HBV相关性肝细胞癌肝组织蛋白质组差异的初步分析

目的分析HBV相关性肝细胞癌蛋白质组与癌周组织（肝硬化组织、慢性肝炎组织）蛋白质组之间的差异，鉴定其中的差异蛋白质点。方法应用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳，对18例肝细胞癌组织与12例肝硬化组织、6例慢性肝炎组织的蛋白质组表达谱进行差异分析，应用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱仪对差异蛋白质点进行了鉴定。结果肝细胞癌组织与癌周组织的对比中，共发现有表达水平存在显著差异的47个蛋白质点，17个差异蛋白质点得到了初步鉴定，其中8个蛋白质点在既往文献中未曾报道其与肝细胞癌变相关。结论慢性肝炎基础上发生的癌变与肝硬化基础上发生的癌变，其癌变机制存在差别。本实验研究中初步鉴定的差异蛋白质，可能有助于HBV相关性肝细胞癌的癌变机制、肿瘤标记和治疗靶标的进一步研究。     

HBV相关性肝细胞癌及肝硬化患者外周血单个核细胞质谱分析

目的:建立HBV相关性肝细胞癌(HCC)及肝硬化(LC)患者外周血单个核细胞(PBMC)的双向凝胶电泳图谱,并识别鉴定其差异表达的蛋白质.方法:利用固相pH梯度双向凝胶电泳分离HBV相关性HCC(n=16)及LC患者(n=12)PBMC的总蛋白质,凝胶经蓝银显色后,PDQuest图像分析软件进行比较分析、识别差异表达的蛋白质,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)得到相应的肽质指纹图谱,然后搜索数据库鉴定部分差异蛋白质点.结果:得到了分辨率较高、重复性较好的HBV相关性HCC及LC患者PBMC双向凝胶电泳图谱,HBV相关性HCC及LC患者PBMC凝胶的平均蛋白质点数分别为1186±43及1013±41;组内的平均匹配率分别为91.6%,90.2%.对27个差异蛋白质点进行了质谱分析,鉴定出16个蛋白质,在HBV相关性HCC患者PBMC中表达明显增强的有热休克蛋白质(HSP)27、ras癌基因家族(RAB14)、肌动蛋白、α1-抗胰蛋白及RNA结合蛋白调节亚基等13个蛋白点;而PDX6、HSPA8及锰超氧化物歧化酶(MnSOD)在HCC患者PBMC中低表达.这些差异蛋白质点包括蛋白质合成与分解、分子伴侣、解毒和DAN修复相关蛋白质、三大代谢相关酶类、细胞结构相关蛋白质以及信号传导相关蛋白质六类.结论:建立了分辨率高且重复性较好的HBV相关性HCC及LC患者PBMC双向凝胶电泳图谱,并识别鉴定出了一些与HBV相关性HCC癌变相关的差异表达的蛋白质.     

应用肝组织蛋白质组模式诊断乙型肝炎病毒相关性肝细胞癌的初步研究

目的获得能早期诊断乙型肝炎病毒(HBV)相关性肝细胞癌(HCC)的癌组织蛋白质组模式。方法应用双向凝胶电泳(2 DE)技术获得癌组织和非癌组织蛋白质表达谱。先对14例癌组织和非癌组织蛋白质表达谱进行分析，在癌组织蛋白质表达谱中发现具有鉴别癌组织和非癌组织的蛋白质组模式，再应用该模式对48例未知的癌组织和非痛组织2-DE图谱进行检测。结果未知的癌组织与非癌组织均得到准确鉴定，灵敏度和特异性均为100％。结论对蛋白质组模式中的蛋白质点进一步分析有助于研究HBV相关性HCC的肿瘤标记。蛋白质组模式技术亦有望成为在高危人群和普通人群中对恶性肿瘤进行筛查的工具。     

细胞角质素19及消减基因P02在肝细胞癌组织及卵圆细胞中的表达

目的:观察细胞角质素19(CK19)及消减基因P02在肝细胞癌,肝硬化组织及卵圆细胞中的表达情况.方法:采用免疫组化SP法观察8例正常肝组织,27例肝硬化组织和43例肝细胞癌组织中CK19的表达.采用DIG-probe synthesis kit,聚合酶链反应方法制备P02探针,通过原位杂交方法检测P02在肝细胞癌,肝硬化组织及卵圆细胞中的表达.结果:CK19在肝硬化组与正常肝组织之间表达率无明显差异,但在肝细胞癌组与肝硬化组之间差异有显著性(69.77% vs 25.93%,P<0.01).肝硬化组织与肝细胞癌组织中CK19标记的卵圆细胞数量有显著性差异(5.74±1.05 vs 10.51±1.78,P<0.01).P02在肝硬化和肝细胞癌中的阳性表达率分别为26.7%和80%,二者之间表达有显著性差异(P<0.01).结论:CK19可能参与了肝硬化到肝细胞癌的癌变过程.卵圆细胞与肝脏损伤后再生及癌变有关,可能是P02通过促进卵圆细胞的增殖来介导肝细胞癌的发生.     

蛋白芯片技术对肝细胞癌组织蛋白谱的建立及标志蛋白的筛选

目的:应用表面增强激光解吸附电离飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS)对肝细胞癌组织的蛋白表达谱进行分析,从中筛选出标记蛋白.方法:采用CM10芯片及SELDI-TOF-MS技术对肝细胞癌组织26例和肝硬化组织18例进行蛋白指纹图谱检测分析;比较高、中、低分化肝细胞癌组织,不同TNM分期肿瘤以及AFP阴、阳性肝细胞癌组织的蛋白表达差异,所得结果均采用Biomarker Wizard软件进行分析;通过查询蛋白库,对特定分子质量所对应的标记蛋白进行初步确定.结果:肝细胞癌和肝硬化组织蛋白表达图谱之间存在16个稳定的标志蛋白,7个蛋白在肝细胞癌组织中表达上调.9个蛋白在肝细胞癌组织中表达下调,其中4.7 kDa,7.2 kDa和9.8 kDa蛋白峰差异性最明显;中分化和高分化肝细胞癌之间存在11个标志蛋白;通过查询蛋白库ExPasy并进行筛选,初步确定特定分子质量所对应的蛋白.结论:采用SELDI-TOF-MS技术,证实在肝细胞癌组织中存在多种高度特异性低分子蛋白.     

萎缩性胃炎组织病理背景胃癌的差异蛋白组学研究

目的通过新兴的蛋白组学方法分析筛选萎缩性胃炎向胃癌转变过程中关键的蛋白分子,探讨萎缩性胃炎癌变的分子机制。方法外科手术获取内镜及病理检查提示在萎缩性胃炎组织病理基础上发生的胃癌组织及癌周萎缩性胃炎组织。采用蛋白组学通用的双向电泳及质谱分析技术,筛选并鉴定胃癌组织及癌周萎缩性胃炎组织中差异表达的蛋白质。结果胃癌组织与癌旁萎缩性胃炎组织比较,共筛选出显著差异表达蛋白点29个,其中表达上调蛋白质点18个,表达下调蛋白点11个,这其中共有23个蛋白点被鉴定,上调蛋白14个,下调蛋白9个。结论在萎缩性胃炎基础上发生胃癌与其炎症组织背景的蛋白质表达存在显著差异,这些差异表达蛋白分子可能揭示萎缩性胃炎癌变的分子机制。     

疣状胃炎病损组织与同遗传背景胃癌组织的差异蛋白组学研究

[目的]通过差异蛋白组学方法分析疣状胃炎与同遗传背景胃癌组织的差异蛋白表达,旨在筛选该型胃炎向胃癌转变过程中关键的蛋白分子,探讨其癌变的分子机制。[方法]外科手术获取内镜及病理检查提示同时存在胃癌与疣状胃炎病变患者的病变组织,采用比较蛋白组学通用的双向电泳及质谱分析技术,筛选并鉴定胃癌组织及癌周疣状胃炎组织中差异表达的蛋白质。[结果]胃癌组织与癌旁疣状胃炎组织比较,共筛选出显著差异表达蛋白点34个,其中表达上调蛋白质点20个,表达下调蛋白点14个;共有27个蛋白点被鉴定,上调蛋白17个,下调蛋白10个。[结论]在疣状胃炎基础上发生的胃癌与其疣状胃炎病损组织的蛋白质表达存在显著差异,这些差异表达蛋白分子涉及细胞增殖、凋亡、运动、物质能量代谢等诸多功能领域,其代表的分子信号转导途径可能揭示疣状胃炎癌变的分子机制。     

肝硬化和肝细胞癌与HBV耐药关系探讨

目的研究肝硬化、肝细胞癌与HBV耐药的关系。方法选取2009年至2018年南京市第二医院收治已发生HBV耐药的肝硬化与肝细胞癌患者46例,分析其血清学、病毒学、基因学与HBV耐药相关性,符合正态分布的计量资料比较采用t检验,计数资料比较采用χ2检验。结果肝硬化组与肝癌组年龄差异无统计学意义(P=0.411),两组生化指标ALT、AST差异无统计学意义(P=0.475、P=0.237),病毒载量肝硬化组高于肝癌组(P=0.018),两组患者单一耐药与多重耐药发生率差异无统计学意义(χ2=0.046,P=0.831)。结论 HBV耐药引起的抗病毒治疗失败会导致持续病毒复制、肝炎进展,应分析患者临床指标给予个体化抗病毒治疗方案,进行定期随访,观察后续病情发展。     

肝癌及癌旁肝组织的高尔基体差异蛋白质分析

目的 筛选并鉴定肝癌及癌旁肝组织高尔基体蛋白质组中差异表达的蛋白质,从高尔基体层面解释肝癌的发生和发展机制,为早期诊断和抗癌药物的研发提供线索.方法 应用亚细胞比较蛋白质组学研究方法,比较分析肝癌及癌旁肝组织高尔基体蛋白质组.收集肝癌患者手术切除的癌组织和癌旁肝组织标本,蔗糖密度梯度离心法分离高尔基体.建立并优化两种组织高尔基体的双向电泳方法,用PD-Quest软件分析差异表达的蛋白质点,然后用质谱仪获取相应蛋白点的肽质指纹图谱,联网到Swiss-Prot蛋白质组数据库鉴定获得的差异蛋白质点,最后用Western blot验证双向电泳结果.蛋白质相对表达量的比较采用配对t检验.结果 获得了分辨率和重复性均较好的双向电泳银染图谱.与癌旁肝组织相比,肝癌高尔基体蛋白质组有包括膜联蛋白5在内的27个蛋白质位点表达上调,包括染色体修饰蛋白2b在内的20个蛋白质位点表达下调,初步鉴定出了其中17个蛋白质,并用Western blot从蛋白质水平上验证了双向凝胶电泳结果.结论 肝癌及癌旁肝组织高尔基体蛋白质组具有不同的蛋白质位点,这些差异表达的蛋白质涉及到细胞的能量代谢、肿瘤的侵袭和转移,细胞周期调控等方面,为进一步阐释高尔基体在肿瘤的发生和发展中所起的作用提供了有价值的信息.     

慢性乙肝患者ALT、HBV DNA、ccc DNA及肝组织免疫组化的相关性

目的探讨慢性乙肝(CHB)患者丙氨酸氨基转移酶(ALT)、HBV DNA、ccc DNA及肝组织免疫组化的相关性。方法随机选取该院治疗的CHB患者60例,根据有无接受正规抗病毒治疗分为未治疗组(n=42)和治疗组(n=18)。研究未治疗组患者肝细胞HBV DNA、ccc DNA及肝组织免疫组化的相关性及治疗组患者肝细胞HBV ccc DNA变化。结果未治疗组患者肝细胞中HBV DNA和ccc DNA水平均与肝组织纤维化程度呈负相关,其中ccc DNA呈强相关性(r=-0.523,P=0.004)。肝细胞HBV DNA和ccc DNA之间未显示相关性(r=0.064,P=0.642)。从未治疗组中选取一般资料与治疗组差异不显著的20例患者为对照组,治疗组患者肝细胞HBV ccc DNA较对照组显著下降(P<0.05)。结论肝组织纤维程度与肝细胞HBV ccc DNA呈负相关,HBV DNA水平与肝内病毒复制情况不存在相关性。     

肝细胞癌和肝硬变组织中突变型P53蛋白的表达及与HBV DNA的关系

应用LSAB免疫组化技术,检测肝内突变型P53蛋白的表达;用地高辛探针原位杂交检测HBV DNA。结果显示,31例肝细胞癌(HCC)及其癌旁组织中突变型P53蛋白阳性率分别为45％和48％,而11例肝硬变中检出4例(36.4％)。HBV DNA阳性率分别为46％和86％。癌旁组织中突变型P53蛋白表达与HBV DNA存在相关关系(P<0.05)。提示P53基因突变与HBV慢性感染有关,可能是诱发肝癌的机制之一。癌旁组织和肝硬变组织中也存在P53蛋白异常表达,表明肝癌形成早期就发生了53基因的突变。     

血清蛋白质组分析技术筛选肝癌自发抗体

目的采用血清蛋白质组分析技术(SERPA)筛选、鉴定肝癌自发抗体。方法双向电泳分离肝癌细胞系HCCLM3的总蛋白后将其转膜,肝癌、肝炎和正常组血清各8份与膜免疫印迹,图像分析确定不同血清免疫印迹图谱间的差异点及其与双向电泳图谱的对应关系,最后用基质辅助激光解吸飞行时间质谱进行鉴定。结果建立了高重复性HCCLM3的双向电泳图谱及其肝癌、肝炎及正常组血清的免疫印迹图谱,图谱均点数分别为603、70.75±24.25、68.50±23.44和41.38±15.05,肝癌、肝炎组图谱点数明显多于正常组,但肝癌与肝炎组差异无统计学意义。质谱鉴定确定了核蛋白、细胞骨架、代谢酶及热休克蛋白等五类肝癌自发抗体。结论SERPA是一种高通量筛选、鉴定肿瘤自发抗体的新技术,大量肝癌自发抗体的发现为肝癌进一步的免疫诊断及治疗奠定了基础。     

乙型肝炎病毒X基因转染人肝癌细胞株双向凝胶电泳图谱分析

目的 研究转染HBV X基因的人肝癌细胞株中蛋白质表达谱的改变,为筛查在HBV相关性肝细胞癌发生中发挥重要作用的关键蛋白质分子奠定基础.方法 利用分子生物学方法建立稳定表达HBV X蛋白(HBx)的肝癌细胞株HepG2+HBx,同时设空载体peDNA3转染细胞HepG2-pcDNA3及HBV全基因转染的人肝癌细胞株HepG2.2.15为对照.PCR法扩增Neo基因检测质粒DNA片段的插入,免疫印迹法检测HBx蛋白的表达.利用固相pH梯度双向凝胶电泳分离3种肝癌细胞株HepG2-pcDNA3、HepG2-HBx和HepG2.2.15的总蛋白,用图像分析软件比较、分析、识别细胞间的差异表达蛋白质.统计学分析采用t检验.结果 获得分辨率高、重复性好的3种细胞的双向电泳(2-DE)图谱.软件分析表明,HepG2-pcDNA3、HepG2-HBx和HepG2.2.15细胞的2-DE凝胶可识别蛋白点分别为(2 095±137)、(2 188±105)和(2 109±20)个.比较HepG2-pcDNA3与HepG2-HBx细胞的2-DE图谱发现37个差异显著的蛋白点,其中21个在HepG2-HBx表达上调,16个下调.6个表达量差异在5倍以上(t=0.027,P＜0.05);HepG2.2.15与HepG2-HBx细胞相比,有38个差异显著的蛋白点,其中35个在HepG2-HBx细胞中上调,3个下调,14个表达量差异在5倍以上(t=0.031,P＜0.05).结论 HBx基因转染引起人肝癌细胞株蛋白质表达谱的变化,可能与感染的肝细胞发生恶性转化的分子生物学机制有关.     

Association between epidermal growth factor 61A/G polymorphism and hepatocellular carcinoma susceptibility in Chinese patients

Background and aims: Chronic hepatitis B virus (HBV) infection is an important risk factor for hepatocellular carcinoma (HCC) development in China, while little is known of the genetic susceptibility to hepatocarcinogenesis. The epidermal growth factor (EGF) pathway plays an important role in tumorigenesis, including HCC. EGF polymorphisms are associated with susceptibility to several types of cancers. Therefore, this study aimed to assess whether EGF genetic polymorphisms can influence HCC development. Methods: A total of 338 chronic HBV‐infected patients (186 HCC patients and 152 cirrhotic patients) and 186 healthy individuals were enrolled in this study. EGF 61A/G polymorphisms of all subjects and 12 cell lines were assayed with polymerase chain reaction‐restriction fragment length polymorphism and the sequencing method. Furthermore, EGF protein levels were measured in the serum and the results were compared with the different genotypes. EGF expression in the liver tissue of the HCC patients was detected by immunohistochemical analysis. Results: EGF 61A and 61G allele frequencies in healthy subjects were 28.76 and 71.24%. EGF 61GG and G allele frequencies in the HCC group were higher than those in the cirrhosis group. EGF protein levels with the GG genotype were significantly higher than those with either the GA or the AA genotype. About 59.09% of HCC liver tumour tissues assayed showed EGF protein expression. Conclusions: The EGF 61 GG genotype might be associated with a high risk for the development of chronic HBV infection‐related HCC in Chinese patients.     

鳞状细胞癌抗原与肝细胞癌的关系

鳞状细胞癌抗原(SCC-Ag)是一种肿瘤相关蛋白,SCC-Ag可能通过抑制肿瘤细胞凋亡和免疫细胞向肿瘤位置迁移参与恶性生物学过程。在肝细胞癌(HCC)组织,SCC-Ag的表达水平明显高于肝硬化组织和正常肝组织,HCC患者血清SCC-Ag水平亦明显高于肝硬化患者及正常人,SCC-Ag有可能成为新的肝细胞癌标志物。     

Screening and detection of portal vein tumor thrombi-associated serum low molecular weight protein biomarkers in human hepatocellular carcinoma

Purpose Serum low molecular weight protein biomarkers might be important in relation to portal vein tumor thrombi (PVTT) in hepatocellular carcinoma (HCC). This study aimed to screen and to detect these biomarkers. Methods We selected sera of 3 groups from 12 healthy volunteers, 12 HCC patients without PVTT and 12 HCC patients with PVTT, respectively. By using two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) in which the first dimension was 16% SDS-PAGE, serum protein images of 3 groups were analyzed by Image Master Software. The differential protein spots were further identified by MALDI-TOF MS/MS. Results Compared with 12.5% SDS-PAGE gel, there were more protein bands between 3 and 20 kDa in 16% SDS-PAGE gel and low molecular weight (MW) protein spots (<20 kDa) were clearly shown. Fifteen differential protein spots representing five proteins were found in the three groups by inter-class comparison and were then identified. Compared with the healthy group, apolipoprotein A-I, lipoprotein CIII, transthyretin and DNA topoisomerase II were down regulated in HCC groups while haptoglobin-2 was over expressed. All the five proteins were less in PVTT group than in non-PVTT group. Conclusion The expression of low MW serum protein changes obviously in the beginning and progressive stage of HCC, and differentially expressed low MW proteins might be the potential biomarkers in early prognostication and surveillance of treatment for HCC and PVTT.