TiO2纳米光催化剂薄膜对人工品状体表面修饰作用及其意义

目的 研究经光激发后纳米TiO2光催化剂薄膜对体外培养的牛晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LEC)的杀伤效应.方法 采用溶胶-凝胶法在玻片表面制备TiO2光催化剂薄膜.体外培养牛LEC爬片生长于此薄膜上.设未经纳米TiO2光催化剂薄膜修饰的玻片为对照.UVA分组激发玻片0～50 min后,观察细胞形态,MTT比色法测定各组细胞存活率并比较.用HE染色、AO-EB染色观察牛LEC死亡现象.结果 经UVA激发的纳米TiO2光催化剂薄膜对牛LEC有明显杀伤作用,光镜下见实验组激发20 min以上细胞表面有大量泡状突起,大部分细胞收缩变圆;对照组细胞未见明显改变.实验组与对照组细胞存活率有统计学意义,且随激发时间延长,TiO2薄膜对牛LEC的杀伤效应更加显著.HE染色可见实验组激发20 min以上.细胞收缩变圆,细胞间隙增大,核固缩明显,未见核仁,部分胞膜破裂,细胞崩解为碎片;对照组细胞形态大致正常.AO-EB染色发现受激发40 min,实验组大量牛LEC坏死.结论 受激发的纳米TiO2光催化剂薄膜对牛LEC有明显杀伤作用.推断细胞死亡机制可能是TiO2受激发后产生超氧自由基等活性氧物质,在细胞膜表面产生氧化还原反应所致.     

TiO2纳米光催化剂薄膜对牛晶状体上皮细胞黏附及移行的影响

目的观察经光激发后TiO2纳米光催化剂薄膜对体外培养的牛晶状体上皮细胞（LECs）黏附及移行的影响。方法采用溶胶-凝胶法在载玻片表面制备TiO2光催化剂薄膜,对载玻片行接触角测量。体外培养牛LECs爬片生长于此薄膜上。未经TiO2纳米光催化剂薄膜修饰的载玻片设为对照。进行细胞黏附和迁移实验,测定并比较牛LECs在TiO2薄膜修饰载玻片与对照载玻片表面的生长、移行情况。结果对TiO2薄膜组和对照组载玻片行接触角测量：对照组载玻片接触角为18.825°±2.342°,TiO2镀膜组载玻片接触角为0°±2°,TiO2镀膜组载玻片的接触角明显小于对照组。通过细胞黏附实验,TiO2镀膜组载玻片表面细胞黏附数平均为36.60±11.20,对照组细胞黏附数平均为96.40±19.67,差异有统计学意义（P=0.000）。细胞迁移实验（划痕法）中,对照组细胞移行距离平均为0.951mm,TiO2镀膜组细胞平均移行距离为0.640mm,差异有统计学意义（P=0.000）。结论TiO2纳米光催化剂薄膜具有超亲水性,能够明显抑制牛LECs在其表面的黏附和移行。     

MTT法探讨三氧化二砷及莪术对晶状体上皮细胞增殖的抑制作用

目的探讨两种天然药物三氧化二砷(ATO)和莪术(RC)对晶状体上皮细胞(LEC)增殖的抑制作用,为寻求防治后发性白内障的确切有效药物提供实验依据。设计实验性研究。研究对象体外培养的牛LEC。方法倒置显微镜下观察细胞形态学变化。MTT比色法检测不同终浓度(2．5、5、10μmol/L)ATO和(5、10、20mg/ml)RC作用于增殖状态下LEC 72小时后对细胞增殖的抑制程度。主要指标细胞形态、吸光度(A)值。结果倒置显微镜下可见增殖对照组细胞大小均匀,生长密集,ATO和RC组细胞生长及形态有明显改变,增殖缓慢,生长差,贴壁能力减弱。MTT比色法结果显示:不同浓度(2．5、5、 10μmol／L)的ATO和(5、10、20mg／ml)RC可明显抑制LEC增殖,并具有剂量依赖关系(P均<0．01)。结论两种天然药物 ATO、RC能够明显抑制LEC增殖,有望成为防治后发性白内障的有效药物。     

柔毛霉素对兔晶体上皮细胞体外生长抑制的实验研究

目的研究柔毛霉素（daunomycin）对兔晶体上皮细胞体外生长抑制．探索使用柔毛霉素以预防后发障的发生。方法分离培养家兔晶体上皮细胞，传代后在24孔培养板培养72小时，计数后加入不同浓度的柔毛霉素作用10分钟后．吸出药物并冲洗后培养5天。结果柔毛霉素的LD50为0．52μg／ml～0．77μg／ml．经高浓度药物（10μp／ml）作用后的标本几乎无细胞存活，经0．5μg／ml药物浓度作用后的细胞形态发生变化。结论显示出低浓度柔毛霉素短时间作用后即能有效抑制晶体上皮细胞的增生，尤其便于术中一次性灌注用药，在降低后发障的发生具有较好的作用。     

TiO2纳米薄膜影响晶状体上皮细胞和巨噬细胞生长的体外研究

目的:观察经长波紫外线UVA(365nm)激发处理,TiO2纳米薄膜对体外培养的牛晶状体上皮细胞和小鼠腹腔巨噬细胞的抑制效应,研究该薄膜影响表面细胞生长的特性。方法:在玻片上涂覆TiO2纳米薄膜,并以未镀膜玻片为对照。将两种玻片在不同强度(0.102和0.825mW/cm2)的UVA下,照射0,10,20,30,40min,观察玻片表面的晶状体上皮细胞和巨噬细胞生长的数量和状态。实验用MTT比色法评估晶状体上皮细胞量,并以AO-EB染色法观察其形态;用瑞氏染色后计数法测定巨噬细胞量,并以扫描电镜观察其形态。结果:镀TiO2纳米薄膜玻片在0.102mW/cm2的UVA激发40min或0.825mW/cm2的UVA激发30min时,表面存活的细胞量比未镀膜玻片显著减少(P<0.01),且晶状体上皮细胞出现AO-EB染色的凋亡和坏死特征,巨噬细胞出现质膜破裂、细胞崩解的扫描电镜表现。激发时间越长,TiO2纳米薄膜上的细胞量越少,且0.825mW/cm2的光源较0.102mW/cm2的光源更能激发TiO2的杀伤作用。结论:TiO2纳米薄膜在UVA的激发照射后,能使其表面的晶状体上皮细胞和巨噬细胞发生凋亡或坏死。与照射时间呈时效关系。     

TGF-β2对体外培养牛晶状体上皮细胞CTGF蛋白及mRNA表达的影响

目的:观察转化生长因子-β2(transforming growth factor-β2,TGF-β2)对体外培养牛眼晶状体上皮细胞(lens epithelial cell,LEC)结缔组织生长因子(connective tissue growth fac-tor,CTGF)mRNA和蛋白表达的影响。方法:将体外培养2~3代牛LEC分为对照组和实验组,实验组分别经1,5,10μg/LTGF-β2处理24h后,采用半定量RT-PCR和Westernblot技术检测CTGF mRNA以及蛋白表达的变化。结果:与对照组相比,1μg/LTGF-β2组对牛LECCTGF/β-actin吸光度比值和CTGF/β-actin灰度比值的表达无明显影响(P>0.05),5,10μg/LTGF-β2组可以明显上调RT-PCR和Western blot中CTGF/β-actin比值(P<0.01)。结论:TGF-β2可促进体外培养牛LEC表达CTGF蛋白及mRNA。     

彗星法分析紫外线诱导的人晶状体上皮细胞DNA的损伤及抗氧化剂对DNA损伤的拮抗作用

目的探讨紫外线诱导的人晶状体上皮细胞（LEC）DNA损伤修复机制及抗氧化剂对DNA损伤的拮抗作用。方法采用照射剂量为0．0（对照组）及2．5、5．0、7．5、10．0mJ／cm^2（实验1～4组）的紫外线照射培养的人LEC,碱性彗星法（CA）分析人LEC DNA单链断裂（SSB）的程度和接受10．0mJ／cm^2紫外线照射后的自身修复情况,以及人LEC在10．0mJ／cm^2紫外线照射前后不同浓度抗氧化剂维生素C（VitC）、牛磺酸、超氧化物歧化酶（SOD）和表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对DNA损伤程度的影响。结果对照组与4个实验组DNA SSB程度呈上升趋势,5个组比较,差异有统计学意义（F=17．259,P〈0．01）;10．0mJ／cm^2紫外线诱导的人LEC的DNASSB后,其半修复时间为60min;紫外线照射前,加入抗氧化剂牛磺酸、SOD、EGCG,实验组和对照组比较差异有统计学意义（F值分别为6.591、13.542、4．626,P〈0．01）,VitC对照组和实验组比较差异无统计学意义（F=1．451,P〉0．05）;紫外线照射后,加入抗氧化剂VitC、牛磺酸、SOD、EGCG,实验组和对照组比较差异有统计学意义（F值分别为6．571、4．810、6．824、9．182,P〈0．01）;紫外线照射前加入4种抗氧化剂,其组间效应的差异有统计学意义（F=8．870,P〈0．01）,紫外线照射后加入4种抗氧化剂,其组间效应的差异无统计学意义（F=0．101,P〉0．05）。结论人LEC DNA的损伤程度与紫外线剂量呈线性关系;外源性VitC、牛磺酸、SOD、EGCG对紫外线照射诱导的人LEC DNA的损伤均有拈抗作用。紫外线照射前加入抗氧化剂的效应由强至弱依次为SOD、EGCG、牛磺酸、VitC,紫外线照射后加入4种抗氧化剂的效应差异无统计学意义。SOD和EGCG是高效抗氧化剂。     

外源性肿瘤坏死因子α对碱烧伤诱导角膜新生血管的影响及机制

目的探讨外源性肿瘤坏死因子α（TNF—α）局部干预对碱烧伤诱导角膜新生血管（CNV）形成的影响及内在机制。方法BALB／c小鼠45只,利用碱烧伤法制作左眼CNV模型。根据实验设计．分3组实验进行研究。①CNV模型小鼠15只,随机分为3组,每组5只。自伤后分别给予100、500μg／ml TNF—α（实验组）或0-2％透明质酸钠（HA,对照组）点眼1周。于碱烧伤后第14天处死小鼠取眼球,免疫组织化学法检测各组角膜组织中CD31的表达,计数微血管密度（MVD）,分析TNF-α对碱烧伤CNV形成的作用。②CNV模型小鼠20只．随机分为2组,每组10只。实验组给予100μg／mlTNF一仅点眼,对照组给予0．2％HA点眼。分别于伤后第2天和第4天随机取5只小鼠处死取角膜．RT—PCR法检测角膜组织中血管内皮生长因子（VEGF）mRNA的表达情况,分析TNF—α对碱烧伤角膜中VEGF表达的影响。③利用二氯亚甲二磷酸脂质体（Cl2MDP—lip）射制作小鼠巨噬细胞特异剔除模型,10只BALB／c小鼠随机分为Cl2MDP—lip实验组及PBS—lip对照组,每组5只。所有小鼠自碱烧伤后均给予100μg／mlTNF-α滴眼1周于.伤后第14天拍照记录CNV形成情况,图像分析软件测算CNV长度及面积,分析巨噬细胞在TNF—α调控碱烧伤后CNV形成中的作用。结果①碱烧伤后第14天,100μg／mlTNF-α组CNV形成较对照组明显增多．而500μg／ml TNF-α组CNV形成与对照组差异不明显。整张切片和热点区域MVD值,100μg／ml TNF-α组为63．25±9．75和114．94±12．93,500μg／ml TNF-α组为39．53±10．41和108．04±23．55．0．2％HA对照组为30．99±7．08和73．81±13．80和100μg／mlTNF—α组与对照组比较,差异有统计学意义（P〈0．05）,而500μg／mlTNF-α组与对照组相比差异无统计学意义（19〉0．05）。②碱烧伤后第2天和第4天VEGFmRNA与β—actin的比值,100μg／mlTNF-α组为0．40±0．12和1,51±0．21,0．2％HA对照组为0,31±0．10和0．58±0．30。两组差异均有统计学意义（P〈0．05）。⑧碱烧伤后第14天,Cl2MDP—lip组CNV形成较对照组明显减少,Cl2MDP—lip组的CNV长度和面积分别为（0．84±0．10）mm和（6．64±1．19）mm^2,PBS—lip对照组为f1．37±0．24）mm和（12．25±1．33）mm^2,两组差异有统计学意义（P〈0．01）.结论外源性TNF-α可通过上调碱烧伤角膜组织中VEGF表达来促进CNV的形成,其促进碱烧伤CNV形成机制主要是通过巨噬细胞起作用．     

叶黄素对牛晶状体上皮细胞增殖及迁移的影响

目的观察叶黄素（lutein）对体外培养的牛晶状体上皮细胞（bovine lens epithelial ceHs，BLECs）增殖和移行的影响．为药物防治后发性白内障（after-cataract）提供新的选择。方法首先进行BLECs原代培养和传代培养。取第2～3代BLECs。分别采用MTT法、划线法．研究不同浓度及作用时间的叶黄素对体外培养的BLECs增殖及移行的影响。结果①与对照组相比．当浓度〉μmol／L时，叶黄素能够明显抑制BLECs的增殖．差异有显著性（P〈0．01）。相同作用时间不同浓度组之间抑制作用比较，随药物浓度的增加，抑制作用加强，各浓度组之间差异有显著性（P〈0．01）。而相同药物浓度组随着作用时间的延长，抑制作用加强，各时间点差异亦有显著性（P〈0．01）。②浓度为1μmol和2μmol／L的叶黄素能明显抑制BLECs的的移行，与对照组相比，差异有显著性（P〈0．01）。两组间愈合率比较，差异亦有显著性（P〈0．01）。结论①在浓度≥1μmol时，叶黄素能有效抑制BLECs的增殖。②浓度为1μmol／L和2μmol的叶黄素能抑制BLECs的移行，其强度呈一定时间依赖性。③叶黄素可能成为药物治疗后发性白内障的新选择。     

中药对兔晶状体上皮细胞凋亡的cAMP的抑制作用

目的 :观察中药复明眼液对凋亡的兔晶状体上皮细胞 (lensepithelialcells,LEC)的环磷酸腺苷 (cAMP)的影响及其作用机制。方法 :采用终浓度 2 5 0 μmol/LH2 O2 诱导体外培养的兔LEC凋亡。用放射免疫分析法检测不同浓度的复明眼液对凋亡的兔LEC的cAMP含量的影响。结果 :各实验组兔LEC的cAMP含量 ,模型组为 (89.2± 10 .2 )pmol/g ,空白组为 (6 0 .6± 10 .7)pmol/g ,两者比较差异有非常显著性 (P <0 .0 1) ,说明兔LEC凋亡时 ,cAMP浓度明显增高。中药治疗C组 [(81.3± 11.2 )pmol/g]与模型组比较差异没有显著性 (P>0 .0 5 ) ,说明终浓度为 10 0 μg/ml的复明眼液对兔LEC的cAMP含量没有明显作用。中药治疗D组 [(6 9.5± 11.8)pmol/g]与模型组比较差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ,说明终浓度为 2 0 0 μg/ml的复明眼液可以降低兔LEC的cAMP含量。中药治疗E组 [(5 2 .2± 7.6 )pmol/g]和F组 [(4 1.5± 8.1)pmol/g]分别与模型组比较 ,差异均有非常显著性 ,显示终浓度为40 0 μg/ml和 80 0 μg/ml的复明眼液 ,有显著减少兔LEC中cAMP含量的作用。上述各中药治疗组 ,随着复明眼液浓度的提高 ,对兔LEC的cAMP作用愈强 ,即呈一定的量效关系。结论 :终浓度 2 5 0 μmol/L的H2 O2 诱导体外培养的兔LEC凋亡时可伴有兔LEC内的     

去整合素Echistatin对糖尿病兔早期后发性白内障的抑制作用及眼内安全性

背景 后囊膜混浊（PCO）是影响白内障术后视力的主要原因,糖尿病患者白内障术后更容易发生PCO.研究证实,去整合素Echistatin（Ecs）能抑制体外晶状体上皮细胞（LECs）的增生,从而抑制PCO的形成,但其机制和安全剂量有待证实.目的 研究不同质量浓度Ecs对糖尿病兔早期PCO发生过程中LECs增生的抑制作用及Ecs在眼内应用的安全剂量.方法 用随机数字表法将15只新西兰大白兔分为5个组,用四氧嘧啶兔耳缘静脉注射法建立兔糖尿病模型,然后兔右眼行常规晶状体囊外摘出术,术后单纯糖尿病兔前房注入蒸馏水0.2 ml作为对照组,术后按照分组前房内分别注入5.0、7.5、10.0和15.0 μg/ml的Ecs0.2 ml.术后裂隙灯生物显微镜下观察眼前段炎症反应及PCO形成和分级情况.术后10d取出兔右眼,制备常规石蜡切片,采用免疫组织化学法检测PCO发生过程中LECs中增生细胞核抗原（PCNA）的表达以确定Ecs对PCO抑制的有效剂量;采用常规组织病理学方法检查角膜和视网膜结构的形态学改变,并采用TUNEL法检测角膜内皮细胞及视网膜内核层细胞的凋亡情况,以确定Ecs对眼内组织的安全剂量.结果 各组兔实验眼晶状体囊外摘出术后出现不同程度的角膜水肿及前房渗出,对照组和5.0 μg/ml Ecs组术后3～5 d炎症反应消失,≥7.5 μg/ml Ecs组术眼均于术后7d恢复正常.术后对照组和5.0 μg/ml Ecs组PCO均为1～2级,≥7.5 μg/ml Ecs组术眼PCO均为0级.对照组、5.0 μg/ml Ecs组、7.5 μg/ml Ecs组和10.0 μg/ml Ecs组LECs中PCNA阳性细胞表达值（A值）的总体比较差异有统计学意义（F=18.006,P=0.001）,与对照组比较,7.5和10.0 μg/ml Ecs组LECs中PCNA阳性细胞表达值明显下降,差异均有统计学意义（P=0.010、0.001）.各组兔眼角膜内皮细胞排列整齐,视网膜内界膜与各层组织结构完整.TUNEL法检测可见≤10.0 μg/ml Ecs各组与对照组间角膜内皮细胞及视网膜内核层?     

胰岛素样生长因子-1及其受体在晶状体上皮细胞迁移中的作用

背景 白内障囊外摘出术后发生的后囊膜混浊（PCO）与残留晶状体上皮细胞（LECs）的增生和迁徙有关,曾有研究认为,糖尿病患者后发性白内障的发生率高于正常人,而胰岛素样生长因子-1（IGF-1）是否可促进LECs的迁徙尚不清楚. 目的 探讨IGF-1/IGF-1受体（IGF-1R）系统对LECs迁移能力的影响,为临床上防治PCO提供理论依据. 方法 将人永生化LECs系（HLEC-B3）细胞在DMEM中进行常规传代培养,第2代细胞采用荧光免疫组织化学法（兔抗人α-晶状体蛋白抗体）鉴定细胞.分别在培养基中加入质量浓度为0、30、90 μg/L的IGF-1培养48 h.将0、30、90 μg/L IGF-1中培养的细胞分别进行Transwell迁移小室实验,计数任意5个视野中结晶紫染色细胞,评估各组细胞的迁移能力.将细胞分别在0、1.5、30、60、90 μg/LIGF-1中培养,采用Western bolt法检测IGF-1R,包括IGF-1Rα和IGF-1Rβ亚基在各组细胞中的表达变化.结果 HLEC-B3细胞贴壁后48 h达对数生长期,培养的第2代HLEC-B3细胞对α-晶状体蛋白呈阳性反应,细胞膜呈红色荧光.各组细胞在Transwell迁移小室培养12h后,0 μg/L IGF-1组仅可见0（0,1）个染色的迁移细胞,30 μg/L IGF-1组和90 μg/L IGF-1组分别可见10（10,11）个和29（27,31）个染色的迁移细胞,30 μg/LIGF-1组和90 μg/L IGF-1组的迁移细胞数明显多于0μg/L IGF-1组,差异均有统计学意义（均P=0.008）,90 μg/L IGF-1组明显多于30 μg/L IGF-1组,差异均有统计学意义（P=0.009）.Western blot法检测发现,5个培养组细胞中IGF-1 Rα和IGF-1Rβ的表达量（IGF-1R/β-actin）差异均有统计学意义（F=63.700、130.530,均P=0.000）,当IGF-1质量浓度＞30 μg/L时,随着IGF-1质量浓度的增加,IGF-1Rα和IGF-1Rβ的表达量均逐渐升高,差异均有统计学意义（P＜0.05）.结论 IGF-1能够上调HLEC-B3细胞膜上IGF-1R蛋白的表达,这种作用呈剂量依赖性;IGF-1能够增强体外培养的HLEC-B3细胞的迁移能力,提示PCO的发生可能与IGF-1/IGF-1R系统的激活有关.     

PI3K抑制剂LY294002对人晶状体上皮细胞中S期激酶相关蛋白2表达的影响

目的探讨PI3K抑制剂LY294002对体外培养的人晶状体上皮细胞（LECs）增生和细胞周期S期激酶相关蛋白2（Skp2）表达的影响。方法 MTT比色法检测25μmol/L的LY294002处理人LECs细胞株SRA01/04后12h和24h细胞的增生情况;流式细胞仪检测LY294002作用24h后细胞周期的分布情况;Westernblot和real-timePCR法分别测定LY294002处理24h后细胞中Skp2及其mRNA的表达情况。结果 25μmol/L的LY294002作用于SRA01/04细胞0～24h,SRA01/04细胞的增生受抑制,且作用24h时对SRA01/04细胞的抑制作用最明显。LY294002组中处于G1期和S期的细胞占总细胞数的百分率分别为（66.15±2.63）%和（27.34±6.58）%,对照组为（56.73±1.35）%和（37.32±5.54）%,LY294002组细胞Skp2及其mRNA的表达量明显减少。结论 PI3K抑制剂LY294002可抑制人LECs的增生,使部分细胞停滞于细胞周期的G1期,LY294002抑制人LECs的增生可能与Skp2的表达下调有关。     

LY294002对人晶状体上皮细胞蛋白激酶B活化的影响

背景蛋白激酶B（Akt）与许多细胞信号转导通路密切相关，从而参与多种细胞功能活动的调控，包括细胞的增生、迁移和代谢等，其中磷脂酰肌醇3-激酶（P13K）可催化Akt活性并启动各种相关的细胞信号通路。P13K抑制剂能够抑制Akt活性，但是否影响后发性白内障发生过程中残留的晶状体上皮细胞（LECs）的生物学行为尚不清楚。目的观察P13K抑制剂LY294002对人LECs中Akt活化的影响。方法对人LECs系HLEC-B3细胞进行常规培养和传代，然后接种于96孔板中，培养24h后在培养板中加入LY294002，终浓度分别为0、10、20、30、40、50、60、70、80μmol／L，继续培养24h后采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测各组细胞的增生抑制率。在同一批接种于6孔板内无菌盖玻片上的传代细胞中加入10μg／L转化生长因子-β2（TGF—β2）为诱导组，用20μmol／LLY294002预培养1h后再加入10Ixg／LTGF—β2进行共培养为TGF—B，与LY294005共培养组，以未加入TGF，p：和LY294002的细胞作为对照组，应用激光扫描共焦显微镜观察各组细胞中磷酸化Akt（p-Akt）的荧光表达情况，并用Westernblot法检测各组细胞中p-Akt表达量的差异。结果CCK-8法检测结果显示，随着LY294002浓度的增加，HLEC—B3的吸光度（A）值逐渐减小，即LY294002对HLEC—B3细胞增生的抑制作用随浓度的增加而逐渐增强，不同浓度LY294002组间HLEC—B3的A值比较差异有统计学意义（F分组=9．72，P=0．00）；随着检测时间点的延长，HLEC—B3的4值逐渐增大，不同检测时间点A值比较差异有统计学意义（F时间=1737．54，P=0．00）。激光扫描共焦显微镜观察显示，对照组细胞仅有微量的p-Akt红色荧光，诱导组p-Akt表达明显增多，并向细胞膜聚集，细胞轮廓清晰，而TGF—β2与LY294005共培养组细胞中p-Akt表达的红色荧光明显减弱，细胞形态不清。Westernblot法检测结果显示，对照组、诱导组和TGF—β2与LY294005共培养组细胞中p-Akt的表达量分别为0．91±0．08、1．48±0．13和0．95±0．19，3个组间差异有统计学意义（F=15．04，P=0．00）。结论LY294002能够拈抗TGF—β2诱导的Akt磷酸化激活过程，有望成为新的有效防治后发性白内障的药物。     

FGFR1特异性拮抗剂SU5402抑制人源晶状体上皮细胞增生的研究

目的本研究探讨体外应用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）受体1（FGFR1）特异性拮抗剂SU5402抑制人源晶状体上皮细胞（LECs）增生的影响。方法光镜下观察传代培养的永生化人源LEC-B3细胞的形态,用αB-晶状体蛋白免疫组织化学法鉴定其性质。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测LEC-B3细胞中bFGF和FGFR1的mRNA表达。在传代培养、融合度为70%的LEC-B3细胞中加入SU5402（20μg/mL）,以磷酸盐缓冲液（PBS）作为对照,2 d后用流式细胞术（FCM）检测LEC-B3细胞中细胞增生核抗原（PCNA）的表达。结果传代培养的LEC-B3细胞呈多边形上皮样生长,表达特异性的αB-晶状体蛋白;LEC-B3细胞中bFGF和FGFR1的mRNA表达量与内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）相当;LEC-B3细胞中PCNA阳性细胞的比例,SU5402实验组为（23.95±7.82）%,PBS对照组为（58.86±15.43）%,差异有统计学意义（P〈0.01）。结论LEC-B3细胞丰富表达bFGF和FGFR1的mRNA;体外应用SU5402可显著抑制LEC-B3增生,有望成为防治后囊膜混浊（PCO）的有效方法。     

MG132对人晶状体上皮细胞增生、移行和上皮-间充质转化的抑制作用

背景 晶状体后囊膜混浊（PCO）发生的主要病理机制是白内障术后后囊膜残留的晶状体上皮细胞（LECs）的增生、移行和分化,研究发现蛋白酶体抑制剂MG132可抑制牛LECs的增生,但对人LECs的生物学影响尚不明确. 目的 研究蛋白酶体抑制剂MG132对体外培养的人LECs增生、移行和上皮-间充质转化（EMT）的抑制作用.方法 收集白内障超声乳化摘出术中连续环形撕囊的囊膜片用组织块培养法进行原代培养并传代,取第2代或第3代LECs进行常规消化,调整细胞密度至5×105个/ml,以200 μl/孔接种至96孔板常规培养24 h,分别加入成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）、MG132或MG132＋FGF-2,以基础培养液培养的细胞作为对照组,培养24 h后用MTT法测定吸光度（A490）值,计算LECs的增生率.在移行能力测定中,应用传代的人LECs分别加入FGF-2、MG132或MG132＋FGF-2,以基础培养液培养的细胞作为对照组,用无菌棉棒在细胞层中划出细胞裸露区,继续培养24 h,计数移行至裸露区的细胞,评估细胞移行率.在传代的人LECs培养液中分别加入转化生长因子-β2（TGF-β2）、MG132或MG132＋TGF-β2,以基础培养液培养的细胞作为对照组,培养24 h后用免疫组织化学法检测细胞质中纤维连接蛋白（FN）的表达. 结果 对照组、FGF-2组、MG132组和MG132＋FGF-2组的LECs增生值（A490）分别为0.582±0.020、0.723 ±0.010、0.434±0.011和0.465±0.008,总体差异有统计学意义（F=110.482,P＜0.01）,FGF-2组LECs增生值明显高于对照组,MG132组和MG132＋FGF-2组的LECs增生值明显低于对照组,差异均有统计学意义（P＜0.05）.对照组、FGF-2组、MG132组和MG132＋FGF-2组LECs移行数目分别为8.67±1.08、11.58±1.59、2.67±0.09和2.75±0.09,差异有统计学意义（F=34.301,P＜0.01）,其中FGF-2组LECs的移行数明显多于对照组,而MG132组和MG132＋FGF-2组LECs移行数明显少于对照组,差异均有统计学意义（P＜0.05）.与对照组比较,MG132组LECs的增生率和移行率分别降低25.4％和75.0％,FGF-2组LECs增生率和移行率分别增加24.2％和33.6％,MG132＋FGF-2组LECs的增生率和移行率分别下降20.1％和68.3％.对照组、TGF-β2组、MG132组和MG132＋TGF-β2组LECs中FN表达量（A值）分别为1.242±0.023、2.329±0.113、1.043±0.021和1.163±0.018,差异有统计学意义（F=113.752,P＜0.01）,TGF-β2组LECs中FN表达量明显高于对照组,而MG132组和MG132＋TGF-β2组明显低于对照组,差异均有统计学意义（P＜0.05）.TGF-β2可以诱导人LECs转分化,FN表达增强;MG132与TGF-β2同时存在时可以减弱人LECs转分化,FN表达下降. 结论 MG132抑制体外培养的人LECs的增生与移行,并可阻止TGF-β2诱导的人LECs的EMT.     

LY294002对bFGF诱导的兔晶状体上皮细胞增生的影响

目的探讨LY294002对碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）诱导的兔晶状体上皮细胞（LECs）增生的影响。方法兔眼LECs经培养后,将10^-8、10^-7、10^-6、10^-5、10^-4mol／LLY294002分别加入LECs培养基中培养48h为LY294002组。另将10^-8、10^-7、10^-6、10^-5、10^-4mol／LLY294002＋bFGF（10mg／L）加入培养基中培养LECs48h。bFGF（10mg／L）诱导LECs增生48h为阳性对照组,空白对照组仅用无血清DMEM。MTT比色法测定吸光度（A）值,分析各组药物对LECs增生的抑制率,流式细胞仪检测各细胞周期的LECs百分率。结果bFGF组与空白对照组相比A值升高,LY294002组随着药物浓度的增加,4值明显降低,差异有统计学意义（P〈0．01）。bFGF＋LY294002组与LY294002组相比,A值下降更明显,差异有统计学意义（P〈0．01）。流式细胞仪分析LY294002对LECs的抑制作用与MTT呈现相同趋势,随着LY294002浓度的增加,处于G0／G1期的LECs逐渐增加（P〈0．01）,而S期和G2／M期逐渐减少。结论LY294002可明显抑制体外培养的bFGF诱导的兔LECs的增生,并呈剂量依赖关系,为临床筛选防治后发性白内障的药物提供依据。     

基质金属蛋白酶3在晶状体上皮细胞中的表达及其意义

背景 后发性白内障是现代白内障囊外摘出术后导致视力下降的常见并发症.基质金属蛋白酶(MMPs)是参与降解除多糖以外全部细胞外基质(ECM)的重要蛋白酶,探讨MMP-3对后发性白内障的基因治疗一直是研究热点,而纤连蛋白(FN)是MMP-3的主要降解底物,能间接反映MMP-3的表达情况.目的 构建pEGFP-N1-MMP-3真核重组质粒并转染晶状体上皮细胞(LECs),观察MMP-3在LECs中的表达,探讨后发性白内障基因治疗的可能性.方法 取6只新鲜猪晶状体,将囊膜用组织块法进行原代培养,获得LECs.用E.coli DH5α MMP-3和E.coli DH5α pEGFP-N1质粒构建MMP-3的真核表达重组质粒pEGFP-N1-MMP-3,通过双酶切,DNA测序分析鉴定人MMP-3片段的准确性.将构建的pEGFP-N1-MMP-3转染至猪LECs中,通过绿色荧光蛋白(GFP)间接观察MMP-3在猪LECs中的表达,用Western blot法检测pEGFP-N1-MMP-3真核重组质粒转染后LECs表达产物FN的相对表达量,间接评估MMP-3的表达量. 结果 双酶切鉴定结果符合质粒pEGFP-N1及目的片段MMP-3大小.软件分析测序结果表明,重组质粒pEGFP-N1-MMP-3中的MMP-3基因与GenBank中的人MMP基因序列相似性达99.6％,表示目的片段已正确插入pEGFP-N1载体.原代培养猪LECs,将重组质粒pEGFP-N1-MMP-3转染入猪LECs,荧光显微镜下可见明显的GFP绿色荧光.Western blot检测表明,FN在pEGFP-N1 -MMP-3真核重组质粒转染组的表达量为0.666±0.008,空质粒转染组FN的表达量为0.326±0.071,差异有统计学意义(P=0.000). 结论 成功构建了pEGFP-N1-MMP-3质粒,并能够在猪LECs中表达,为进一步研究该蛋白在LECs中的表达与功能奠定了基础.     

多聚赖氨酸-乙二胺四乙酸交联物抑制兔晶状体上皮细胞生长的研究

背景后囊膜混浊（PCO）是现代白内障囊外摘出术后引起视力下降的主要原因。研究证实多聚赖氨酸-乙二胺四乙酸（EDTA）交联物（PLE）能够降低兔PCO的发生率。目的研究PLE对体外培养的兔晶状体上皮细胞（LECs）生长的抑制作用及有效药物浓度。方法取3月龄新西兰白兔晶状体前囊膜进行体外植块培养获得兔LECs并进行传代,取第2～3代传代培养的LECs消化后按1×10^5个／ml密度接种于96孔培养板中。在培养皿中加入12．5、25．0、50．0、100．0μmol／L的PLE,培养皿中加入DMSO培养液作为对照组。PLE作用48h用MTT比色法测定PLE对兔LECs增生的抑制作用并计算各浓度PLE组的吸光度（A490）值及其抑制率。结果≤25．0μmol／LPLE组可见细胞生长及形态改变不明显。≥50．0μmol／LPLE各组可见细胞生长及形态有明显改变,增生缓慢,生长差,数量减少,贴壁能力减弱。12．5、25．0、50．0、100．0μmol／L的PLE组LECs的A490值分别为0．278±0．013、0．266±0．028、0．260±O．022和0．247±0．012,均明显低于DMSO对照组的O．311±0．038（P=0．035、0．011、0．009、0．013）,且呈明显的剂量一效应依赖关系。12．5、25．0、50．0、100．0μmol／LPLE组对兔LECs的抑制率分别为10．61％、14．47％、16．40％和20．58％。结论PLE可以浓度依赖的方式抑制兔LECs的生长,可为临床筛选出防治PCO的药物提供依据。