胰腺癌新基因S100P与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体的构建

目的:构建胰腺癌新基因SLOOP与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒载体.方法:实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得SlOOP的全外显子片段.使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体质粒中,慢病毒包装质粒和穿棱质粒共转染293T细胞,包装成功后收集上清,浓缩,鉴定.取浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞和宿主胰腺癌细胞.荧光显微镜观察293T细胞的荧光表达,RT-PCR鉴定胰腺癌细胞中SLOOP的表达水平.结果:电泳鉴定结果与目的基因表达条带完全吻合,克隆测序结果与NCBI收录的S LOOP基因序列完全一致.重组慢病毒质粒可高效转染293T细胞.荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光.共转染后293T细胞上清可高效感染293T细胞,感染后宿主细胞中S LOOP高表达.结论:成功构建了S LOOP与GFP融合基因慢病毒表达载体,为进一步研究SLOOP基因的相关功能提供了适合的稳定转染载体.     

甲酰肽受体shRNA稳定转染U87细胞系的构建

目的 构建靶向甲酰肽受体(FPR)基因的shRNA慢病毒表达载体,建立稳定转染的U87细胞系.方法 设计并合成FPR基因特异性的shRNA序列,构建PDS019_pL/shRNA/GFP/F-FPR慢病毒载体,通过脂质体转染293T细胞包装成FPR慢病毒颗粒,感染U87细胞.荧光显微镜观察转染效果,实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法(Western blot)法检测FPR干扰效率.结果 成功构建FPR基因shRNA慢病毒表达载体.稳定转染U87细胞后,荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白.实时荧光定量PCR及Western blot证实PDS019_pL/shRNA/GFP/F-FPR慢病毒载体具有良好的干扰效果.结论 成功构建FPR shRNA稳定转染的U87细胞系.     

人FGF-9慢病毒表达载体的构建、包装及鉴定

目的构建人成纤维细胞生长因子-9（FGF-9）慢病毒表达载体,鉴定其表达,并对慢病毒载体进行包装,为在体及体外研究FGF-9的功能及其与肿瘤等疾病的关系提供基础。方法PCR扩增人FGF-9基因。全长序列交换入线性表达载体,连接产物转化感受态细胞,PCR及基因测序鉴定阳性克隆。重组质粒转染293T细胞,荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白（eGFP）表达,Western—blot鉴定FGF-9表达。重组病毒质粒在脂质体介导下与结构质粒和包膜质粒共转染293T细胞包装成人FGF-9过表达慢病毒,RT—qPCR测定滴度。结果PCR及测序证实人FGF-9基因正确克隆至病毒质粒;感染293T细胞后,荧光显微镜观察到eGFP,Western—blot检测到FGF一9融合蛋白表达;三质粒共转染293T细胞获得慢病毒,测其浓度为2×10^8TU／mL。结论成功构建人FGF-9慢病毒表达载体．可在293T细胞中表达,并包装成慢病毒,为在体及体外研究FGF-9的功能及其与肿瘤等疾病的关系提供基础。     

大鼠线粒体膜蛋白Nix基因过表达与shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建线粒体膜蛋白Nix基因过表达与shRNA慢病毒载体.方法 PCR扩增获得Nix基因序列,与经BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切的pHBLV-CMVIE-IRES-Puro载体连接获得Nix过表达重组慢病毒载体;以Nix为靶基因,合成寡核苷酸,退火形成双链DNA,与经BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切的pHBLV-U6-Scramble-Puro载体连接获得Nix shRNA重组慢病毒载体;将病毒包装辅助质粒与上述重组慢病毒载体共转染293T细胞,收集上清液并浓缩获得慢病毒浓缩液,3倍梯度稀释法测定病毒滴度;用病毒颗粒感染PC12细胞,经嘌呤酶素筛后得到稳定感染细胞株;荧光显微镜检测Nix荧光水平,Western blot检测Nix蛋白的表达.结果 成功构建Nix基因过表达和shRNA慢病毒载体,并在293T细胞中包装获得病毒.重组病毒感染PC12细胞后,荧光显微镜检测Nix基因过表达细胞荧光水平增加,shRNA感染细胞荧光水平降低;Western blot检测显示Nix基因过表达PC12细胞中Nix蛋白表达显著升高,shRNA慢病毒感染细胞中Nix蛋白表达明显降低,而Nix shRNA1干扰效果最好.结论 成功构建Nix基因过表达与shRNA慢病毒载体,并获得Nix过表达与干扰细胞模型.     

重组表达人IDO基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建重组表达人吲哚胺2,3-过氧化酶（IDO）基因的慢病毒载体。方法:设计相应引物,从含有人IDO基因的cDNA文库中,利用聚合酶链反应（PCR）方法钓取人IDO基因的全长编码区片段。将目的基因与经酶切线性化的慢病毒载体pGC-FU进行定向的连接,将产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆进行菌落PCR鉴定,并对阳性的克隆进行测序及比对分析。重组慢病毒及辅助包装质粒共转染293T细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况;采用Wester blot 检测IDO-GFP融合蛋白的表达情况;实时荧光定量PCR检测慢病毒浓缩液的滴度。结果:成功获取人IDO基因编码区序列,人IDO基因慢病毒转染质粒连接正确;293T细胞中产生慢病毒颗粒;IDO基因在细胞内稳定表达;人IDO基因重组慢病毒载体的滴度为2×108 TU/ml。结论:成功构建并包装出高滴度的人IDO基因重组慢病毒表达载体,为下一步转染目的细胞奠定了实验基础。     

α-突触核蛋白对内质网应激及细胞凋亡影响

目的:构建α-突触核蛋白(α-synuclein,SNCA)和SNCA突变基因(SNCAmu)过表达转染293T细胞,观察内质网应激及细胞凋亡.方法:应用PCR技术扩增目的基因并插入慢病毒载体质粒,重组质粒的构建及包装293T细胞,转染24 h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(green fluorescent prot...     

免疫检查点TIGIT慢病毒表达载体的构建和稳定表达TIGIT细胞系的建立

目的 构建T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序结构域-绿色荧光蛋白（TIGIT-GFP）慢病毒表达载体,建立稳定表达TIGIT-GFP的细胞系,探讨TIGIT-GFP融合蛋白在稳定表达细胞系中的表达情况。 方法 将TIGIT质粒和慢病毒载体pLenti-GFP分别采用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切,凝胶回收后连接构建重组质粒pLenti-TIGIT-GFP。将测序正确的重组质粒转染人胚胎肾HEK293T细胞作为实验组,转染TIGIT质粒的HEK293T细胞作为对照组,转染48 h后荧光显微镜下观察细胞膜上GFP表达情况。将实验组细胞继续培养,采用嘌呤霉素筛选2周后,挑取单克隆扩大培养,荧光显微镜观察细胞膜上GFP表达情况,Western blotting 法检测在转染的人胚胎肾HEK293T细胞中TIGIT-GFP蛋白表达情况。 结果 酶切鉴定,TIGIT基因成功插入pLenti-GFP表达载体,DNA测序未检测到突变发生。实验组细胞膜上检测到GFP表达。Western blotting法检测,实验组细胞裂解液中检测到TIGIT-GFP特异性条带。 结论 成功构建pLenti-TIGIT-GFP慢病毒表达载体,建立稳定表达TIGIT-GFP融合蛋白的细胞系,TIGIT-GFP融合蛋白主要在稳定细胞系的细胞膜上表达。     

鼠VEGF红色荧光慢病毒载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的 构建含鼠血管内皮细胞生长因子(mVEGF)红色荧光慢病毒载体,鉴定其在293T细胞中的表达.方法 构建含mVEGF和红色荧光蛋白(DsRed)基因双顺反子重组慢病毒质粒;采用脂染法将慢病毒系统三质粒共转染293T细胞,转染后24 h和48 h荧光显微镜下观察DsRed表达,收集48 h 和72 h病毒上清并感染靶细胞239T,荧光显微镜下观察DsRed表达情况,并行Western blot分析培养上清和胞浆内mVEGF表达.结果 成功构建慢病毒表达质粒pTK208-mVEGF-IRES-DsRed,重组慢病毒滴度达5×106 PFU/ mL,并获得蛋白DsRed和mVEGF的表达.结论 含mVEGF红色荧光慢病毒质粒成功介导mVEGF蛋白的表达,该载体有望为研究VEGF的病理生理学机制及基因靶向治疗提供有效的工具.     

构建过表达/干扰多梳蛋白2的人胶质瘤细胞系

目的 构建过表达/干扰多梳蛋白2(polycomb-like 2,PCL2)基因重组慢病毒并稳转胶质瘤U251细胞系。方法 过表达PCL2重组慢病毒载体pLVX-hPCL2-3flag-ZsGreen-Puro和干扰PCL2重组慢病毒载体pLVXshRNA2-Puro-hPCL2通过克隆技术成功构建,在293T细胞中导入质粒载体完成慢病毒包装,经过干预HEK293获得转染效率,病毒滴度采用逐孔稀释梯度法测得。将构建好的hPCL2/shRNA PCL2重组慢病毒转染胶质瘤U251细胞,倒置显微镜下观察荧光强度及范围,Western blot检测PCL2蛋白的表达情况。结果 成功构建hPCL2/shRNA PCL2重组慢病毒载体,Western blot结果显示,相比对照组和空载组,目的蛋白在转染过表达PCL2重组慢病毒U251细胞中表达明显升高,在转染干扰PCL2重组慢病毒U251细胞中表达降低（P均<0.05）。结论 成功构建hPCL2/shRNA PCL2重组慢病毒的U251细胞系。     

改建型STAT1-CC基因慢病毒载体的构建及其在肺癌A549细胞中的表达

目的:构建携带STAT1基因和突变型STAT1-CC基因的慢病毒表达载体,转染肺癌A549细胞并检测STAT1和STAT1-CC基因在肺癌A549细胞内的表达.方法:采用PCR技术从质粒模板中扩增得到目的基因STAT1和STAT1-CC,将其接入含有CMV启动子和绿色荧光蛋白(EGFP)的慢病毒载体中,构建慢病毒载体表达载体Lenti-STAT1和Lenti-STAT1-CC,双酶切和测序鉴定.分别将重组子Lenti-STAT1、LentiSTAT1-CC和包装质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,感染非小细胞肺癌细胞株A549.荧光显微镜观察A549细胞EGFP表达,Western Blotting验证STAT1在A549细胞株中的表达.结果:酶切及测序结果显示成功构建重组慢病毒表达载体Lenti-STAT1和Lenti-STAT1-CC,将慢病毒颗粒感染A549细胞48 h后,观察到宿主细胞内EGFP表达,Western Blotting证实STAT1蛋白在A549细胞中过表达.结论:本实验成功构建了携带STAT1基因和STAT1-CC基因的慢病毒表达载体,并在A549细胞中过表达STAT1基因.     

抗精子抗体和抗子宫内膜抗体与不孕及流产的关系

目的　探讨抗精子抗体（ＡｓＡｂ）与抗子宫内膜抗体（ＥＭＡｂ）在不孕、流产中的作用及二者关系,进一步 揭示不孕、流产的病因。方法　采用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）同时检测３４５例不孕、流产妇女血清中的ＡｓＡｂ与 ＥＭＡｂ,按ＡｓＡｂ检测结果分阳性组和阴性组,比较两组ＥＭＡｂ阳性率的差异。结果　原发不孕及自然流产妇女中, ＡｓＡｂ（－）组ＥＭＡｂ阳性率高达１６．６７％和１９．５１％,而ＡｓＡｂ（＋）组ＥＭＡｂ阳性率高达４３．６４％和４２．８６％,显著高于 ＡｓＡｂ（－）组（Ｐ＜０．０１,Ｐ＜０．０５）。继发不孕妇女中ＡｓＡｂ（－）组ＥＭＡｂ阳性率为１８．１８％,ＡｓＡｂ（＋）组ＥＭＡｂ阳性率 为３２．２％,二者无显著性差异（０．０１＞Ｐ＞０．０５）。结论原发不孕及自然流产妇女中因个体免疫反应差异使某些 人易对体内、外物质发生免疫反应而产生抗体,从而导致不孕或流产。     

亚硝基脲类和亚硝基硫脲类的理化性质及致突变能力

本题选择N,N′-二甲基亚硝基脲(DMNU),N,N′-二乙基亚硝基脲(DENU),及其类似物N,N′-二甲基亚硝基硫脲(DMNTU)、N,N′-二乙基亚硝基硫脲(DENTU)为代表,测定了这些化合物的水解反应速度、脂溶性(HPLC的logk′值)、水解产物和致突变能力。证明了硫脲的脂溶性大于脲的脂溶性。DMNTU对TA100菌株的致突变能力最强,其它较弱。     

气血与足月妊娠分娩关系的探讨

论述足月妊娠分娩的发动和维持依靠气的推动、温煦、气化、固摄功能和血的营养、濡润功能。顺利分娩既要气血充足，还要气顺血和。临床研究结果表明调补气血，是促进产程，预防难产的重要手段。实验研究结果阐明调补气血中药加强产力、促进产程主要是从改善产妇全身情况，提高机体抗应激、抗疲劳、耐缺氧能力，即所谓使产妇气血充足调和，充分发挥气血在分娩过程中的生理作用。     

水疗联合抚触对新生儿的生长发育、黄疸及睡眠的影响

目的探讨新生儿游泳联合抚触对新生儿的生长发育、黄疸及睡眠的影响。方法将经阴道顺产分娩的正常新生儿100例随机分为两组，观察组（水疗联合抚触组）50例，对照组（单纯沫浴组）50例。①测定两组10日、28日的体重、身长、上臂围；②观察记录胎便转黄时间，测定皿清胆红素；③记录24h睡眠时间。结果两组新生儿10日、28日体重、身长、上臂同增长有显著差异（P〈0．05），两组新生儿5日时，胎便转黄时间及黄疸指数比较均有显著性差异（P〈0．01），两组睡眠时间比较有统计学意义（P〈0．05），两组并发症比较无统计学意义（P〉0．05）。结论新生儿水疗联合抚触可促进新生儿的生长发育，能加速胎粪的早排出，减轻生理性黄疸程度，有效地降低新生儿高胆红素血症的发病率，提高睡眠质量。