黄芪甲苷对异丙肾上腺素诱导的肥大HL-1心肌细胞维生素D受体mRNA表达的影响

目的探讨黄芪甲苷对异丙肾上腺素诱导HL-1心肌细胞活性及维生素D受体mRNA相对表达量的影响。方法用异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)10μmol·L~(-1)诱导HL-1心肌细胞损伤的模型,随机分为5组:正常组,模型组,模型组+黄芪甲苷(3μmol·L~(-1))(即黄芪甲苷低剂量组),模型组+黄芪甲苷(10μmol·L~(-1))(即黄芪甲苷中剂量组),模型组+黄芪甲苷(30μmol·L~(-1))(即黄芪甲苷高剂量组)。运用MTT法检测心肌细胞的存活率。RT-PCR检测维生素D受体mRNA的相对表达量。结果 ISO处理HL-1心肌细胞,不同浓度的黄芪甲苷可提高心肌细胞的活性,且黄芪甲苷的浓度在30μmol·L~(-1)时,保护作用最好。RT-PCR检测结果显示,不同剂量的黄芪甲苷VDR基因相对表达量与模型组相比,其表达明显下调(P0.05)。结论黄芪甲苷对HL-1心肌细胞损伤具有保护作用,其机制可能通过维生素D轴调节VDR基因表达水平有关。     

川芎嗪与黄芪甲苷配伍对过氧化氢诱导人脐静脉内皮细胞氧化损伤的保护作用及机制

目的研究川芎嗪、黄芪甲苷及二者不同浓度配伍对过氧化氢(H_2O_2)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)氧化损伤模型的保护作用及机制。方法建立H2O2诱导HUVECs损伤模型,将细胞分为17组:空白对照组,模型组(H_2O_20.2 mmol·L~(-1))、川芎嗪低、中、高(40,80,160μg·m L~(-1))剂量组,黄芪甲苷低、中、高(10,20,40μg·m L~(-1))剂量组,川芎嗪+黄芪甲苷两两配伍组。噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度川芎嗪、黄芪甲苷及其配伍对氧化损伤HUVECs增殖的影响,筛选出最佳配伍比例。检测最佳配伍组丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率,Western Blot检测p-Akt/Akt蛋白的表达,RT-PCR检测Akt m RNA的表达。结果与模型组相比,川芎嗪中剂量组、黄芪甲苷各剂量组及其配伍组均能不同程度提高细胞存活率(P0.05,P0.01,P0.001),且川芎嗪(80μg·m L~(-1))+黄芪甲苷(40μg·m L~(-1))剂量组细胞存活率最高,选为最佳配伍组;川芎嗪(80μg·m L~(-1))+黄芪甲苷(40μg·m L~(-1))剂量组能降低细胞MDA含量(P0.001),提高细胞SOD活力(P0.001),降低细胞凋亡率(P0.01),上调p-Akt/Akt蛋白及Akt基因m RNA的表达(P0.001)。结论川芎嗪(80μg·m L~(-1))+黄芪甲苷(40μg·m L~(-1))剂量组对H_2O_2诱导的HUVECs氧化损伤有保护作用,能缓解氧化应激诱导的HUVECs凋亡,其机制与PI3K/Akt信号通路有关。     

黄芪甲苷对异丙肾上腺素诱导的H9C2心肌细胞维生素D受体mRNA表达的影响

目的:探讨黄芪甲苷对异丙肾上腺素诱导的H9C2心肌细胞损伤模型存活率及维生素D受体mRNA表达的影响。方法:取正常生长的细胞,用80μmol·L~(-1)的异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)诱导H9C2心肌细胞肥大的模型,并随机分为5组:正常组,模型组,模型组+黄芪甲苷(10μmol·L~(-1))组,模型组+黄芪甲苷(30μmol·L~(-1))组,模型组+黄芪甲苷(60μmol·L~(-1))组。运用MTT法检测心肌细胞的存活率,Real-Time PCR法检测各组H9C2心肌细胞维生素D受体mRNA的表达量。结果:MTT法显示使用异丙肾上腺素会诱导H9C2心肌细胞损伤,而不同剂量的黄芪甲苷可提高心肌细胞的活性,且黄芪甲苷的浓度在30μmol·L~(-1)时,细胞存活率最高。Real-Time PCR检测结果显示,不同剂量的黄芪甲苷对异丙肾上腺素诱导的肥大H9C2心肌细胞维生素D受体mRNA相对表达量与模型组相比,其表达均明显上调(P0.05)。结论:黄芪甲苷对H9C2心肌细胞损伤具有保护作用,其机制可能与其通过维生素D轴调节VDR基因表达水平有关。     

黄芪甲苷对肥大心肌细胞表面积及维生素D轴相关基因表达的影响

目的研究黄芪甲苷对肥大心肌细胞表面积及维生素D轴相关基因表达的影响,从而探讨黄芪甲苷保护心脏的作用机制。方法取大鼠的H9C2心肌细胞进行常规培养,使用异丙肾上腺素(ISO)干预24h造模。待心肌肥大模型建立后,随机分为6组:正常组、模型组、模型组+维生素D组(10-8mmol·L~(-1))、模型组+黄芪甲苷10μmol·L~(-1)组,模型组+黄芪甲苷30μmol·L~(-1)组,模型组+黄芪甲苷60μmo l·L~(-1)组。MTT法检测各组心肌细胞的存活率,通过软件检测各组心肌细胞的表面积,RT-PCR法检测与维生素D轴相关基因(CYP24A、CYP27B、VDR)的相对表达量。结果 MTT检测结果表明,ISO会导致心肌细胞的存活率大大下降,而加入了维生素D和黄芪甲苷后存活率则明显上升。通过对细胞表面积的检测表明,黄芪甲苷和维生素D能够不同程度的减轻由ISO诱导的心肌细胞肥大。RT-PCR检测结果表明,维生素D和黄芪甲苷能够提高维生素D轴相关基因的表达量,而ISO则会导致其表达量降低。结论黄芪甲苷能够减轻心肌细胞的损伤,保护心肌细胞,而其机制可能与黄芪甲苷对维生素D轴的调节作用有关。     

黄芪甲苷对脂多糖诱导人胃黏膜上皮细胞GES-1的抗炎作用及机制研究

目的研究黄芪甲苷对脂多糖(LPS)诱导的人胃黏膜上皮细胞GES-1的抗炎作用及有关机制。方法采用LPS不同浓度(0.25、0.5、1、1.5、2μg·mL~(-1))及时间(15、30、45、60、120 min)诱导GES-1细胞炎症反应,筛选LPS诱导的合适浓度、时间。将GES-1细胞分为空白对照组、模型组及黄芪甲苷0.1、1、10μg·mL~(-1)浓度组;黄芪甲苷预处理2 h后,以筛选出的LPS浓度、时间诱导GES-1细胞。采用MTS法检测细胞存活率;采用ELISA法检测细胞上清液中白细胞介素6(IL-6)的含量;采用RT-qPCR法检测细胞诱导型一氧化氮合酶(i NOS)、环氧合酶2(COX-2)mRNA的表达;采用Western Blot法检测细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路相关蛋白(Erk、Jnk/SAPK、P38 MAPK)的磷酸化水平。结果选择0.25μg·mL~(-1)及30 min作为LPS诱导GES-1细胞炎症模型的浓度及时间。黄芪甲苷浓度≤100μg·mL~(-1)时对GES-1细胞存活率无明显影响。与空白对照组比较,模型组细胞的炎症因子IL-6水平明显升高(P0.01),iNOS、COX-2 mRNA表达水平明显升高(P0.01),p-P38、p-Jnk、p-Erk蛋白表达明显上调(P0.001)。与模型组比较,0.1、1、10μg·mL~(-1)不同浓度黄芪甲苷组的细胞IL-6水平均明显降低(P0.01),iNOS及COX-2(10μg·mL~(-1)浓度组)mRNA表达均明显下调(P0.01),p-P38(1、10μg·mL~(-1)浓度组)及p-Jnk(0.1、10μg·mL~(-1)浓度组)、p-Erk(0.1、10μg·mL~(-1)浓度组)蛋白表达均明显下调(P0.05,P0.01,P0.001)。结论黄芪甲苷可能通过抑制MAPK信号通路的激活来抑制LPS诱导的GES-1细胞炎症相关因子产生,从而发挥抗炎作用。     

紫花牡荆素与EGCG联合应用对肺腺癌A549细胞的增殖抑制及凋亡作用

目的:研究紫花牡荆素(casticin,CAS)与表没食子儿茶素没食子酸酯[(-)-Epigallocatechin gallate,EGCG]联合用药对肺腺癌A549细胞的增殖抑制及诱导凋亡作用。方法:培养肺腺癌A549细胞,取对数生长期细胞活性95%的细胞进行实验。SRB法考察CAS(0.5,1,5,10,15,20μmoL·L~(-1))联合EGCG(1,5,10,15,20,25μmoL·L~(-1))对A549细胞的增殖抑制作用;激光共聚焦显微镜观察CAS+EGCG联合用药在A549细胞中的分布行为;流式细胞仪检测CAS+EGCG联合用药对A549细胞的凋亡作用;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测CAS+EGCG用药对A549细胞中B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达的干预作用。结果:不同浓度各药物在24,48 h对肺腺癌A549细胞增殖的抑制率比较,差异有统计学意义(P0.05);各浓度CAS+EGCG用药对肺腺癌A549细胞增殖的抑制率均高于同浓度CAS或EGCG单独用药(P0.05)。培养至24 h时,5μmoL·L~(-1)CAS与10μmoL·L~(-1)EGCG联合用药对肺腺癌A549细胞的增殖抑制率呈协同作用。培养至48 h时,0.5μmoL·L~(-1)CAS与1μmoL·L~(-1)EGCG,1μmoL·L~(-1)CAS与5μmoL·L~(-1)EGCG,15μmoL·L~(-1)CAS与20μmoL·L~(-1)EGCG,20μmoL·L~(-1)CAS与25μmoL·L~(-1)EGCG联合用药对肺腺癌A549细胞的增殖抑制率呈相加作用;通过激光共聚焦显微镜观察,CAS(5μmoL·L~(-1))联合EGCG(10μmoL·L~(-1))组进入A549细胞的数量高于同浓度CAS或EGCG单独用药。流式细胞仪检测表明,给药后将细胞培养至24 h时,各浓度CAS+EGCG用药对肺腺癌A549细胞凋亡率高于相同CAS或EGCG浓度下单独用药(P0.05)。Western blot检测显示,与单用药组相比,CAS+EGCG联合用药可增强Bax蛋白的表达量以及减少Bcl-2蛋白的表达量(P0.01)。结论:与单用药相比,CAS+EGCG联合用药能够显著增强对A549细胞抑制及诱导凋亡作用,且诱导凋亡作用机制与Bcl-2和Bax蛋白相关。     

白藜芦醇苷对人类乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响及其机制

目的:研究白藜芦醇苷(polydatin)在体外对乳腺癌细胞MCF-7增殖的作用,进一步探索其潜在的机制。方法:设定空白组及白藜芦醇苷(0.2,0.4,1.2,2.0,2.8 mg·L~(-1))组,5-氟尿嘧啶组,采用噻唑蓝(MTT)比色法测定不同质量浓度白藜芦醇苷对MCF-7细胞的生长抑制率;应用细胞克隆集落形成实验验证白藜芦醇苷对MCF-7细胞增殖的抑制作用;通过实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测5-氟尿嘧啶(1.0μg·L~(-1))和白藜芦醇苷(0.2,0.4,1.2 mg·L~(-1))对DNA聚合酶δ催化亚基P125(P125),P125编码基因(POLD1),p53基因(p53),细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子p21 mRNA表达水平的影响;应用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测白藜芦醇苷(0.2,0.4,1.2 mg·L~(-1))对P125,p53,p21蛋白表达水平的影响。结果:与空白组比较,白藜芦醇苷(0.2,0.4,1.2,2.0,2.8 mg·L~(-1))在体外对MCF-7细胞具有明显的抑制作用(P0.05,P0.01),并且这种抑制作用呈浓度依赖性。与空白组比较,白藜芦醇苷(0.2,0.4,1.2 mg·L~(-1))均能明显抑制细胞集落的形成(P0.05,P0.01)。与空白组比较,5-氟尿嘧啶组和白藜芦醇苷(0.4,1.2 mg·L~(-1))能够显著抑制POLD1 mRNA表达水平,同时显著抑制P125 mRNA和蛋白表达水平,明显升高p53,p21 mRNA和蛋白表达水平(P0.05,P0.01)。与5-氟尿嘧啶组比较,白藜芦醇苷(1.2 mg·L~(-1))对POLD1,P125,p53,p21 mRNA和蛋白表达水平影响均无显著差异。结论:白藜芦醇苷在体外能够显著抑制MCF-7细胞的增殖,其潜在机制可能与提高p53表达水平,抑制POLD1表达,促进p21表达有关。     

苦杏仁苷对脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型的影响

目的研究苦杏仁苷(Amygdalin)体外对脂多糖(LPS)诱导的小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7炎症模型的影响。方法采用MTT法检测苦杏仁苷对RAW264.7细胞及其LPS(0.5μg·m L~(-1))诱导后增殖作用的影响;q RTPCR法检测RAW264.7细胞炎症模型的炎症因子IL-17A、IL-23以及趋化因子CCL2、CCL5的m RNA表达;Western Blot法检测胞浆和胞核NF-κB p65以及p38、p-p38的蛋白表达。结果与正常对照组比较,苦杏仁苷在6.25~200μmol·L~(-1)浓度范围对RAW264.7细胞生长没有明显影响(P0.05),而400μmol·L~(-1)可导致RAW264.7细胞活力明显下降(P0.001)。与正常对照组比,LPS作用后RAW264.7细胞活力下降,细胞增殖受到抑制(P0.05);LPS刺激3h后可诱导RAW264.7细胞炎症因子IL-17A、IL-23以及趋化因子CCL2、CCL5 m RNA表达显著上升(P0.05,P0.01);LPS作用1h后可引起RAW264.7细胞的胞核NF-κB p65表达明显上调,胞浆NF-κB p65表达下调,胞核与胞浆比值明显上调(P0.05),p-p38蛋白表达也显著上升(P0.001)。与模型组比较,5μmol·L~(-1)苦杏仁苷对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型未见明显变化(P0.05),而20,50μmol·L~(-1)苦杏仁苷作用后细胞增殖抑制状态恢复(P0.05,P0.01);苦杏仁苷(50μmol·L~(-1))提前干预后,IL-17A、IL-23、CCL2及CCL5 m RNA表达均显著下降(P0.01,P0.001);RAW264.7细胞NF-κB p65的胞核与胞浆比值明显下调,p-p38蛋白表达也显著下调,差异均有统计学意义(P0.05,P0.01)。结论苦杏仁苷对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7炎症模型的干预作用可能与抑制炎症因子IL-17A、IL-23以及趋化因子CCL2、CCL5的表达,抑制NF-κB、p38MAPK信号通路的过度激活有关。     

桂皮醛对LPS诱导的Raw264.7巨噬细胞迁移和M1极化的抑制作用研究

目的研究桂皮醛对脂多糖(LPS)诱导的Raw264.7巨噬细胞迁移和M1极化的抑制作用。方法培养Raw264.7巨噬细胞,随机分为空白对照组(不加LPS及药物)、LPS组(加入终浓度为20μg·L~(-1)的LPS)、桂皮醛(0.1μmol·L~(-1),0.3μmol·L~(-1))组。应用Transwell小室法观察桂皮醛对LPS诱导的巨噬细胞迁移的影响;应用流式细胞术观察桂皮醛对LPS诱导的巨噬细胞M1极化的影响。结果 Transwell小室迁移实验结果与流式细胞术检测结果均显示,LPS(20 ug·L~(-1))可明显促进RAW264.7巨噬细胞的迁移及M1极化(P0.01);与LPS组比较,桂皮醛0.1μmol·L~(-1)组、桂皮醛0.3μmol·L~(-1)组可明显抑制LPS诱导的Raw64.7巨噬细胞的迁移和M1极化(P0.01),且桂皮醛0.3μmol·L~(-1)组作用优于桂皮醛0.1μmol·L~(-1)组(P0.05)。结论桂皮醛对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞的迁移和M1极化有明显抑制作用,且呈浓度依赖性。     

鹿衔草黄酮苷对大鼠离体胸主动脉的作用及机制探讨

目的 探讨鹿衔草黄酮苷对大鼠离体胸主动脉的作用及其可能的作用机制.方法 采用离体血管实验方法,经生物信号采集与分析系统测定血管环张力的变化;激光扫描共聚焦显微镜技术检测血管平滑肌细胞内钙浓度.结果鹿衔草黄酮苷(20 mg·L~(-1))能够浓度依赖性的降低大鼠离体胸主动脉血管环张力.分别能减小苯肾上腺素(PE) (10~(-6) mmol·L~(-1))和KCl(60 mmol/L)对血管环的收缩幅度,最大舒张幅度分别为(102.7±1.6)%(P﹤0.01)和(39.6±1.6)%(P﹤0.01).此舒张作用不能被一氧化氮合酶抑制剂左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME 300 mmol·L~(-1))、鸟苷酸环化酶抑制剂亚甲蓝(MB 10~-5mmol·L~(-1))、环氧酶抑制剂吲哚美辛(Indo 10~-5mmol·L~(-1) )、ATP依赖性钾通道阻断剂格列苯脲(Gli 10~(-6) mmol·L~(-1) )、Ca~(2+)依赖性钾通道阻断剂四乙基铵(TEA 10~(-6) mmol·L~(-1))所阻断.但可以被瞬时外向钾电流阻断剂氯化钡(BaCl_2 10~(-6) mmol·L~(-1) )和钾通道阻断剂4-氨基吡啶(4-AP 1 mmol·L~(-1))阻断.在无钙灌流液中,用HPFG(2 mg·ml~(-1))孵育10 min可使CaCl_2的量效曲线下移且使PE的最大收缩幅度降低(P﹤0.01).激光扫描共聚焦检测细胞内钙的结果表明,鹿衔草黄酮苷浓度依赖性(1 ,2 g·L~(-1))地抑制了静息状态平滑肌细胞胞浆内钙浓度的升高.结论 鹿衔草黄酮苷能够浓度依赖性舒张大鼠胸主动脉,其作用机制可能是开放瞬时外向钾通道,抑制细胞内钙离子释放和细胞外钙离子内流,但并不影响一氧化氮的释放和前列环素的生成.     

黄芩苷对HT-29细胞炎症模型PI3K/NF-κB信号通路的影响及机制探讨

目的:观察黄芩苷对人结肠癌上皮细胞株HT~(-2)9的炎症模型中磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Akt)/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路的影响,并探讨其机制。方法:以肿瘤坏死因子(TNF)-α及脂多糖(LPS)共同诱导HT~(-2)9细胞,建立细胞炎症模型。实验分为6组,空白组加入完全培养基孵育,实验过程中不予任何药物干预,模型组给予h TNF(20μg·L~(~(-1)))黄芩苷孵育12 h后,再给LPS(1 mg·L~(~(-1)))孵育15 h;柳氮磺胺吡啶组在模型组的基础上,加入柳氮磺胺吡啶(SASP,500μmol·L~(~(-1)));黄芩苷组在模型组基础上给予不同剂量(1,10,100μg·L~(~(-1)))黄芩苷孵育24 h。噻唑蓝(MTT)法检测黄芩苷(1,10,100μg·L~(~(-1)))对细胞生长的影响;免疫印迹(Western blot)法检测黄芩苷(1,10,100μg·L~(~(-1)))对PI3K,Akt,NF-κB等蛋白表达,酶联免疫吸附(ELISA)法检测黄芩苷(1,10,100μg·L~(~(-1)))对细胞上清中TNF-α,白细胞介素(IL)-6等含量的影响。结果:与模型组比较,黄芩苷组、柳氮磺胺吡啶组的细胞上清液中TNF-α,IL-6,IL-8,IL~(~(-1))分泌量明显减少(P0.05),且两药联合应用对TNF-α,IL-6,IL-8,IL~(~(-1))分泌量的减弱效应更强(P0.01)。与模型组比较,黄芩苷组(1,10,100μg·L~(~(-1))),柳氮磺胺吡啶组(500μmol·L~(~(-1)))中的PI3K蛋白磷酸化水平,Akt磷酸化水平,NF-κB活化入核水平,环氧化酶~(-2)(Cox~(-2))蛋白,β-连环蛋白(β-catenin)蛋白,天冬氨酸蛋白水解酶-9(Caspase-9)蛋白,人凋亡相关因子配体(Fas L)蛋白表达均明显减少(P0.05)。结论:黄芩苷能减轻HT~(-2)9细胞炎症反应,抑制PI3K磷酸化,下调Akt的活化,抑制NF-κB的活化入核,从而抑制TNF-α,IL-6等炎症因子的分泌,发挥其抗炎效应,提示黄芩苷可能通过以抑制Akt的活化,抑制NF-κB的核转位,发挥其抗炎作用。     

补阳还五汤对LPS诱导巨噬细胞活化与自噬的影响

目的:探讨磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/m TOR)信号通路在补阳还五汤抗脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞活化与自噬中的作用。方法:细胞增殖毒性检测(CCK-8)法筛选诱导RAW264.7巨噬细胞活力值的最适LPS浓度。在最适LPS浓度下,利用PI3K阻断剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)(5 mmol·L~(-1)),Akt阻断剂MK2206(5μmol·L~(-1)),m TOR阻断剂Rapamycin(10μmol·L~(-1)),Beclin-1阻断剂Spautin-1(5μmol·L~(-1))及不同剂量的补阳还五汤含药血清(5%,10%,20%)处理RAW264.7巨噬细胞24 h后,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测RAW264.7巨噬细胞炎症因子白细胞介素-1β(IL-1β),白细胞介素-6(IL-6),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的浓度,蛋白免疫印迹法(Western blot)测定磷酸化(p-)PI3K,p-Akt,p-mTOR通路蛋白的表达及微管轻链蛋白3(LC3),泛素结合蛋白1(p62),Beclin-1的水平。自噬双标腺病毒转染检测RAW264.7细胞自噬流的变化。结果:CCK-8结果显示10 mg·L~(-1)LPS作用时,细胞活性显著增强。模型组IL-1β,IL-6,TNF-α浓度显著高于空白组(P0.01),与模型组比较,Rapamycin显著升高IL-6浓度,其他给药组均可降低IL-1β,IL-6,TNF-α的水平(P0.05,P0.01)。模型组p-Akt,p-PI3K,p-mTOR蛋白表达量明显低于空白组(P0.05),LC3,p62蛋白表达量显著高于空白组(P0.01),与模型组比较,Rapamycin显著降低p-Akt蛋白表达量,不影响p-mTOR表达,补阳还五汤各剂量组与其他各阻断剂组均可明显升高p-Akt,p-PI3K,p-mTOR蛋白表达量(P0.05,P0.01),降低LC3,p62蛋白表达量(P0.05,P0.01),各组Beclin-1蛋白表达量均无显著性差异。与空白组比较,模型组中有明显的自噬体斑点形成,自噬流顺畅;与模型组比较,补阳还五汤含药血清组,3-MA,Spautin-1组自噬斑点的形成明显减少或消失,MK2202,Rapamycin组自噬体斑点大小明显减小,但自噬活力仍较强。结论:补阳还五汤抗LPS诱导巨噬细胞活化与自噬与抑制巨噬细胞炎症反应,调控PI3K/Akt/m TOR信号通路,抑制自噬的过度发生有关。     

越南人参皂苷R7抑制LPS及TNF-α联合诱导大鼠星形胶质细胞C6的激活作用研究

该研究旨在探讨越南人参皂苷R7(R7)对LPS及TNF-α联合诱导下大鼠星形胶质细胞C6的激活抑制作用及机制。取对数生长的C6细胞,在无血清的DMEM培养基中饥饿培养24 h后,使用0.25%胰酶将其消化收集,按1.5×106个/mL密度接入培养板中培养过夜。实验分组如下:对照组(无药物处理),模型组(LPS 1 mg·L~(-1),TNF-α10μg·L~(-1)处理24 h),给药组(分别用6.25,12.5,25,50,75μmol·L-1R7,4μmol·L~(-1)L-NMMA预处理2 h后,再经过LPS 1 mg·L~(-1),TNF-α10μg·L~(-1)刺激24 h)。处理之后,CCK-8法检测细胞活力,Griess法检测培养基中NO含量,ELISA法检测培养基中IL-6,TNF-α浓度,实时定量PCR法检测细胞中相关炎症基因的表达,双荧光素酶报告基因法检测细胞中NF-κB信号分子的激活。研究发现,与模型组相对比,R7量效相关性降低C6细胞的NO释放水平,其IC50约为34μmol·L~(-1);同时,R7减少LPS及TNF-α刺激造成的细胞增殖。50μmol·L-1R7可以显著降低iNOS(P0.001),TNF-α(P0.001),IL-1β(P0.05)以及COX-2(P0.001)的基因表达,不能下调IL-6的基因表达,但可以减少TNF-α(P0.001)及IL-6(P0.001)的释放。进一步的研究表明,不同剂量R7(25,50,100μmol·L-1)均可显著抑制NF-κB转录活性(P0.05,P0.01及P0.001)。研究表明,R7可以抑制LPS及TNF-α联合诱导炎症因子基因表达及分泌,其作用可能与其抑制NF-κB转录活性相关,提示其在神经炎症相关中枢神经系统疾病中可能的治疗作用。     

中风急性期中医临床路径应用前后情况回顾性分析

目的探讨参苓白术散抗脂多糖(LPS)诱导的炎症性肠病(IBD)损伤的作用和机制。方法采用LPS(200μg·m L~(-1))造模,将细胞分为空白组(10%空白血清),模型组(10%空白血清+LPS),参苓白术散低、中、高剂量组(4%含药血清+LPS、8%含药血清+LPS、16%含药血清+LPS),FBS对照组(10%FBS+LPS)、Rho激酶(ROCK)阻断剂Y27632组(10μmol·L~(-1) Y27632+16%含药血清+LPS)、肌球蛋白亲链激酶(MLCK)阻断剂ML-7组(10μmol·L~(-1) ML-7+16%含药血清+LPS)。建立肠隐窝上皮细胞(IEC-6)与小鼠T淋巴细胞瘤细胞(Cyc-Tag)共培养体系。将共培养细胞接种于Transwell 12孔板中,采用Millipore-ERS电阻仪检测共培养体系下IEC-6细胞跨膜电阻值(TEER);采用Western Blotting法分别检测共培养体系中和Cyc-Tag单独培养下ROCK、MLCK、磷酸化ROCK(Pho-ROCK)及磷酸化MLC(Pho-MLC)蛋白的表达情况。结果共培养体系中,与空白组比较,模型组的IEC-6细胞TEER值显著下降(P0.01),ROCK、Pho-ROCK、MLCK及Pho-MLC蛋白表达量显著增加(P0.01);与模型组比较,参苓白术散低、中、高剂量组及Y27632组、ML-7组的IEC-6细胞TEER值均显著升高(P0.01),ROCK、Pho-ROCK、MLCK及Pho-MLC蛋白表达量均有明显下调(P0.05,P0.01)。Cyc-Tag细胞单独培养下,与空白组比较,模型组的ROCK、Pho-ROCK、MLCK及Pho-MLC蛋白表达量显著增加(P0.01);与模型组比较,参苓白术散低、中、高剂量组及Y27632组、ML-7组的ROCK、Pho-ROCK、MLCK及Pho-MLC蛋白表达量均有明显的下调(P0.05,P0.01)。结论参苓白术散含药血清对LPS诱导的IEC-6细胞损伤具有明显地抑制作用,可能与调节ROCK/MLCK信号通路及改善IEC-6细胞通透性有关。     

黄芪甲苷对异丙肾上腺素诱导的大鼠原代心肌细胞损伤的抗凋亡作用

目的:研究黄芪甲苷对异丙肾上腺素诱导的SD大鼠乳鼠原代心肌细胞损伤的抗凋亡作用,并探讨相关的作用机制。方法:利用酶解法和差速贴壁方法从出生1~3 d的正常SD大鼠的乳鼠心脏中分离得到原代心肌细胞,种于24孔板,体外培养48 h后,设置空白组、模型组、美托洛尔组及黄芪甲苷低、中、高剂量组。预先给予各组对心肌细胞有害的儿茶酚胺类物质异丙肾上腺素(ISO),造成体外原代心肌细胞损伤模型,空白组心肌细胞不加ISO;30 min后予各治疗组相应浓度的美托洛尔(2.336μg·L~(-1))及黄芪甲苷低、中、高剂量(3,10,30μmol·L~(-1))。BCA法检测总蛋白含量,蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测原代心肌细胞的B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2),Bcl-2相关蛋白X(Bax)及Bcl-2相关k蛋白(Bak)的表达,流式细胞学法检测各组细胞的凋亡率,Hochest/PI双染法镜下观察各组细胞细胞核的形态,从而检测细胞的凋亡情况。结果:与空白组比较,各给药组(10~40μmol·L~(-1))原代心肌细胞的活力上调(P0.05);HOCHEST/PI双染结果显示,与模型组比较,美托洛尔组及黄芪甲苷中、高剂量亮蓝色凋亡细胞明显减少;细胞流式结果显示,与模型组比较,美托洛尔组凋亡率下调(P0.01),黄芪甲苷中剂量组凋亡率下调(P0.05),黄芪甲苷高剂量组凋亡率下调(P0.01);Bcl-2灰度值结果显示,与模型组比较,美托洛尔组Bcl-2的表达上调(P0.01),黄芪甲苷低剂量组Bcl-2表达上调(P0.05),黄芪甲苷中、高剂量组Bcl-2表达上调(P0.01);Bak灰度值结果显示,与模型组比较,美托洛尔组Bak的表达下调(P0.05),黄芪甲苷高剂量组Bak表达下调(P0.05);Bax灰度值结果显示,与模型组比较,美托洛尔组Bax的表达下调(P0.01),黄芪甲苷高剂量组Bax表达下调(P0.05)。结论:黄芪甲苷对异丙肾上腺素诱导的大鼠原代心肌细胞损伤有抗凋亡作用。     

羟基红花黄色素A联合黄芪甲苷-Ⅳ对TNF-α诱导内皮细胞凋亡的影响

目的:观察羟基红花黄色素A(hydroxysafflower yellow A,HSYA)联合黄芪甲苷-Ⅳ(astragaloside-Ⅳ,As-Ⅳ)对人重组肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)诱导人脐静脉内皮细胞EA.hy926凋亡的影响。方法:噻唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度TNF-α(0,10,20,50μg·L~(-1)),HSYA(0,1×10~(-6),5×10~(-6),1×10~(-5),1×10~(-4)mol·L~(-1)),As-Ⅳ(0,1×10-6,5×10~(-6),1×10~(-5),1×10~(-4)mol·L~(-1))对细胞活力的影响以及HSYA联合As-Ⅳ(1×10-5mol·L~(-1))对TNF-α(20μg·L~(-1))损伤细胞活力的影响。蛋白免疫印迹法(Western blot)检测不同浓度TNF-α对B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax),活化的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved Caspase-3),活化的天冬氨酸蛋白水解酶-9(cleaved Caspase-9)蛋白表达的影响,以及HSYA联合As-Ⅳ对上述蛋白表达是否具有改善作用。实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测HSYA联合As-Ⅳ对TNF-α诱导Bcl-2基因表达的影响,免疫荧光技术分析HSYA联合As-Ⅳ对TNF-α诱导Bcl-2,Bax蛋白表达的影响。结果:与空白组比较,TNF-α在20μg·L~(-1)时可诱导EA.hy926细胞活力下降,上调Bax,cleaved Caspase-3,cleaved Caspase-9蛋白的表达,下调Bcl-2蛋白的表达;与TNF-α组比较,HSYA联合As-Ⅳ预处理组可减少TNF-α诱导的细胞活力下降,抑制Bax,cleaved Caspase-3,cleaved Caspase-9蛋白的表达,增加Bcl-2蛋白的表达,且HSYA联合As-Ⅳ预处理组对上述指标的改善效果优于HSYA或As-Ⅳ单独预处理组。结论:HSYA联合As-Ⅳ对TNF-α诱导的EA.hy926细胞凋亡具有抑制作用,且效果优于单药,其机制可能与其下调Bax,cleaved Caspase-3,cleaved Caspase-9和上调Bcl-2的表达有关。     

HPLC-ELSD-UV联用测定保肾甲丸中黄芪甲苷、淫羊藿苷的含量

目的:建立保肾甲丸中黄芪甲苷、淫羊藿苷的含量测定方法。方法:采用HPLC-ELSD-UV联用方法,Waters symmetry C_(18)色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相乙腈–水(30∶70),流速1m L·min~(-1),柱温30℃,紫外检测波长270nm(淫羊藿苷),蒸发光检测器漂移管温度105℃(黄芪甲苷)。结果:黄芪甲苷在0.3995μg~3.995μg范围内呈良好线性关系(r=0.9993),平均回收率为99.94%,RSD值为1.06%;淫羊藿苷在25μg·m L~(-1)~800μg·m L~(-1)范围内呈良好线性关系(r=0.9999),平均回收率为97.61%,RSD值为1.29%。结论:所建方法简便可靠,重复性好,可作为过保肾甲丸中黄芪甲苷、淫羊藿苷的测定方法。     

黄芪甲苷对人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖及白细胞介素6分泌的影响

目的:本实验通过研究黄芪甲苷对肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)诱导的人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(human fibroblast-like synoviocytes,HFLS-RA)增殖作用的影响,探讨其调控HFLS-RA内白细胞介素6(Interleukin-6,IL-6)、c-Jun氨基末端激酶1(JNK1)、c-Jun氨基末端激酶1/2(JNK1/2)蛋白表达的作用机制。方法:体外培养HFLS-RA,采用TNF-α及不同浓度的黄芪甲苷(astragaloside IV,AS-Ⅳ)干预细胞。本次实验共分为空白组(10%胎牛血清培养基培养细胞)、TNF-α组(10ng/mL TNF-α)、AS-ⅣH组(10ng/mLTNF-α+100μg/mLAS-Ⅳ)、AS-ⅣM组(10ng/mLTNF-α+50μg/mLAS-Ⅳ)、AS-ⅣL组(10ng/mLTNF-α+25μg/mL AS-Ⅳ)5组,MTT法检测不同浓度的黄芪甲苷对TNF-α诱导的HFLS-RA增殖活力的影响,ELISA法检测细胞上清液中IL-6的表达水平,Western Blot法检测细胞中JNK1、JNK1/2蛋白表达水平。结果:黄芪甲苷能够抑制TNF-α诱导的HFLS-RA细胞增殖,降低HFLS-RA中IL-6、JNK1、JNK1/2蛋白表达。结论:黄芪甲苷通过调控JNK信号通路相关细胞因子表达抑制TNF-α诱导的HFLS-RA细胞增殖。     

20(R)-人参皂苷Rg3抗角膜瘢痕机制研究

目的:研究不同浓度的20(R)-人参皂苷Rg3(GRg3)对兔角膜成纤维细胞增殖和转化生长因子-β1(TGF-β1)表达的影响,探讨GRg3抑制角膜瘢痕增生的机制。方法:直接选用大白兔获取兔角膜成纤维细胞后进行原代培养,采用甲基噻唑基四唑(MTT)比色法观察不同浓度(10 mg·L~(-1),20 mg·L~(-1),50 mg·L~(-1),100 mg·L~(-1),150 mg·L~(-1),200 mg·L~(-1))GRg3对兔角膜成纤维细胞增殖作用的影响。应用反转录-PCR(RT-PCR)技术研究不同浓度GRg3对培养的兔角膜成纤维细胞TGF-β1m RNA表达的影响。结果:MTT法检测结果:与对照组比较,当GRg3浓度达到20 mg·L~(-1)及以上时,兔角膜成纤维细胞增殖均显著受抑制。当GRg 3浓度达到50 mg·L~(-1)及以上时,GRg3对兔角膜成纤维细胞TGF-β1 mRNA表达具有抑制作用。结论:GRg3具有抑制体外培养的兔角膜成纤维细胞增殖的作用,并随着GRg3浓度的增加,其抑制作用增强。随培养时间的延长,GRg3抑制作用增强。GRg3对兔角膜成纤维细胞TGF-β1mRNA表达具有抑制作用。     

HPLC法同时测定康溃丸中黄芪甲苷藁本内酯和党参炔苷的含量

目的建立HPLC法同时测定康溃丸中黄芪甲苷、藁本内酯、党参炔苷的含量的方法。方法采用高效液相色谱法,色谱条件:Agilent Zorbax Eclipse XDB-C_(18)色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm);混合流动相:流动相A为乙腈,流动相B为0.25 moL·L~(-1)三氟乙酸水溶液,梯度洗脱;流速:1.0 mL·min~(-1);柱温:28℃;进样量:10μL;检测波长:282nm。结果黄芪甲苷、藁本内酯、党参炔苷检测质量浓度线性范围分别为2.256～32.158 μg·mL~(-1),2.268～58.142 μg·mL~(-1),2.284～46.524 μg·mL~(-1)。平均加样回收率(RSD)分别为100.95(0.88)、99.42(1.06)、99.42(0.92)。结论该方法简单快速、准确可靠、专属性、精密度、稳定性、重复性均较好,为康溃丸质量标准的提高提供有意义的实验基础。