多重逆转录-聚合酶链反应检测麻疹风疹流行性腮腺炎病毒基因的研究

目的　探索麻疹、风疹、流行性腮腺炎 (腮腺炎 )病毒感染的快速诊断方法。方法　利用多重逆转录 聚合酶链反应 (MRT PCR)方法对麻疹、风疹、腮腺炎病毒的相关基因检测进行研究。结果　直接从麻疹疫苗沪1 91 株 ,风疹疫苗BRDⅡ株 ,腮腺炎疫苗S79株 ,冻干麻疹、腮腺炎、风疹联合减毒活疫苗及临床麻疹、风疹、腮腺炎患者的标本中 ,同时检测出麻疹、风疹、腮腺炎病毒 6 3 5bp、4 1 1bp、5 1 9bp的特异性核酸片段 ,MRT PCR 1次扩增灵敏度均可分别达到 1TCID50 。结论　该方法能特异、敏感地检测临床标本中麻疹、风疹、腮腺炎病毒 ,是快速诊断麻疹、风疹、腮腺炎病毒感染的理想方法     

乙型流行性感冒病毒的基因快速检测

〔目的〕建立乙型流行性感冒病毒的核酸快速诊断技术。〔方法〕采用RT -PCR方法对乙型流感病毒的HA基因进行检测 ,我们对乙型流感病毒的HA基因保守区域设计相关引物 ,进行扩增 ,并作了特异性与灵敏度比较。〔结果〕该引物只能扩增乙型流感病毒的特异性片段 ,而对其它型别的流感病毒以及麻疹、风疹、腮腺炎病毒无交叉反应。检测的灵敏度一次PCR可达 1TCID50 ,二次PCR反应可达 0 .1TCID50 。〔结论〕采用该方法从临床患者含漱液标本中的检出率 ,比采用MDCK细胞分离的阳性率更高 ,可达到迅速、正确地诊断乙型流感的实用目的。     

多重半套式聚合酶链反应在检测脑脊液病原菌中的应用

目的：建立多重半套式聚合酶链反应（PCR）快速检测脑脊液标本中常见的病原菌。方法：通过对病原菌16S rRNA基因保守区和变异区的序列分析，设计通过引物及革兰阴性菌、革兰阳性菌的特异性引物，分别作为外、内侧引物，对脑脊液标本中不同细菌的DNA进行多重半套式PCR扩增；同时与常规细菌培养法作比较，并检测了该方法的敏感性。结果：外侧扩增后革兰阳性菌、革兰阴性菌经扩增后均有长约1032bp的片段产生；内侧扩增两种细菌除1032bp的产物外，革兰阳性菌另有一336bp的特异性产物，革兰阴性菌另有一127bp的特异性产物。该方法最低可检测出8cfu/ml的大肠埃希菌；62份脑脊液标本扩增结果与培养法相比，敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预没值分别为93．8％、5．7％、88．2％、97．8％。结论：多重半套式PCR方法能特异、敏感、快速地检测出脑脊液感染的常见病原菌。     

用两种聚合酶链反应方法检测流感病毒

目的：建立特异敏感的快速检测流感病毒的分子生物学方法。方法：用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增甲1、甲3和乙型流感病毒的HA基因的HA1片段。根据扩增产物的大小检测流感病毒。结果：以流感病毒的H基因为模板设计的3对引物能特异性地扩增出942bp,1117bp和751bp的核酸片段，它们分别和甲1，甲3和乙型流感病毒有稳定对应的关系。根据扩增产物的大小可以检测流感病毒。用这个方法能检测病毒浓度为0．1TCID50的样品。结论：多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应是检测流感病毒的特异敏感的方法。     

多重PCR技术检测儿童急性呼吸道感染DNA病毒方法的建立与应用

目的建立多重PCR技术检测儿童急性呼吸道感染DNA病毒的方法,以便及时监测并快速诊断急性病毒性呼吸道感染。方法参照NCBI数据库病毒核酸序列设计多重PCR引物,优化反应条件,并对392份儿童呼吸道标本进行检测,验证多重PCR反应的敏感度及特异性。结果采用多重PCR引物对人博卡病毒(h BOV)、KI多瘤病毒(KI)、腺病毒(Ad V)、WU多瘤病毒(WUPy V)、人细小病毒B19(HPVB19)5种DNA病毒进行扩增,分别获得404、324、248、77、128 bp片段,均无非特异性扩增条带,与设计相符;392份儿童呼吸道标本多重PCR扩增出190阳性标本,阳性率为48.46%(190/392),6个月~3岁以内婴幼儿阳性率70.00%(112/160)为最高。结论本研究初步建立了应用多重PCR技术快速检测儿童呼吸道标本中DNA病毒敏感性、特异性好的方法,6个月~3岁以内婴幼儿检出率高。     

SYB GRreenⅠ实时PCR检测甲肝病毒方法的建立与初步应用

目的：建立一种快速、特异的SYBR GreenⅠ实时PCR方法检测甲肝病毒。方法：对SYBR GreenⅠ实时PCR检测甲肝病毒方法的反应条件、反应体系进行优化,同时与传统RT-PCR方法进行灵敏度比较,提高该方法的特异性、灵敏性。并用该方法对甲肝病毒毒株、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒（1～6型）毒株、贝类水产品标本进行检测。结果：SYBR GreenⅠ实时PCR与传统RT-PCR检测甲肝病毒方法的灵敏度无明显区别,但检测时间缩短了1/2。该方法能特异检测出甲肝病毒,不能扩增脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒（1～6型）毒株,对农贸市场40份贝类水产品进行甲肝病毒核酸检测,检出3份。结论：建立的SYBR GreenⅠ实时PCR方法用于甲肝病毒检测具有特异、灵敏、快速等优点,可用于甲肝的病原学监测。 基金 上海市医学重点学科建设项目（05Ⅲ029）     

多重逆转录-聚合酶链反应快速检测登革病毒及其临床应用

目的 建立登革1～4型病毒的多重逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)快速检测及分型方法。方法 参照登革1～4型病毒核酸序列设计多重RT-PCR引物，并检索国际基因序列数据库初步验证其特异性，随后对PCR反应条件进行优化，以同属于黄病毒科的黄热病毒、流行性乙型脑炎病毒为对照，验证其特异性。并对2003年30份临床疑似登革患者血清标本进行了检测，阳性片段克隆测序验证扩增片段特异性。结果 采用多重PCR引物对登革1～4型病毒进行扩增，分别获得295、237、118、347bp片段，与设计相符；而黄热病毒及流行性乙型脑炎病毒均无非特异性扩增条带，对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果，30份疑似患者血标本RT-PCR扩增阳性率为83．3％(25／30)，其核酸序列与登革1型病毒柬埔寨株以及中国1997、1999年流行株GD14／97、G1305／99同源性分别为97％、97％、98％。结论 实验证明，所建立的多重PCR方法能够快速地检测和鉴定登革1～4型病毒，为登革病毒的检测及分型提供了一种方便易行的方法。     

甲3型流行性感冒病毒基因的快速检测

为建立流行性感冒(流感)的快速诊断技术,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测甲3型流感病毒的血凝素(HA)基因.对甲3型流感病毒的HA基因保守区域设计相关引物并进行PCR扩增,比较了它的特异性与灵敏度.结果显示该引物只能扩增甲3型流感病毒的特异性片段,而对其它型别的流感病毒以及麻疹、风疹、流行性腮腺炎病毒无交叉反应.检测的灵敏度1次PCR可达10TCID50/50ml以下,2次PCR反应可达0.1TCID50/50ml以下.采用该方法从临床患者含漱液标本中的检出率,比采用狗肾传代细胞(MDCK)分离病毒的阳性率更高,可达到迅速、正确诊断甲3型流感的实用目的.     

TaqMan荧光定量RT—PCR快速检测西尼罗病毒的研究

目的建立特异、快速、灵敏的TaqMan实时荧光定量聚合酶链反应（TaqMan—based Real—timePCR）用于西尼罗病毒（WNV）核酸检测，为WNV的感染诊断和流行病学监测奠定技术基础。方法根据文献公开发表的WNV核酸检测引物和TaqMan探针，优选最佳引物探针。应用DNAWorks2．4在线软件设计8条寡核苷酸片段，基于PCR合成包含引物探针扩增区域的230个核苷酸作为WNV模拟核酸。并对TaqMan-based Real—timePCR条件进行优化，验证该方法的特异性、灵敏度。结果该方法对WNV核酸检测有高度特异性，与流行性乙型脑炎、登革热1～4型等虫媒病毒均无交叉反应，对构建的DNA检测灵敏度达100拷贝／反应。结论TaqMan—based Real—timePCR是一种快速检测WNV特异、敏感的方法，适用于WNV的早期感染诊断和流行病学监测。     

荧光定量PCR方法快速检测人博卡病毒的研究

目的建立特异、快速、灵敏的、用于人博卡病毒核酸检测的荧光定量PCR方法。方法对博卡病毒的ns1基因应用Clustal W软件进行序列同源性比对,在保守区设计特异性引物和TaqMan探针,并对荧光PCR反应条件进行优化,验证方法的特异性,并将该方法与国际上通用的针对人博卡病毒ns1基因和np基因的普通PCR方法进行灵敏度比对;同时将该方法应用于疑似患者临床标本检测。结果该方法针对ns1基因进行扩增,对人博卡病毒核酸检测有高度特异性,与副流感1、2、3型,甲型、乙型流感病毒,呼吸道合胞病毒,腺病毒,冠状病毒229E、OC43,偏肺病毒以及鼻病毒等均无交叉反应。检测的灵敏度均比国际上通用的扩增ns1基因及np基因的PCR方法高10倍。用该方法从144份急性上呼吸道感染患者咽拭标本中检出了2份博卡病毒阳性,从病毒核酸提取至检测完成仅需3 h左右;用普通PCR仅能检出1份阳性标本,且耗时需5 h左右。结论该研究建立的TaqMan荧光定量PCR是一种快速检测人博卡病毒特异、敏感的方法,适用于临床早期诊断。     

肠道病毒TaqMan荧光定量RT-PCR法快速检测

目的建立一种特异、灵敏、快速的荧光定量RT-PCR方法检测肠道病毒核酸,应用于暴发疫情的实验室应急检测。方法根据GenBank登录的肠道病毒基因序列,应用生物学软件进行序列比对,在肠道病毒基因的保守区设计特异性引物和TaqMan探针;对荧光RT-PCR反应条件进行优化,验证方法的特异性和灵敏度。同时对疑似肠道病毒感染者的临床样本进行检测。结果该方法对肠道病毒的检测有高度的特异性,可检出脊髓灰质炎、柯萨奇和埃可等肠道病毒,与腮腺炎、麻疹、风疹、乙型脑炎等病毒均无交叉反应。检测的灵敏度达0.1病毒效价滴定（TCID50）;可直接从疑似肠道病毒感染者的脑脊液、疱疹液和粪便等标本中检测肠道病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右。结论所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测肠道病毒特异、敏感的方法,适用于由肠道病毒感染引起的应急疫情的实验室早期诊断。     

TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR快速检测副流感3型病毒

目的:建立特异、快速、灵敏的荧光定量RT-PCR方法用于副流感3型病毒核酸检测。方法:对副流感3型病毒的N基因应用C lustalW软件进行序列同源性比对,在保守区设计特异性引物和TaqM an-MGB探针,并对荧光RT-PCR反应条件进行优化,验证方法的特异性,敏感性和稳定性,同时应用于疑似患者临床标本检测。结果:该方法对副流感3型病毒核酸检测有高度特异性,与副流感1、2、4型,甲型、乙型流感病毒,麻疹病毒,风疹病毒,腮腺炎病毒,呼吸道合胞病毒和腺病毒等均无交叉反应。检测的灵敏度达0.1TC ID50,可从疑似患者含漱液标本中直接检出,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右。结论:本研究建立的TaqM an荧光定量RT-PCR是一种快速检测副流感3型病毒特异、敏感的方法,适用于临床早期诊断。     

荧光定量逆转录-聚合酶链反应方法快速检测甲1型流行性感冒病毒核酸

目的建立特异、快速、敏感的TaqMan荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,用于检测甲1型流行性感冒(流感)病毒核酸.方法在甲1型流感病毒血凝素基因的保守区设计引物和TaqMan探针,对其进行筛选,同时对荧光定量RT-PCR反应条件和反应体系进行优化,验证该方法的特异性、敏感性、重复性,并对疑似流感患者含漱液标本进行检测.结果该方法对甲1型流感病毒的检测具有高度的特异性,对甲3型流感病毒、乙型流感病毒、禽流感病毒H5、严重急性呼吸道综合征病毒、麻疹病毒及其它呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.1TCID50.采用该方法从临床疑似患者含漱液中对甲1型流感病毒核酸的检出,比采用狗肾传代细胞进行病毒分离更为敏感.从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,操作简便,重复性好,且大大减少了常规RT-PCR检测产物的污染机会.结论新建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测甲1型流感病毒的特异、敏感的方法,非常适合于疑似流感爆发疫情的应急诊断和鉴别诊断.     

风疹病毒宫内感染的实验诊断研究

目的：建立准确、快速的风疹病毒内感染实验诊断方法。方法：将疫苗株病毒稀释后接种Vero细胞，收集不同时段培养上清液和细胞，RT-PCR法检测风疹病毒RNA（培养RT-PCR法）。用直接RT—PCR法和培养RT—PCR检测可疑风疹病毒感染的胎儿组织和羊水标本。结果：直接RT—PCR法可检测模拟羊水标本中15TCID50／ml风疹病毒RNA。培养RT—PCR法在10TCID50的病毒感染后6h的V细胞和感染后24h的培养上清液中检出风疹病毒RNA。直接RT—PCR法和培养RT—PCR法检测4例足月产胎儿羊水均阴性；1例引产胎儿羊水直接RT—PCR法阴性，培养RT—PCR法在接种细胞后24h检出风疹病毒RNA。结论：培养RT—PCR法是一个快速、特异、灵敏的实验室诊断风疹病毒宫内感染的方法。     

用RT-PCR方法直接检测麻疹病毒血凝糖蛋白(H)基因

目的 应用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）法直接从临床麻疹患者的咽拭子及尿液中检出570bp的特异性H基因目的条带。方法 采集临床确诊为麻疹商例的咽拭子、尿液提取RNA，用RT－PCR方法扩增麻疹病毒血凝糖蛋白的570bp核苷酸片段。结果 22例病人的20份咽拭子样品中，均检测到相应条带，20份尿液中有18份检测到相应条带；采用RT－PCR一次扩增的产物，检测灵敏度即达到0.001 TCID50。结论 麻疹病人唾液样本的RT－PCR阳性率高于尿液，该方法可用于麻疹的病原学的快速辅助诊断，特别是对出疹初期就诊的临床符合，但麻疹IgM阴性的病例可进行进一步确诊。     

荧光定量RT-PCR快速检测乙型流感病毒核酸

目的建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RT-PCR方法用于检测乙型流感病毒核酸.方法根据GenBank登录的流感毒株序列,应用生物学软件进行序列比对,在乙型流感病毒核蛋白(NP)基因的保守区设计引物和TaqMan探针进行筛选,对荧光定量RT-PCR反应条件进行优化,检测该方法的特异性和灵敏度.此外还对疑似乙型流感含漱液标本进行检测.结果该方法对乙型流感病毒的检测有高度的特异性,对甲1型、甲3型、禽流感病毒H5、SARS病毒及其他呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.01 TCID50,可从疑似流感患者含漱液中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右.结论本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测乙型流感病毒特异、敏感的新方法.     

多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应快速检出含漱液中的乙型流感病毒

目的 建立特异敏感的快速检测含漱液中的流感病毒的分子生物学方法。方法 用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增甲1、甲3和乙型流感病毒HA基因的HA1片段,得到各病毒与特异性大小的扩增产物的对应关系。用同样的方法扩增含漱液中流感病毒的HA基因的HA1片段。根据这对应关系检测含漱液中的流感病毒。结果 以流感病毒的HA基因为模板设计的三对引物,用多重逆转聚合酶链反应能特异性地扩增出942bp、1117bp和751bp的核酸片段,它们分别和甲1、甲3和乙型流感病毒有稳定对应关系。用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增含漱液中流感病毒HA基因的HA1片段,根据扩增产物的大小检出含漱液中的乙型流感疾病。结论 多重逆转聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应能特异敏感地检出含漱液中的乙型流感病毒。