尿道移行上皮细胞与生物可降解尿道支架体外复合培养的研究

目的：研究体外培养的兔尿道上皮细胞在生物可降解性网状尿道支架上的贴附和生长增殖情况,观察其对尿道上皮细胞形态和功能的影响,利用组织工程技术培养种植细胞的尿道内支架。方法：应用机械分离与酶消化法分离培养兔尿道移行上皮细胞,并在体外行原代培养与扩增后制成细胞悬液接种在网状尿道支架上,形成尿道移行上皮细胞-支架复合物。采用免疫组织化学、荧光染色法鉴定尿道上皮细胞及其活性;采用倒置显微镜、扫描电镜观察尿道上皮细胞在支架表面吸附与生长状态。结果：网状尿道支架具有良好的生物相容性,能使尿道移行上皮细胞增殖,不影响其活性。尿道移行上皮细胞在尿道支架上贴附生长良好,1～2天后完全贴壁,3～7天细胞生长增殖活跃,支架网眼内充满上皮细胞,长期培养仍保持尿道移行上皮细胞特性,扫描电镜可见上皮细胞与网状支架贴附紧密,适度伸展并有基质分泌。结论：网状尿道支架适合尿道移行上皮细胞黏附生长．可作为尿道组织工程的细胞载体,利用组织工程方法可获得适于移植尿道细胞的组织工程化尿道。     

生物可降解尿道支架种植尿道移行上皮细胞的研究

我们应用人工合成的生物可降解性单纯型尿道内支架修复战伤性尿道狭窄,证实该材料及方法是可行的[1].本实验旨在将自体的尿道上皮细胞体外培养后,种植于单纯尿道内支架上,制备成附有自体尿道上皮细胞的复合型尿道内支架,为修复尿道损伤提供较实用有效的治疗方法.     

胶原膜与膀胱移行上皮细胞相容性的体外研究

目的检测制备的胶原膜与膀胱移行上皮细胞的细胞相容性,探讨胶原膜作为泌尿系腔道组织工程支架的可能性.方法①选用8～12周新西兰白兔中分离培养的原代膀胱移行上皮细胞,以1×105/cm2种植到制备胶原膜上,于种植后2、12和24小时通过倒置显微镜及扫描电镜观察细胞与胶原膜的黏附.②分别设立空白组(无细胞)、阴性对照组(培养基)、阳性对照组聚氯乙烯管(Polyvinyl chloride,PVC)浸提液和实验组(胶原膜浸提液).取2～4代对数生长期的膀胱移行上皮细胞,接种于96孔板中,每组各5孔,1×104个/孔,于接种后24、72和120小时,通过MTT法显色,并于酶标仪490 nm波长下检测吸光度值,计算相对增殖率,对胶原膜与膀胱移行上皮细胞的相容性进行评估.结果移行上皮细胞2小时后开始在胶原膜上黏附,随时间推移,黏附细胞数量增加;第24、72和120小时实验组吸光度值分别为0.590±0.024、1.065±0.040和1.129±0.074,阴性对照吸光度值分别为0.639±0.068、1.022±0.044和1.087±0.111,阳性对照组吸光度值分别为0.302±0.029、0.653±0.083和0.694±0.031,实验组吸光度值明显高于阳性对照组,有统计学意义(P＜0.01),与阴性对照组比较无明显差异(P>0.05).结论制备的胶原膜与膀胱移行上皮细胞相容性良好,具有作为泌尿系腔道组织工程支架的潜在运用价值.     

尿道种子细胞与生物可降解材料的生物相容性研究

目的 观察生物可降解材料聚β-羟基丁酸酯(PHB)与种子细胞即兔膀胱移行上皮细胞及平滑肌细胞间的生物相容性,探讨其作为种子细胞载体构建组织工程化尿道的可行性.方法 经过传代培养,分别在PHB与上皮细胞共同培养2、7 d,与平滑肌细胞共同培养1、5 d,每组各取6个样本,用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞的增殖情况,并利用扫描电镜检测细胞在材料上的空间生长情况,评估移行上皮细胞和平滑肌细胞与聚β-羟基丁酸酯的生物相容性.结果 平滑肌细胞能够在该材料上正常生长,各组间A值差异无统计学意义(P>0.05);而移行上皮细胞在该材料上只有少量生长,且实验组与对照组间A值差异有统计学意义(P<0.05),而A、B两实验组间A值差异无统计学意义(P>0.05).结论 聚β-羟基丁酸酯与平滑肌细胞具有良好的生物相容性,但其对移行上皮细胞的生长具有一定的抑制作用,生物相容性不甚理想.     

尿道粘膜上皮细胞的分离培养和鉴定

目的：为采用组织工程技术构建尿道粘膜组织提供实验依据。方法：取雄性新西兰幼兔尿道粘膜组织小块,酶消化成单细胞悬液,接种后静置培养、传代。动态观察细胞形态变化及生长增殖情况。细胞进行常规组化染色、免疫组化染色及流式细胞仪检查,并观察超微结构。结果：整个上皮细胞生长期内无成纤维细胞混杂生长,均为单一的上皮细胞,并证实为二倍体细胞。细胞可传11－13代,成活50－60d。结论：新西兰幼兔尿道粘膜上皮细胞可在体外培养,在一定时间内保持增殖能力。     

以L929细胞为滋养层的尿道黏膜上皮细胞体外培养

目的 探索尿道黏膜上皮细胞体外培养的技术和方法，为进一步采用组织工程技术构建尿道黏膜组织奠定基础，并为尿道黏膜的生理、药理、毒理学及微生态研究提供实验模型。方法 取刚离乳的雄性新西兰幼兔尿道黏膜组织，分别以DispaseⅠ消化液和混合消化液消化成单细胞悬液，以差速贴壁法排除成纤维细胞，接种后以L929细胞为滋养层细胞进行培养，定期换液，细胞生长、增殖至80％～90％融合时传代。细胞进行常规HE染色、流式细胞仪检测，以扫描电镜、透射电镜观察其超微结构。再分别设立实验组(n=20)、阳性对照组(正常尿道黏膜组织石蜡切片，n=20)及阴性对照组(成纤维细胞铺片，n=20)行免疫组织化学染色。结果 原代培养10天左右细胞逐渐生长融合成片，如铺路石状，细胞大小均一。上皮细胞为二倍体细胞，生长期内均为单一的上皮细胞，无成纤维细胞混杂生长，细胞可传11～13代，成活50～60天。结论 新西兰幼兔尿道黏膜上皮细胞可在体外进行培养，在一定时间内保持增殖活力，为构建组织工程化尿道奠定了基础，且为尿道黏膜的体外研究提供了实验模型。     

人舌黏膜上皮细胞体外构建组织工程尿道的初步研究

目的 探索人舌黏膜上皮细胞和脱细胞支架体外复合构建组织工程尿道的可行性.方法 前尿道狭窄患者10例,手术切取0.5 cm×0.8 cm大小舌黏膜组织,分离获得舌黏膜上皮细胞,AE1/AE3抗体行细胞免疫荧光鉴定.收集第3代上皮细胞,按1×107/ml密度分别接种于脱水BAMG支架、液体保存BAMG支架以及4层脱细胞基质(SIS)支架表面,体外培养7d后行HE及扫描电镜检测.结果 10例患者术后1个月未出现舌部相关并发症.14 d后原代舌黏膜上皮细胞融合达90％～95％并呈典型的“鹅卵石”状生长.第3代时增殖速度达顶峰,平均7d达到90％～95％融合,第4代开始细胞逐渐老化.HE及扫描电镜检测液体保存BAMG支架表面仅复合极少量细胞,脱水BAMG以及SIS支架表面可见明显多层上皮细胞覆盖,其中4层SIS支架内部可见局部细胞浸润性生长迹象 结论 人舌黏膜上皮细胞可以作为组织工程尿道上皮种子细胞来源之一,与脱水处理后的SIS和BAMG有很好的组织相容性和黏附能力,二者的有效复合可以构建适合尿道修复重建需要的组织工程替代材料.     

膀胱移行上皮细胞的体外培养研究

目的：探索并建立大鼠膀胱移行上皮细胞的体外培养方法，为膀胱癌相关研究提供实验依据。方法：获取Wistar大鼠膀胱粘膜，采用Dispase酶消化法收集上皮细胞。动态观察细胞形态变化、生长增殖情况；对培养细胞进行细胞周期检测及超微结构观察，并行免疫组织化学鉴定。结果：培养细胞为二倍体移行上皮细胞，无成纤维细胞混杂生长。免疫组织化学证实角蛋白染色阳性。结论：膀胱移行上皮细胞体外培养为体外研究提供了理想的模型。     

原位定量检测体外培养的尿道黏膜上皮细胞活性

目的解决在不透明载体上观察细胞生长状况的难题。方法取雄性新西兰幼兔1只,进行尿道黏膜上皮细胞的原代培养并传至第3代。将其接种于胶原-壳聚糖复合材料上,体外培养3、7、14和21d后,行6-羧基二乙酸甲酯荧光素与碘化丙啶荧光双染,并应用激光共聚焦细胞仪检测。结果尿道黏膜上皮细胞在胶原-壳聚糖复合材料载体上生长,增殖良好。培养3、7d,活细胞荧光强度值为(1.09±0.13)×108、(2.04±0.13)×108,培养14、21d活细胞荧光强度值分别为(0.55±0.09)×108、(0.47±0.03)×108,与培养3、7d比较差异均有统计学意义(P<0.05)。各时间点死细胞荧光强度值差异无统计学意义(P>0.05)。结论利用激光共聚焦细胞仪对不同波长荧光强度分别进行定量分析,可以在原位定量快速检测尿道黏膜上皮细胞活性,动态观察组织工程组织生长情况,解决无法在不透明载体上观察细胞生长状况的难题。     

生物可降解人工胸壁的生物相容性与体内降解研究

目的对制备的人工胸壁材料的生物相容性及体内降解情况进行研究,为其应用于临床提供实验依据。方法参照医疗器械生物学评价标准和要求,对人工胸壁组分材料聚对二氧环己酮(A)、壳聚糖(B)、羟基磷灰石/胶原海绵(C)进行评价。溶血实验另设生理盐水为阴性对照组,蒸馏水为阳性对照组,各组取样本5个加抗凝兔血0.2ml,取上清测吸光度(A)值并计算溶血率。取20只小鼠行急性全身毒性实验,每组5只,分为A、B、C和阴性对照组;阴性对照注入生理盐水,A、B、C组由尾静脉注入A、B、C材料浸提液,50ml/kg,于24、48、72h时观察。热源实验取12只大白兔,每组3只,分为A、B、C组和阴性对照组(注入生理盐水),自耳静脉分别注射A、B、C材料浸提液,10ml/kg后,每隔1h测肛温1次,共3次,观察动物的体温变化,并计算各兔体温的升高度数和升高总数。体内植入及降解实验取12只大白兔,将A、B、C材料(制成10mm×10mm大小)分别植入背部肌肉内,于2、4、8、12、16、24周各时间点处死2只,行大体观察,组织学、材料降解及组织相容性观察。结果人工胸壁各组分材料的溶血率均小于国家规定的5%标准,在体外不引起溶血反应;与阴性对照组比较无统计学意义(P>0.05);不引起全身毒性反应,各材料注入后,A、B、C组动物均无死亡,活动进食正常。热源实验各组动物体温升高值均在0.6℃以下,且每组3只兔体温升高值的总数<1.4℃,无致热作用;各材料植入体内初期有轻度炎性反应,随植入时间延长逐步减轻;组分材料分期降解吸收,降解过程中未见组织变性、坏死和异常增生。结论人工胸壁各组分材料具有良好的生物相容性和适宜的降解性能,具有临床开发应用前景。     

Biodegradable urethral stents seeded with autologous urethral epithelial cells in the treatment of post‐traumatic urethral stricture: a feasibility study in a rabbit model

OBJECTIVE

To evaluate the adhesion and growth of rabbit urethral epithelial cells (UECs) on a biodegradable unbraided mesh urethral stent, and to assess the feasibility and effect of the cell‐seeded urethral stent for treating post‐traumatic urethral stricture (PTUS) in a rabbit model.

MATERIALS AND METHODS

Rabbit UECs were collected by biopsy from adult rabbit urethra and seeded onto the outer layer of a mesh biodegradable urethral stent. The growth of UECs in cell‐scaffolds was assessed by scanning electron microscopy, immunohistochemical and fluorescence staining. In all, 32 male New Zealand rabbits were used, with either PTUS or uninjured, as a control group. Cell‐seeded stents were implanted into the rabbits strictured urethra. The histological and immunohistochemical findings were assessed after death at 1, 2, 8, 12 and 24 weeks, respectively. The reconstruction and function were evaluated by urethroscopy and retrograde urethrography.

RESULTS

The cultured UECs adhered to the stent and grew well. Immunohistochemistry showed that the cells were stained positively for cytokeratin. At 4 weeks, vs 2 weeks, the thickness of the papillary projections of the epithelium decreased and inflammatory cell infiltration diminished. At 24 weeks the injured urethra was completely covered by integrated regeneration of three to five layers of urothelium. There was no evidence of voiding difficulty, stricture recurrence or other complications.

CONCLUSIONS

The unbraided mesh biodegradable urethral stent with autologous UECs seemed to be feasible for treating PTUS in the rabbit urethra, and provides a hopeful avenue for clinical application allowing reconstruction of PTUS.     

尿道细胞外基质修复尿道缺损的研究

目的 寻求一种较理想的尿道修复材料。方法 20只家兔尿道制成尿道细胞外基质(ECM)；另40只随机分3组：尿道ECM移植组(实验组)，对照组Ⅰ及对照组Ⅱ。实验组切除尿道1．O～1．5cm后用尿道ECM修复并于术后10d、3周、6周及24周行组织再生情况观察；另于术后10周、24周各取4只行膀胱尿道造影；24周时实验组及对照组Ⅰ各取4只行尿流动力学检测；24周实验组取4只行尿道镜检查。结果 缺损修复术后10d，基质中见单层上皮细胞且有血管长入ECM；3周时尿道ECM管腔已完全被上皮细胞覆盖；6周时可见平滑肌细胞再生，炎性细胞消失；24周后其组织结构与正常组织相比差异无统计学意义。膀胱尿道造影无尿液外渗，无梗阻及结石形成。尿流动力学检测结果实验组与对照组Ⅰ差异无统计学意义；尿道镜检查证实尿道黏膜完整光滑，尿道内径及其形态正常。结论 尿道细胞外基质是一种理想的尿道修复材料。     

血管细胞外基质和尿道细胞外基质修复兔尿道缺损的比较研究

目的　寻求较理想的尿道修复材料。　方法　切取 10只家兔的腹主动脉和尿道各 3cm ,制备成血管细胞外基质 (VECM)和尿道细胞外基质 (UECM)。另 2 0只分别切除尿道 2 .5cm并随机分为VECM修复组和UECM修复组。两组均于修复术后 10d、3周、6周及 2 4周行组织再生情况研究 ;另于术后 10周、2 4周各取 2只行膀胱尿道造影 ;2 4周两组各取 2只行尿动力学检测和尿道镜检查。　结果　制备的VECM和UECM均为白色透明状 ,但VECM较UECM弹性和机械强度好。缺损修复术后10d ,基质中见单层上皮细胞且有血管长入ECM ,基质和受体尿道连接处有炎性细胞浸润 ;3周时基质管腔已完全被上皮细胞覆盖 ;6周时可见平滑肌细胞再生 ,炎性细胞消失 ;2 4周后其组织结构与正常尿道组织结构一致。VECM修复组和UECM修复组相比其组织再生过程无差异。尿动力学检测VECM修复组和UECM修复组的膀胱容量分别为 (30 .2± 1.6 )ml和 (32 .1± 1.4 )ml、尿道最高压分别为(15 .2 7± 1.36 )mmHg和 (14 .6 8± 1.6 5 )mmHg、尿道最低压分别为 (12 .4 9± 1.2 3)mmHg和 (11.96±0 .98)mmHg ,差异无统计学意义 (P >0 .0 5 )。膀胱尿道造影可见尿道壁完整光滑通畅 ,不能分辨移植区与正常组织 ,无尿液外渗 ,无梗阻及结石形成 ;尿道镜检查证实VECM修复组和U     

人细胞外基质支架联合脂肪干细胞构建脂肪组织

目的 探讨人脂肪组织细胞外基质(ECM)支架联合人脂肪来源干细胞(ADSCs)构建工程化脂肪组织的可行性.方法 以酶消化法从人抽脂术抽吸物脂质部分获取人ADSCs,体外进行多向分化诱导鉴定,并行DiI荧光标记.从抽脂术的脂质部分分离提取人脂肪组织细胞外基质,经过低温冻干、粉碎、灭菌等处理,制备成粉末状,电镜扫描观察表面特征并将其与ADSCs进行黏附实验,探讨其作为支架材料的可行性.收集人ADSCs,以2×109/L的细胞密度与提取的细胞外基质支架复合后移植于裸鼠背部皮下,同鼠对侧背部皮下移植ECM支架和细胞培养液作为对照,每侧移植0.5 ml,共6只实验鼠.8周后取材,称量标本湿重.取出的标本行苏木素-伊红(HE)染色和油红O染色进行定性判断,分析人脂肪组织ECM支架联合人ADSCs构建工程化脂肪组织的能力.结果 从脂肪组织中分离得到人ADSCs和ECM支架.ADSCs在相应的诱导环境下能够分化成为脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞.ECM支架电镜扫描和大体观察具有疏松、多孔的结构特征,适合ADSCs的黏附生长.ADSCs与支架相容性良好,黏附率达(89.87±2.59)％,细胞在支架表面可充分伸展生长.体内移植8周后,实验组和对照组都能够形成新生物,湿重比较实验组较对照组重(P＜0.05).经HE切片及油红O染色均证实实验组形成成熟的脂肪组织,对照组不能形成脂肪组织.结论 人脂肪组织ECM支架联合人ADSCs在体内能够成功构建成熟的脂肪组织,8周后支架并无明显吸收.     

聚乳酸-羟基乙酸胶原膜生物相容性的实验研究

目的　评价海绵状聚乳酸 羟基乙酸 (PLGA)胶原膜作为真皮支架材料的生物相容性。　方法　利用SD大鼠和培养的人表皮细胞、成纤维细胞 ,观察PLGA胶原膜在体内的降解过程和在体外的细胞毒性、溶血性以及与人体细胞的亲和性。　结果　PLGA胶原膜在体内具有适当的降解速率 ,9周可完全降解 ;置入皮下 3周后可见血管化 ,新生组织不断长入 ,未见明显的炎症反应。浸泡液对培养细胞没有明显的毒性作用 ,不发生溶血反应。成纤维细胞和表皮细胞在PLGA胶原膜上可快速黏附、增殖。　结论　PLGA胶原膜具有良好的生物相容性和细胞亲和性 ,具有适当的降解速率 ,符合作为组织工程支架材料的要求     

小肠粘膜下层的制备及细胞相容性的实验研究

目的了解猪小肠粘膜下层(SIS)的细胞相容性,探讨用SIS为生长载体复合骨髓基质干细胞(BMSCs)构筑组织工程骨的可能性。方法用物理和化学方法处理猪小肠粘膜下层,将兔骨髓基质干细胞与SIS进行体外复合培养,分别进行组织学、相差显微镜和扫描电镜观察。结果经物理和化学处理的SIS纯度高,孔隙多,胶原纤维未受损;BMSCs在SIS材料上生长、粘附、增殖,并能长入材料的孔隙内,分泌大量的细胞外基质成分。结论SIS的细胞相容性良好,不影响BMSCs的形态,对细胞生长和功能表达无抑制作用,可以用作骨组织工程的支架材料。     

Long-term study of male rabbit urethral mucosa reconstruction using epidermal cell

Aim： To investigate the transformation of characteristics of epidermal cells from foreskin which were used to reconstruct male rabbit anterior urethra in combination with acellular collagen matrices. Methods： In three rabbits, autologous foreskin epidermal cells were isolated, expanded in vitro, and seeded （inoculated） onto a tubular acellular collagen matrix, acquired from allogeneic rabbit bladder submucosa. A urethral mucosal defect was created, and urethral reconstruction was performed with the tubular acellular collagen matrix seeded with epidermal cells. Results： On gross examination at 12 months following the procedure, the mucosa of the urethral grafts appeared lubricous and smooth. Urethrography showed that a wide urethral caliber had been maintained without any sign of strictures. Histological examination showed a transitional cell layer in the graft without evidence of a margin between the graft and the host tissue at 12 months postoperatively. Conclusion： Epidermal cells seeded onto acellular collagen matrices can be successfully used to reconstruct urethras that have defects and are transformed to transitional epithelial cells.     

胎儿毛乳头细胞分化为类成骨细胞的实验研究

目的 研究胎儿毛乳头细胞的体外成骨能力，为骨组织工程提供一种新的种子细胞。方法 Ⅰ型胶原酶消化法分离毛乳头，常规成纤维细胞培养液培养毛乳头细胞。第3代和第7代细胞经成骨诱导液诱导培养7d，以免疫荧光、Von Kossa等方法鉴定毛乳头细胞及检测细胞的成骨特性。结果 培养的毛乳头细胞呈聚集性生长，表达平滑肌肌动蛋白和Ⅰ型胶原。经成骨诱导后表达骨桥蛋白，有钙结节形成。结论 毛乳头细胞具有成骨活性，可作为骨组织工程的种子细胞。     

真皮多能干细胞与聚(对苯二甲酸丁二醇酯-co-聚乙二醇-co-低聚乳酸)三元共聚酯的生物相容性

目的 观察小鼠真皮多能干细胞(SKP)与聚(对苯二甲酸丁二醇酯-co-聚乙二醇-co-低聚乳酸)(PBTEOLA)三元共聚酯的生物相容性.方法 分离培养小鼠乳鼠SKP.用DAPI标记SKP细胞核后,荧光显微镜下动态观察SKP接种在共聚酯支架上的生长情况;SKP与共聚酯体外立体培养至第4天和第7天时,通过扫描电镜及苏木素-伊红(HE)染色观察细胞生长及基质分泌情况;噻唑蓝(MTY)比色法检测共聚酯对SKP的增殖影响.结果 SKP细胞接种于共聚酯上24 h后即贴壁生长,第5～7天时为生长高峰.SKP牢固地黏附于共聚酯材料表面和孔隙内,细胞间有伪足相连,且有基质形成.检验时间因素和材料因素交互作用时,差异无统计学意义(P＞0.05).共聚酯对细胞生长无明显影响.结论 PBTEOLA三元共聚酯对SKP细胞具有良好的生物相容性,可选择作为组织工程的支架材料.