重组嵌合毒素Dsg3EC1-2PE40对寻常型天疱疮患者T、B淋巴细胞的影响

目的 探讨重组嵌合毒素Dsg3EC_1-2PE40对寻常型天疱疮患者外周血淋巴细胞的影响。方法 对重组嵌合毒素Dsg3EC_1-2PE40进行表达,并分离纯化;分别以不同浓度重组嵌合毒素作用于寻常型天疱疮患者外周血淋巴细胞,通过ELISPOT法、MTT比色试验及³H-TdR掺入试验来观察重组嵌合毒素对T、B淋巴细胞的影响。结果 纯化后的重组嵌合毒素纯度达80%以上,它能够特异性与天疱疮抗体IgG结合,而与正常人IgG不结合。重组嵌合毒素可使寻常型天疱疮外周血产生抗体的B细胞数量减少约40%左右;在重组嵌合毒素作用下,T细胞的增殖、代谢较重组Dsg3EC_1-2明显降低,两者间差异有统计学意义(P<0.01)。结论 重组嵌合毒素Dsg3EC_1-2PE40可以抑制寻常型天疱疮外周血B细胞的抗体产生作用,对寻常型天疱疮外周血T细胞具有明显的抑制或杀伤作用。     

重组Dsg3EC1-2及其嵌合毒素蛋白的原核表达及纯化

目的：在大肠杆菌中高效表达并纯化重组天疱疮抗原桥粒芯糖蛋白3(Dsg3)的胞外结构域EC1-2片段及其与假单胞菌外毒素PE40的嵌合毒素Dsg3EC1-2PE40。方法：在大肠杆菌中对目的蛋白进行诱导表达，并用金属鏊合亲和层析法进行分离纯化，经Western Blot试验鉴定。结果：所得重组蛋白可以和寻常型天疱疮抗体IgG发生特异性结合，而与正常人IgG不发生反应，其纯化后纯度分别达85％及80%。结论：Dsg3EC1-2片段及其嵌合毒素Dsg3EC1-2PE40在原核细胞中得到成功表达，为天疱疮的治疗研究奠定了基础。     

寻常型天疱疮患者血清对HaCaT细胞Dsg、MMP-9表达的影响

 目的:探讨寻常型天疱疮（PV）患者血清对HaCaT细胞桥粒芯蛋白（Dsg）1、3和基质金属蛋白酶（MMP）9表达的影响及其参与PV棘层松解的可能机制。方法:用含5%PV血清的高糖DMEM培养基孵育HaCaT细胞,以正常培养组、健康血清组以及抗Dsg3抗体组（阳性对照组）作为对照。刮取细胞提取总RNA及蛋白质,Q PCR检测Dsg1、Dsg3和MMP 9 mRNA转录水平,Western Blot检测Dsg1、Dsg3和MMP 9表达,荧光单克隆Dsg1/3抗体分别检测细胞表面Dsg1、Dsg3表达。 结果:Q PCR结果显示：与正常培养组比较,含5% PV血清培养组HaCaT细胞Dsg1、Dsg3、MMP 9基因的mRNA相对表达量分别上升约432%、402%、402%,而抗Dsg3抗体组分别上升约495%、488%、604%,PV血清组与正常培养组间有明显差异（P值均<0.05）。 Western Blot结果显示：与正常培养组相比,PV血清组HaCaT细胞表面Dsg1、Dsg3、MMP 9蛋白表达升高。Dsg1、Dsg3荧光单克隆抗体检测显示：PV血清组HaCaT表面Dsg1线状荧光消失,替代为颗粒状、团块状荧光颗粒分散于细胞表面和胞浆区域,而细胞表面Dsg3线状荧光仍然存在,但强度减弱。 结论:PV血清能促进Dsg1、Dsg3和MMP 9转录及表达,Dsg3抗体可通过诱导角质形成细胞Dsg1蛋白内吞,削弱抗体补偿作用参与棘层松解。     

抗Dsg—3 EC3—4的单链抗体片段在寻常型天疱疮鼠模型中的作用

目的 探讨抗桥粒芯糖蛋白3(Dsg-3)EC3-4的单链抗体片段(ScFv)在寻常型天疱疮(PV)鼠模型中的作用。方法 在不同时间点。将抗Dsg-3 EC3-4的ScFv通过皮下注射至BALB/c新生鼠,从临床表现、组织病理和免疫荧光三方面评价其对PV鼠模型构建的影响。结果 单独注射抗Dsg-3 EC3-4的ScFv不能在BALB/c新生鼠中诱导出PV的改变,任何时间点注射抗Dsg-3 EC3-4的ScFv都不能阻断PV患者血清对BALB/c新生鼠的致病作用。结论 单独注射抗Dsg-3 EC3-4的ScFv缺乏致病性,也不能阻断PV患者血清对BALB/c新生鼠的致病作用。     

噬菌体展示技术构建寻常型天疱疮患者桥粒芯糖蛋白3抗体文库

目的：用噬菌体展示技术构建寻常型天疱疮患者桥粒芯糖蛋白3抗体文库。方法：收集寻常型天疱疮患者外周血,分离淋巴细胞抽提RNA,采和RT－PCR反应以人的抗体特异性HuVHBACK、HuJHFOR和HuVkBACK、HuJkFOR引物扩增抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因片段,并将其与接头拼接成ScFv片段克隆于大肠杆菌。结果：抗体基因ScFv片段与噬菌体基因III的产物以融合蛋白的形式在噬菌体表面表达,构建了天疱疮患者的重组噬菌体抗体库,ELISA检测证明ScFv基因产物具有抗体活性。结论：天疱疮噬菌体抗体库的构建为天疱疮发病机理、诊断和治疗研究打下了基础。     

寻常型天疱疮发病机制的进展

寻常型天疱疮是一累及皮肤和黏膜的自身免疫性大疱性皮肤病,在各型天疱疮中最常见.国内外一直在进行其发病机制的研究,目前尚不完全清楚,其中.最有影响的是桥粒芯糖蛋白的补偿学说.随着免疫学、分子生物学的不断发展,提出更多的发病机制,包括抗体介导的细胞凋亡学说、基底细胞塌陷皱缩假说等.这将有利于进一步发现治疗寻常型天疱疮乃至其他自身免疫病的新靶点,指导临床治疗.     

寻常型天疱疮患者及一级亲属抗体IgG亚型检测

目的观察寻常型天疱疮(pemphigus vulgaris,PV)患者和一级亲属血清中PV自身抗体(PV-IgG)亚型及其与桥粒芯糖蛋白(desmoglein,Dsg)反应性,探讨PV-IgG检测的临床意义和PV的发病机制。方法用间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence,IIF)检测27例PV患者、40例一级亲属和20例正常对照者血清PV-IgG,并用免疫印迹法(Westernblot,WB)检测PV-IgG亚型及其与Dsg1、Dsg3反应性。结果PV患者的PV-IgG阳性率和平均抗体滴度明显高于其一级亲属者(P0.001),活动期患者的PV-IgG阳性率和平均抗体滴度也明显高于缓解期(P0.01);PV患者中PV-IgG阳性率(92.9%)明显高于一级亲属(17.5%)和正常对照组(0%)(P0.0001,0.001),PV患者中Dsg3反应性IgG4水平明显高于一级亲属(P0.01),且其在活动期病例中水平也明显高于缓解期(P0.05)。结论本病的发生与PV-IgG水平有关;Dsg3是PV的主要自身抗原;IgG4是PV的主要致病抗体。     

天疱疮患者皮损局部B淋巴细胞及其产生特异性抗体的功能研究

目的 检测寻常型天疱疮患者皮损局部B淋巴细胞及其产生特异性抗体的功能。方法 寻常型天疱疮患者35例,健康对照22例。取健康对照皮肤和寻常型天疱疮患者初发水疱或糜烂皮损组织,分离获得单个核细胞。流式细胞仪检测患者皮损局部淋巴细胞、CD19+ B细胞比例,以及特异性识别桥粒芯糖蛋白1（Dsg1）和Dsg3的CD19+ B淋巴细胞比例。体外培养寻常型天疱疮患者皮损局部淋巴细胞,ELISA法检测培养上清液中抗Dsg1和Dsg3抗体滴度,采用受试者工作特征曲线（ROC）分析阳性率。结果 寻常型天疱疮患者皮损局部淋巴细胞、CD19+ B细胞比例分别为17.95% ± 3.85%、4.27% ± 1.13%,高于健康对照组（7.83% ± 1.29%、0.61% ± 0.31%）,差异有统计学意义（t = 2.49,U = 13.00,均P < 0.05）。天疱疮患者皮损局部CD19+ B淋巴细胞中,表达IgG的细胞比例为（38.33 ± 5.56）%,表面识别Dsg1与Dsg3的细胞比例分别为12.87% ± 1.267%、10.42% ± 1.243%。局部淋巴细胞体外培养6 d后,培养上清液中抗Dsg1与Dsg3抗体滴度分别为（4.89 ± 1.56） U/ml、（35.45 ± 13.03） U/ml,阳性率分别为85%（17/20）和95%（19/20）。 结论 寻常型天疱疮患者皮损局部有可与Dsg1及Dsg3特异性结合的B淋巴细胞聚集,体外培养后可产生特异性抗Dsg1与抗Dsg3自身抗体。     

不同免疫佐剂对寻常型天疱疮抗原EC1-2表位抗体亚型的影响

目的 探讨免疫佐剂的十预对寻常型天疱疮抗原ECl-2表位抗体亚型转换的影响。方法 完全弗氏佐剂(CFA)或铝[Al(OH)₃]佐剂联合重组天疱疮抗原(PVA)ECl-2融合蛋白,分别免疫C57BL/6小鼠,检测免疫后细胞因子的产生及其特异性抗体的滴度和型别,并通过间接免疫荧光(IIF)及新生鼠皮肤的体外培养,观察抗血清同抗原的亲和力及其致病作用。结果 免疫后经细胞因子检测发现,CFA组小鼠IFN-γ、Th1型细胞因子增高;Al(OH)₃组则以IL-4、Th2型细胞因子增高为主。两组小鼠均有特异性的抗ECl-2 IgG型抗体产生,但其亚型不同,CFA组以IgG2a为主,而Al(OH)₃组则仅表达IgGl。CFA组小鼠血清IIF示弱的荧光沉积,体外实验示轻度棘层松解;而Al(OH)₃组则表现为明亮的荧光沉积,体外实验出现表皮内水疱。结论 不同免疫佐剂直接影响寻常型天疱疮抗原ECl-2表位的抗体亚型。     

天疱疮患者皮损中CD4+定居记忆T细胞的浸润及其临床相关性分析

【摘要】 目的 探讨天疱疮皮损局部CD4+定居记忆T（TRM）细胞的浸润及其临床相关性。方法 2017年9月至2018年12月在上海交通大学医学院附属瑞金医院皮肤科收集天疱疮患者20例,健康对照15例。采用流式细胞仪检测天疱疮患者皮损和健康对照皮肤CD4+ TRM细胞的表达。比较天疱疮患者不同部位皮损处CD4+ TRM细胞的浸润情况,分析CD4+ TRM细胞比例与病情控制所需时间的关系。符合正态分布的资料采用t检验,不符合正态分布者采用非参数检验;采用Pearson相关系数分析CD4+ TRM细胞比例和天疱疮疾病面积指数（PDAI）评分、循环中抗桥粒芯糖蛋白（Dsg）抗体滴度的相关性。结果 20例天疱疮患者中16例为寻常型天疱疮,4例为落叶型天疱疮。所有患者均有皮肤累及,14例皮损组织取材于躯干部位,6例取材于四肢部位。健康对照组年龄、性别和取材部位与天疱疮组差异无统计学意义（均P > 0.05）。天疱疮患者皮损局部CD3+ T细胞（72.75% ± 8.22%）显著高于健康对照组（31.33% ± 8.72%,t = 14.24,P < 0.001）,CD4+ TRM细胞比例（44.05% ± 14.27%）亦显著高于健康对照组（12.60% ± 5.12%,t = 9.10,P < 0.001）。天疱疮患者躯干部CD4+ TRM细胞比例（49.57% ± 12.32%）显著高于四肢（31.17% ± 9.75%,t = 3.23,P < 0.05）。皮损局部CD4+ TRM细胞比例与PDAI呈正相关（r2 = 0.246,P = 0.026）;而与血清中循环抗Dsg1（r2 = 0.137,P > 0.05）和抗Dsg3（r2 = 0.162,P > 0.05）抗体滴度无显著相关性。系统糖皮质激素治疗过程中4周内不能控制的患者皮损处CD4+ TRM细胞比例显著高于4周内可以控制的患者（t = 3.22,P < 0.05）。结论 天疱疮患者皮损局部CD4+ TRM细胞比例显著增高,可能与病情严重程度和疾病治疗反应相关。     

寻常型天疱疮抗原EC1-2表位的致病性

目的：通过寻常型天疱疮新生鼠模型的建立研究寻常型天疱疮抗原（PVA）致病性表位及其相应抗体的致病作用。方法：构建重组PVA细胞外区（EC）1－2片段分子，经亲和层析纯化后，免疫家兔，得到兔抗PVA EC1－2融合蛋白的抗血清，将提纯IgG抗体成分，被动转移到BALB／c新生鼠，15－18h后对新生鼠皮肤，血清进行组织病理，电镜和免疫荧光检查。结果：在对实验组新生鼠的评价中，其组织病理示表皮内水疱形成，棘细胞间棘突消失，棘 层松解；电镜示棘细胞间距离增宽，桥粒分离，溶解，消失，DIF和IIF均示棘细胞间免疫荧光沉积，面对照组小鼠除了IIF示棘细胞间微弱的荧光沉积外，其余检查均正常。结论：通过寻常型天疱疮新生鼠模型的建立，证明PVA分子中EC1－2表位为致病性表位，其相应的抗体为致病性抗体，另外，PVA重组分子的构建，新生鼠模型的建立为天疱疮以及其它自身免疫性疾病的诊断和治疗提供了一个模型 。     

纯化与未纯化重组PVA表位EC1-2在检测抗PVA抗体中的比较

目的 比较纯化与未纯化重组寻常型天疱疮抗原（Pemphigus vulgaris antigen,PVA)的细胞外区（extracel-lular domian,EC)1-2表位（ECl-2）在检测抗PVA抗体中的差异，以提高检测抗PVA抗体的敏感性。方法 在构建ECl-2重组质粒的基础上进行融合蛋白的表达，并依据亲和层析的原理进行该融合蛋白的纯化。采用免疫印迹方法分别将纯化前后的ECl-2融合蛋白应用于寻常型天疱疮（PV）患者的血清学检测。结果 22例被测PV患者血清中，用纯化前ECl-2融合蛋白进行检测的阳性率为54.5%，用纯化后的融合蛋白进行检测的阳性率为77.3%。结论 以纯化后的ECl-2融合蛋白为抗原底物，其抗PVA抗体的检出率显著高于纯化前，为临床特异性诊断PV提供了新方法。     

寻常型进展期白癜风患者外周血T淋巴细胞FasL和TNF-α的表达

目的检测寻常型进展期白癜风患者外周血T淋巴细胞FasL和TNFα的表达。方法随机采集30例寻常型进展期白癜风患者外周血3ml,分离T淋巴细胞后进行细胞涂片,使用免疫组化和原位杂交方法检测FasL和TNFα的蛋白和mRNA水平。并以30例静止期患者(对照组1)和20例健康志愿者(对照组2)作对照。结果与两个对照组相比,实验组FasL和TNFα的表达明显增加(P<0.001)。同时,与对照组2相比,对照组1FasL和TNFα的表达显著升高(P<0.001)。结论寻常型进展期白癜风患者外周血T淋巴细胞FasL和TNFα的表达显著升高。     

窄谱中波紫外线对寻常性银屑病Th1/Th2平衡偏移的影响

目的研究窄谱中波紫外线(NB-UVB)治疗寻常性银屑病的临床疗效以及对患者Th1/Th2的影响,探讨NB-UVB治疗寻常性银屑病的机制。方法 55例寻常性银屑病患者采用NB-UVB光疗。采用流式细胞技术分别于光疗前、光疗20次后检测患者外周血中CD4~+CCR5~+和CD4~+CD30~+细胞的表达;同时检测50例健康人作为对照组。结果治疗前银屑病组CCR5~+细胞的百分比均高于对照组(P0.05);CD30~+细胞的百分比较对照组明显降低(P0.05)。患者光疗后得到明显改善(P0.01)。结论 NB-UVB可有效调节银屑病患者Th1/Th2表达失衡,这可能是NB-UVB治疗银屑病免疫学机制之一。     

Interferon-gamma differentially regulates CD80 (B7-1) and CD86 (B7-2/B70) expression on human Langerhans cells

CD80 (B7-1) and CD86 (B7-2/B70) have recently been identified in cultured human Langerhans cells (LCs), although their role and regulatory properties remain unclear. We present our comparison of the expression of the molecules, mRNAs and the function between CD80 and CD86 in human LCs treated by interferon γ (IFN_-γ). We examined the regulatory properties of CD80 and CD86 expression in human LCs pretreated with IFN_-γ. Flow cytometric analysis indicated that the mean fluorescence intensity of CD86 but not CD80 was enhanced. However, the percentage modulation of both CD80 and CD86 positive cells were significantly up-regulated in a dose-dependent manner, after 48-h culturing with IFN_-γ. The regulatory properties of CD80 and CD86 mRNA expressions in human LC were studied using polymerase chain reaction methods. We found that both CD80 and CD86 mRNA of enriched LCs following IFN_-γ pretreatment for 12 h were higher than those without pretreatment. We have demonstrated that the primary allogeneic mixed epidermal cell-lymphocyte reaction induced by human LCs treated by IFN_-γ increased in a dose-dependent manner. There was a 61.5% inhibition by anti-CD86 monoclonal antibody and a 32.5% inhibition by anti-CD80 monoclonal antibody. These data indicate that the CD80 and CD86 expression of human LCs may be differently regulated by IFN_-γ.     

Differential effects of cytokines and immunosuppressive drugs on CD40, B7-1, and B7-2 expression on purified epidermal Langerhans cells1

Langerhans cells are MHC class II antigen-positive antigen-presenting cells in the epidermis. Recent studies have revealed that Langerhans cells express costimulatory molecules like B7-1 and B7-2 and the accessory molecule CD40. Although these molecules are important for the antigen-presenting function of Langerhans cells, little is known about the precise regulation of their expression on purified Langerhans cells. Using a panning technique, we purified epidermal Langerhans cells to around 95% purity. Freshly prepared Langerhans cells (fLC) expressed the mRNA for receptors for M-CSF (cfms), GM-CSF (GM-CSFR), and TNF-alpha (TNFRII). TNF-alpha markedly upregulated CD40 and B7-1 expression on Langerhans cells, but not B7-2 expression. GM-CSF moderately upregulated B7-1 and B7-2 expression, and slightly upregulated CD40 expression. M-CSF moderately upregulated B7-1 expression, but did not modulate CD40 or B7-2 expression. Dexamethasone (DEX) markedly inhibited CD40, B7-1, and B7-2 expression on Langerhans cells. Cyclosporin A (CsA) and FK506 slightly inhibited CD40 and B7-1 expression on Langerhans cells, but not B7-2. Furthermore, TNF-alpha restored the DEX-induced inhibition of CD40 expression on Langerhans cells, but not the inhibition of B7-1 or B7-2 expression. GM-CSF restored DEX-induced inhibition of CD40, B7-1, and B7-2 expression. M-CSF did not affect the DEX-induced inhibition of these molecule expressions. These data provide a better understanding of the role of selective cytokines and immunosupressive drugs in the modulation of the antigen-presenting capacity of Langerhans cells.     

清热凉血汤对寻常性银屑病患者Th1／Th2型细胞因子的影响

目的观察清热凉血汤对寻常性银屑病患者Th1／Th2型细胞因子的影响。方法将88例患者随机分为两组，对照组口服阿维A胶囊，治疗组在此基础上给予清热凉血方。结果疗效观察：治疗8周后．两组疗效比较差异有统计学意义（P〈0．05），治疗8周后干扰素（IFN）-γ、白介素（IL）-2两组均有明显下降（P〈0．05），但治疗组下降更为明显（P〈0．05），与对照组相比有统计学意义（P〈0．05），治疗组IL-4、IL-10有明显升高（P〈0．05），与对照组相比有统计学意义（P〈0．05）。结论清热凉血汤对于Th1／Th2免疫反应的影响，主要是抑制Th1型免疫反应．提高Th2型免疫反应从而使银屑病患者失衡的Th1/Th2型反应相对地向Th2型免疫反应方向改变而达到临床症状的缓解。