性观察

背景:目前关于鼠、兔等小动物骨髓来源间充质干细胞的研究较多,但涉及大动物骨髓来源间充质干细胞的报道甚少.目的:体外培养羊骨髓来源间充质干细胞,并了解其生物学特性.方法:取健康10月龄中国山羊1只,麻醉后于髂后上棘穿刺抽取骨髓5mL,采用全骨髓培养法接种于无菌塑料培养瓶中,加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基.待细胞达80%-90%融合后,胰蛋白酶消化传代.取P3代处于对数生长期的细胞予以冻存,然后进行复苏.倒置显微镜下观察细胞形态变化,MTT法测定细胞生长曲线,Yon Kossa's染色检测成骨诱导分化潜能.结果与结论:原代培养羊骨髓来源间充质干细胞贴壁生长,呈梭形;P3代后细胞形态基本一致,均为长梭状;冻存复苏后细胞贴壁较传代细胞稍慢,细胞形念和活性与传代细胞没有明显差别.P3-P5代细胞生长周期基本一致,接种后两三天为生长迟滞期,3 d后进入对数生长期,六七天为生长平台期,其后牛长速度减缓.羊骨髓来源间充质干细胞成骨诱导3周后,Von Kossa's矿化结节染色呈阳性.证实所培养的羊骨髓来源间充质干细胞具有较强的遗传稳定性和增殖能力,可向成骨细胞定向分化.     

兔下颌骨来源骨髓间充质干细胞的体外培养及生物学特性

背景：以往研究表明骨髓间充质干细胞的获取来源主要是股骨或髂骨,但下颌骨来源骨髓间充质干细胞的研究至今少有报道。目的：观察兔下颌骨来源的骨髓间充质干细胞体外分离、培养及其生物学特性。方法：体外分离培养兔下颌骨骨髓间充质干细胞,取第2或3代检测。MTT法检测细胞增殖,克隆形成试验检测细胞的克隆形成率变化,并对其进行成骨和成脂肪诱导分化。结果与结论：MTT法检测细胞增殖,细胞生长曲线显示下颌骨骨髓间充质干细胞经历潜伏期、对数生长期和平台期。细胞克隆形成实验显示,细胞呈成纤维集落形成单位外观。茜素红、油红O染色结果显示,成骨诱导、成脂诱导后形成钙结节及脂滴。结果证实,兔下颌骨分离出的骨髓间充质干细胞有强大的自我复制及增殖能力,具有多向诱导分化的潜能。     

5-氮胞苷体外诱导大鼠骨髓基质干细胞向心肌样细胞的分化

背景:骨髓基质干细胞具有扩增迅速、分化潜能广泛等特点,因此建立骨髓基质干细胞的体外定向诱导模型有利于组织工程学研究.目的:探讨应用5-氮胞苷体外诱导大鼠骨髓基质干细胞向心肌样细胞分化的可能性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-06/2008-06在辽宁医学院附属第一医院中心实验室完成.材料:SD大鼠20只,由辽宁医学院实验动物中心提供.5-氮胞苷为Sigma公司产品.方法:大鼠麻醉后,分离股骨和胫骨,全骨髓法+贴壁法分离培养骨髓基质干细胞,待细胞生长融合至90%后传代扩增.取P3代骨髓基质干细胞,以2×10~4/孔密度接种于24孔培养板,分别加入5,10,15,20 μmol/L 5-氮胞苷诱导培养,同时设立不加诱导剂的空白对照,诱导24 h后更换为正常培养液继续培养至3周.主要观察指标:细胞形态及生长曲线,诱导后细胞形态变化,诱导后细胞连接蛋白43和α-横纹肌肌动蛋白的表达.结果:①培养的骨髓基质干细胞大多呈梭形,有时可见细胞融合,P3代细胞接种后第1,2天为静止生长期,从第3天开始进入对数生长期,第9天达高峰,以后进入平台期,第12天细胞数量开始减少.②5 μmol/L 5-氮胞苷诱导后,骨髓基质干细胞形态无明显变化;10 μmol/L 5-氮胞苷诱导后骨髓基质干细胞变长,宽大,并朝一个方向延伸,具有肌管形成细胞的形态特点;15 μmol/L 5-氮胞苷诱导后,24孔板周边区有少量细胞存活;20 μmol/L 5-氮胞苷诱导后细胞死亡.③经10 μmol/L5-氮胞苷诱导3周后.骨髓基质干细胞胞浆内可见连接蛋白43和α-横纹肌肌动蛋白的表达;空白对照组均呈阴性表达.结论:骨髓基质干细胞自身无法向心肌细胞方向转化,体外经5-氮胞苷诱导后具有向心肌细胞分化的潜能.5-氮胞苷浓度过低不能起到诱导分化作用,浓度过高则会造成细胞大量死亡,10 μmol/L为较适宜的诱导浓度.     

兔骨髓间充质干细胞体外培养定向诱导分化为软骨细胞

背景:骨髓间充质干细胞具有分化为骨、软骨、肌腱、脂肪等组织的多分化潜能.目的:体外培养兔骨髓间充质干细胞并定向诱导分化为软骨细胞,探讨体外诱导分化为软骨的方法和条件.方法:取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子体外培养后,取第3 代细胞在培养基中添加不同质量浓度转化生长因子β1 的软骨分化诱导剂,2 周后倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色,RT-PCR技术检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达.结果与结论:可以从兔骨髓中培养出骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子能明显的促进骨髓间充质干细胞增殖.经软骨诱导分化后骨髓间充质干细胞呈软骨细胞形态,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达阳性.10 μg/L 的转化生长因子β1 诱导成软骨分化能力最强.     

密度梯度离心与贴壁法相结合体外分离培养兔骨髓基质干细胞：1～3代细胞生长特性

目的:采用密度梯度离心与贴壁培养相结合的方式,对兔骨髓基质干细胞进行体外分离、培养和扩增。方法:实验于2006-11/2007-08在广西医科大学完成。①实验方法:取6周龄大白兔8只,麻醉后切开皮肤充分暴露下肢骨,无菌条件下穿刺股骨干骺端,抽吸骨髓液约12mL,以等体积磷酸盐缓冲液稀释,注入含有等体积人淋巴细胞分离液的离心管中,离心收集中间云雾状细胞层,磷酸盐缓冲液洗涤,去除多余的脂肪细胞及组织液,加入适量的含双抗的10%胎牛血清DMEM培养液吹打制成细胞悬液,离心后弃上清,以1×108L-1密度接种于培养瓶中,37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养。48h后首次换液,弃去未贴壁或已死去的细胞,隔日换液。至8～12d贴壁细胞融合为单层时胰蛋白酶消化传代。②实验评估:用倒置相差显微镜观察每天细胞的生长情况。取第1～5代处于对数生长期的细胞,计算贴壁率,同时绘制细胞生长曲线。结果:①兔骨髓基质干细胞生长情况及形态学特点:原代培养8h骨髓基质干细胞开始贴壁生长,其他杂质细胞悬浮于培养基中;3d后贴壁细胞逐渐变为梭形并且增大,少数细胞呈现多角形,高倍镜下可见细胞质丰富,细胞较大,呈椭圆形,轮廓清晰,核内可见核仁存在;1周后大部分细胞贴壁延伸,体积变大,数目增多,多呈长梭形或三角形;第12天细胞呈集落生长。第1～3代兔骨髓基质干细胞体外培养生长稳定,增殖迅速,细胞形态基本相同。第4代细胞体积始增大,胞内有颗粒样物质出现。第5代细胞体积更大,细胞呈椭圆形改变,部分细胞开始脱落死亡,增殖能力较前4代明显下降。②细胞贴壁率:接种后12h第1～3代细胞贴壁率为95%,第4代细胞贴壁率为88%,至第5代细胞贴壁能力差,贴壁率仅为72%。③细胞生长曲线:第1～3代细胞生长曲线基本相同,第4,5代细胞长势均明显下降。结论:采用密度梯度离心与贴壁培养相结合的方式能够成功分离培养兔骨髓基质干细胞,第1～3代细胞体外培养生长稳定,贴壁率高,活性良好。     

自体激活富血小板血浆干预兔骨髓间充质干细胞体外成软骨分化的研究

背景:自体富血小板血浆激活后可释放多种生长因子,可以促进骨髓间充质干细胞的增殖与分化。目的:观察自体激活富血小板血浆对体外培养的兔骨髓间充质干细胞向成软骨细胞分化的影响。方法:取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞;取第3代骨髓间充质干细胞,分别应用体积分数10%自体激活富血小板血浆和体积分数10%胎牛血清培养液进行体外培养,观察其向成软骨细胞分化情况。结果与结论:分离培养的兔骨髓间充质干细胞呈长梭形,传代后细胞生长迅速。流式细胞仪检测发现第3代细胞高表达CD29、CD44,而低表达CD45。免疫荧光细胞化学染色显示经自体激活富血小板血浆诱导的骨髓间充质干细胞表达Ⅱ型胶原;实时荧光定量PCR检测发现经自体激活富血小板血浆诱导的骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原α1链基因和聚集蛋白聚糖基因表达明显高于经胎牛血清诱导的骨髓间充质干细胞(P<0.01)。可见自体激活富血小板血浆具有促进兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向分化的潜能。     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定

目的探讨兔骨髓间充质干细胞分离、培养和鉴定的方法。方法全骨髓贴壁法提取兔骨髓中的间充质干细胞,流式细胞术检测细胞表面分子CD14、CD29、CD34、CD44、CD45和CD90等标志的表达以及不同代次兔BM-SCsDNA含量。通过定向分化检测兔BMSCs的多向分化潜能。结果兔骨髓间充质干细胞呈形态较为均一的小梭形、克隆样生长。流式细胞术检测结果显示,传代至第12代和20代的兔骨髓间充质干细胞检测对数生长期细胞的DNA含量结果显示细胞为正常二倍体细胞,无明显变异。细胞表面表达CD29（61.71%）、CD44（60.2%）,不表达CD14（0.4%）、CD34（0.34%）、CD45（0.64%）和CD90（0.04%）。兔BMSCs的定向分化结果显示其可向成骨细胞、脂肪细胞及成软骨细胞分化。结论成功获得具有多向分化潜能的兔骨髓间充质干细胞,其具有特定的细胞表面抗原,具有容易获取、增殖能力强等特点,是优良的组织工程种子细胞。