抗A型肉毒毒素鼠源性单克隆抗体的制备和鉴定

目的：制备与鉴定抗A型肉毒神经毒素重链C端（ heavy chain of botulinum neurotoxin serotype A, BoNT／AHc）特异性鼠单克隆抗体。方法通过纯化BoNT／AHc抗原、免疫BALB／c小鼠并建立杂交瘤细胞以制备鼠单抗,用ELISA、Western印迹实验和抗体分型试剂盒进行分析鉴定,并通过ELISA检测鼠单抗与BoNT／AHc突变体结合,初步鉴定其在BoNT／AHc的结合表位。结果得到纯度较高的BoNT／AHc抗原,制备了4株特异性鼠单抗1A4、3H3、3H7、5H8。间接ELISA结果显示,单抗细胞上清效价均＞3．0×103;Western印迹检测结果显示,单抗均能与BoNT／AHc特异性结合;抗体亚型鉴定结果为1A4、3H7属于IgG1（Κ）,3H3属于IgM（Κ）,而5H8属于IgG2b （Κ）;叠加ELISA实验表明,4株单抗抗原识别表位相近;用ELISA检测单抗与BoNT／AHc突变体结合实验结果初步确定了4株单抗与BoNT／AHc的结合表位。结论对抗A型肉毒毒素鼠源性抗体完成了制备和鉴定,为肉毒毒素中和抗体的开发与阐明中和抗体的表位奠定了基础。     

肉毒毒素

肉毒毒素毒力极强,一般分为7种类型,各型分子结构基本一致,但他们的抗原性和免疫原性及其毒性作用机制则不同。本文对肉毒毒素作用的临床效应包括肌肉化学性去神经支配效应、自主神经系统效应、镇痛效应作了详细阐述。对肉毒毒素的作用机制及转归也作了介绍。     

A型肉毒毒素的临床应用

肉毒杆菌毒素(botulinumtoxin ,BT)早在1897年被发现,194 6年SchantzEJ提纯出A型肉毒毒素(BTA)结晶。1973年,ScottAB首先报告了BTA对猴眼外肌有麻痹作用,引起医学界重视,许多学者开始致力于BTA动物实验及临床方面的研究,成果显著,1989年被美国食品与药品管理局(FDA)批准用于临床。大量研究结果证实,BTA的临床应用越来越广泛,对不少疾病疗效肯定,对某些疾病的疗效尚在探索之中。本文就近年来BTA的临床应用进展作一总结。1　概述肉毒杆菌毒素(BT)是由革兰氏阳性厌氧肉毒杆菌(Clostridiumbotulinum)产生的一种神经毒素,分A、B、C…     

肉毒毒素的临床应用及抵抗的产生

肉毒毒素（ＢＯＴＯＸ）最早用于治疗斜视,后治疗眼睑和面肌痉挛,疗效较好。治疗病例逐年增加,对其研究也逐步深入,本文就作用机理、临床应用、剂量及疗效等方面的进展进行综述。１　作用机理ＢＯＴＯＸ是肉毒梭状杆菌在生长繁殖过程中产生的一种外毒素,属于高分子蛋白神经毒素。ＢＯＴＯＸ注射于肌肉内后,迅速而有力地与突触前胆碱能神经终板结合,减少周围运动神经末梢和神经肌肉接头处乙酰胆碱的释放,抑制细胞外乙酰胆碱,造成肌肉松弛和麻痹。它不影响神经或肌肉的电刺激感应性或传导性。注射后几小时即可见到终板电位麻痹,但临…     

分泌抗人IgA单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立与鉴定

利用常规杂交瘤技术制备了一株抗人IgA杂交瘤PA_(229) ELISA结果表明,它分泌的抗体与人IgA有特异性反应,而与其它免疫球蛋白重、轻链无交叉反应,为小鼠IgG_1亚类。免疫转印结果只显示针对IgAα链的一条电泳带。用改良ELISA法测得PA_(229)的亲和常数为1.33×10~8L/mol。     

一起A型肉毒毒素中毒的调查报告

1996年1月6日我院收治同一单位同时发病的4名患者,次日又送来3名患者,追问病史及食物检测诊断为A型肉毒毒素中毒,经治疗全部痊愈出院,报告如下.1 临床资料     

抗A型肉毒类毒素单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及其初步应用

以A型类毒素免疫BALB/C小鼠,取其脾脏与SP_2/O骨髓瘤细胞融合,获得8个阳性克隆,经克隆化和用ELISA法筛选、鉴定,得到两株(H_6,E_1)分泌型特异McAb的杂交瘤细胞系。5次克隆化后阳性率均达100％,并制备了培养上清液及免疫腹水。     

B型肉毒毒素轻链荧光表达细胞模型的构建及应用

目的 构建B型肉毒毒素轻链（BoNT/B,BLC）荧光表达细胞模型,并用于小分子化合物效应评价。方法 将BLC基因导入荧光表达载体pEGFP-N1中,构建重组质粒,并将其转染至神经细胞系Neuro-2a细胞中进行表达,通过荧光显微镜观察细胞内BLC-EGFP蛋白荧光表达水平,利用Western印迹法检测细胞中BLC-EGFP的酶切活性和稳定性,进一步利用该模型评价SRC激酶抑制剂KX2-391对BLC-EGFP蛋白胞内稳定性的影响。结果 成功构建重组表达质粒pEGFP-N1-BLC。质粒转染后,BCL-EGFP蛋白在Neuro-2a细胞中的表达水平随时间逐渐增加并具有酶切胞内底物囊泡相关蛋白-2(VAMP-2)的活性;质粒转染12 h后加入CHX终止蛋白合成,BLC-EGFP的胞内水平在72 h内无显著变化;加入KX2-391作用24 h后,可显著促进BLC-EGFP蛋白的胞内降解。结论 成功建立B型肉毒毒素轻链荧光表达细胞模型,为后续B型肉毒毒素轻链胞内持留机制研究和胞内解毒剂筛选提供了技术储备。     

抗T-2毒素单克隆抗体的制备及特性

目的 :建立敏感、特异和快速的针对T 2毒素的ELISA检测方法 ,形成具有我国自主知识产权的快速检测试剂盒。方法 :利用B细胞杂交瘤技术 ,建立抗T 2毒素的单克隆杂交瘤细胞株。结果 :用T 2 羊免疫球蛋白 (T 2 GIgG)偶联物免疫 8～ 10周龄雌性BALB/c小鼠后 ,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp2 /0融合 ,经过 3～ 4次亚克隆建立了 2个稳定分泌抗T 2毒素抗体的杂交瘤细胞株 ,分别命名为 2A7和 6E4。将上述 2株杂交瘤细胞分别注入BALB/c小鼠腹腔 ,获得含抗T 2毒素单克隆抗体的腹水 ,并将腹水用饱和硫酸铵法进行纯化 ,得到 2A7和 6E4单克隆抗体。两株单克隆抗体的Ig亚类为IgG1,腹水中抗体的滴度分别为 6 .4× 10 6和 1.1× 10 7,参考工作浓度分别为1.0× 10 6和 3.2× 10 6。纯化后 2A7抗体的IgG含量为 16 .4g/L ,亲和常数为 8× 10 -8mol/L。 2A7抗体与其他结构类似物无交叉反应 ,具有较高的特异性。结论 :制备了具有高特异性和亲和力的抗T 2毒素单克隆抗体 ,初步建立了针对T 2毒素的ELISA检测方法。     

肉毒毒素中毒的急救与防护

肉毒毒素的基本特性肉毒毒素是由厌氧性梭状芽孢菌产生的,有7个血清型(A、B、C1、C2、D、E、F),属于神经毒。肉毒毒素中毒的症状为神经肌肉麻痹,致使呼吸衰竭,直至死亡。在7种血清型肉毒毒素中,A型肉毒毒素对人类的毒性最大,被认为是最危险的一种毒素。肉毒杆菌毒素A的吸入致死剂量为每人0.3微克,口服致死剂量为每人2微克,其毒性比化学毒剂中VX和沙林毒气分别强1.5万倍和1万倍,其分子质量约为15万道尔顿的蛋白质。     

A型肉毒毒素治疗慢性头痛的临床研究

目的：探讨慢性每日头痛采取A型肉毒毒素治疗的疗效。方法选取80例收治的CDH患者,根据治疗方式将入选的CDH患者分为对照组与实验组,分别给予醋酸泼尼松龙＋2％利多卡因治疗和A型肉毒毒素注射治疗,观察两组疗效。结果对照组临床有效率显著低于实验组（ P＜0．05）;在疼痛程度上,两组治疗30 d后,均显著降低（ P＜0．05）,对照组至90 d时又显著上升,至90 d时显著高于实验组（ P＜0．05）;在疼痛发作天数上,实验组在治疗30 d、90 d后均显著低于疗前（ P＜0．05）,而对照组仅30 d时与疗前比较差异性（ P＜0．05）,各时间段组间比较有差异性（ P＜0．05）。结论慢性每日疼痛采取A型肉毒毒素治疗,疗效显著,且作用更为持久,安全性可靠,具有借鉴价值。     

A型肉毒毒素治疗眼睑痉挛的临床观察

目的观察A型肉毒毒素治疗眼睑痉挛的疗效。方法对40例眼睑痉挛患者进行局部多点注射A型肉毒毒素,评价其疗效。结果40例患者中,32例完全缓解(80%、),6例明显缓解(15%),2例部分缓解(5%),总有效率达100%。药物持续时间为2.5-6个月,无全身不良反应及过敏反应,局部反应轻微,短暂可逆。结论A型肉毒毒素局部注射治疗眼睑痉挛是一种安全、有效、简便、易行的方法。     

抗A型肉毒毒素卵黄抗体的制备、纯化及活性检测

目的：制备特异性的抗A型肉毒毒素（ BoNT/A）的卵黄抗体（ IgY）并分析抗体的生物活性。方法人工合成密码子优化BoNT/A重链碳端蛋白（ AHc）基因片段,并构建含有该目的片段的重组表达质粒pTIG-Trx-AHc。诱导表达的AHc蛋白经纯化定量后免疫健康母鸡,4次免疫后通过水稀释和硫酸铵盐析法从鸡蛋中提取特异性IgY。在小鼠模型中测定纯化后IgY的中和能力。结果和结论 AHc蛋白在大肠杆菌中获得了可溶性表达,占菌体裂解液上清的20％。纯化后的IgY纯度较高,效价超过1∶100000。小鼠体内中和实验证实,IgY可完全中和20 LD50 A型天然肉毒毒素,在预防和治疗肉毒中毒表现出良好的应用前景。     

分泌抗HBe单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及初步鉴定

HBeAg与HBcAg是乙型肝炎特有的两类抗原性不同的抗原,但均由同一基因区所编码。我们采用内切酶定位剪切及简易快速克隆的方法,选择了仅N末端3个氨基酸编码子差别的PMM2166和PMM2066作了系统比较,获得HBeAg在大肠杆菌中高效表达。将基因工程菌制备的HBeAg(下称基因HBeAg)用十二烷基磺酸钠(SDS)和2巯基乙醇(2-ME)处理后常规免疫BALB/c小鼠。取小鼠脾细胞与同系小鼠SP2/O骨髓瘤细胞融合,选用两种不同的酶免疫试验进行筛选,结果共获16个分泌HBe单克     

产生抗HLA-A.B.C抗原的单克隆抗体

受人主要组织相容复合物基因所编码的HLA-A.B.C抗原在免疫反应中起有重要作用,它不仅决定着对移植物的排斥反应,也作为T杀伤细胞所识别的靶抗原。在许多疾病状态下,也有一定的作用。由于杂交瘤技术的产生,为研究细胞表面抗原提供了一种强有力的手段。近年来,抗HLA-A.B.C单态及多态型抗原的单克隆抗体不断问世,这些抗体的发现大大促进了对HLA-A.B.C抗原结构及功能的研究。本文报导用杂交瘤方法所建立的一个分泌抗HLA-A.B.C抗原的杂交瘤细胞株S-103。     

A型肉毒毒素在瘢痕治疗中的研究进展

A型肉毒毒素是由肉毒杆菌分泌的高分子蛋白神经毒素,可通过抑制乙酰胆碱释放而松弛肌肉,常被用于解除肌肉痉挛、除皱美容等神经疾病治疗及皮肤美容领域。近年来研究证实,A型肉毒毒素能够通过抑制瘢痕组织内成纤维细胞增殖、促进瘢痕组织内胶原纤维降解、降低转化生长因子β活性及创面周围组织张力达到促进瘢痕消退、减轻瘢痕瘙痒及疼痛、预防瘢痕复发等目的,被广泛应用于增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的治疗。鉴于此,本研究对A型肉毒毒素治疗瘢痕的研究进展进行了综述,以期为A型肉毒毒素的临床治疗提供帮助。     

肉毒毒素防治药物的研究进展

肉毒毒素是目前已知毒性最强的蛋白质,可以引发严重的突发公共卫生事件,也是重要的生物战剂和生物恐怖剂,因此迫切需要研制医学防治药物以应对其威胁。本文概述了国内外在肉毒毒素预防性疫苗和治疗性中和抗体防治药物研发进展,同时分析了肉毒毒素防治药物的新趋势和今后的主要发展方向。