生技霉素小组分的研究I.分离纯化和4"-异丁酰螺旋霉素Ⅱ(生技霉素B2β)的结构鉴定

生技霉素是一组以4"-异戊酰螺旋霉素为主的基因工程杂合抗生素,除了主要组分4"-异戊酰螺旋霉素Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ(生技霉素A1、B1、E1)和小组分4"-丁酰/异丁酰螺旋霉素Ⅲ(生技霉素A2α/A2β)以外,还含有其它4"-酰化螺旋霉素和少量杂质.采用连续逆流分配法,碱性硅胶柱层析,制备薄层层析和中压柱层析等分离方法,并以薄层层析和HPLC作为检测手段,从生技霉素混合物中分离得到了四个小组分A0、B2、B3和C2,其含量分别为0.5%、3.3%、6.2%和2.6%,其中B2为B2α和B2β两个异构体的混合物.经过UV、IR、SI-MS、GC-MS、1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY等光谱分析,并与生技霉素A1、B1、A2α、A2β等的光谱数据进行比较,确定了生技霉素B2α为4"-丁酰螺旋霉素II,B2β为4"-异丁酰螺旋霉素Ⅱ,其中4"-异丁酰螺旋霉素II为一个新的基因工程杂合抗生素.     

生技霉素小组分的研究 Ⅲ.新螺旋霉素类抗生素生技霉素B0的分离和结构鉴定

生技霉素是一个多组分的基因工程杂合抗生素,含有主要成分4"-O-异戊酰螺旋霉素Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ(生技霉素A1、B1、E1)和其它4"-O-酰化螺旋霉素及少量杂质.采用逆流分配层析、碱性硅胶柱层析和中压柱层析等分离方法,从生技霉素混合物中又分离得到一个新的小组分--生技霉素B0.经UV、IR、FAB-MS、1H-NMR、13C-NMR和1H-1H COSY等光谱分析表明,生技霉素B0的结构为4"-O-(3-甲基-2-丁烯酰)螺旋霉素Ⅱ,是一个新的4"-O-酰化螺旋霉素类抗生素.     

生技霉素小组分的研究 Ⅱ.生技霉素A0、B3和C2的结构鉴定

生技霉素中除了主要组分4“－异戊酰螺旋霉素Ⅲ、Ⅱ、I（生技霉素A1、B1、E1）和小组分4“－丁酰／异丁酰螺旋霉素Ⅲ（生技霉素A2α/A2β）以外，还含有其它4“－酰化螺旋霉素和少量杂质。经过UV、IR、SIMS、^1H-NMR、^13C-NMR、^1H-^1H COSY等光谱分析，并与生技霉素书籍组分的光谱数据进行对照，确定了生技霉素A0为普拉特霉素A1，生技霉素B3为4“－丙酰螺旋霉素Ⅲ，生技霉素C2为4“－丙酰螺旋霉素Ⅱ，并对各组分所有碳氢信号的化学位移作出了明确的归属。     

生技霉素小组分的研究 Ⅰ.分离纯化和4″-异丁酰螺旋霉素Ⅱ(生技霉素B_(2β))的结构鉴定

生技霉素是一组以4"-异成酰螺旋霉素为主的基因工程杂合抗生素，除了主要组分4"-异戊酚螺旋霉素Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ（生技霉素A1、B1、E1）和小组分4"-了酰／异丁酞螺旋霉素Ⅲ（生技霉素A2a／A2β）以外，还含有其它4"-酸化螺旋霉素和少量杂质。采用连续逆流分配法，碱性硅胶柱层析，制备薄层层析和中压柱层析等分离方法，并以薄层层析和HPLC作为检测手段，从生技霉素混合物中分离得到了四个小组分A0、B2、B3和C2，其含量分别为0．5％、3．3％、6．2％和2．6％，其中B2为B2a和B2β两个异构体的混合物。经过UV、IR、SI－MS、GC－MS、1H－NMR、13C－NMR、1H－1H COSY等光谱分析，并与生技霉素 A1、B1、A2a、A2β等的光谱数据进行比较，确定了生技霉素B2a为4"-丁酰螺旋霉素Ⅱ，B2β为4"-异丁酰螺旋霉素Ⅱ，其中4"-异丁酰螺旋霉素Ⅱ为一个新的基因工程杂合抗生素。     

生技霉素E(4"-异戊酰螺旋霉素Ⅰ)的分离和结构鉴定

为获得高产的4"异戊酰螺旋霉素,将4"异戊酰基转移酶基因整合入螺旋霉素产生菌S.spiramyceticusF21染色体,构建成功了一株稳定的生物工程菌WSJ1,继从该菌株代谢产物中分离获得生技霉素A1(4"异戊酰螺旋霉素)、生技霉素B1(4"异戊酰螺旋霉素),又分离获得一主要组分生技霉素E。经UV、FTIR、HRSIMS、1HNMR、13CNMR、1H1HCOSY等光谱分析和与生技霉素A1及相关文献的光谱数据比较,确定生技霉素E为本菌株目标化合物之一——4"异戊酰螺旋霉素,高效液相分析表明,该生物工程菌代谢产物中4"异戊酰螺旋霉素含量超过55%。     

生技霉素小组分的研究 Ⅲ.新螺旋霉素类抗生素生技霉素B0的分离和结构鉴定

生技霉素是一个多组分的基因工程杂合抗生素，含有主要成分4”-O-异戊酰螺旋霉素Ⅲ、Ⅱ、I(生技霉素A1、B1、E1)和其它4”-O-酰化螺旋霉素及少量杂质。采用逆流分配层析、碱性硅胶柱层析和中压柱层析等分离方法，从生技霉素混合物中又分离得到一个新的小组分——生技霉素B0。经Uv、IR、FAB—MS、^1H—NMR、^13C-NMR和^1H-^1H COSY等光谱分析表明，生技霉素B0的结构为4”-O-(3-甲基-2-丁烯酰)螺旋霉素Ⅱ，是一个新的4”-O-酰化螺旋霉素类抗生素。     

生技霉素的组分研究

利用对流分配、硅胶柱层析、薄层层析、中压液相层析等分离技术 ,从基因工程菌 WSJ- 1的活性产物生技霉素中分离了 16个化合物。其中除主要产物生技霉素 A1 、B1 、E1 (4″- O-异戊酰螺旋霉素 、 、 )外 ,还包括生技霉素 A2α,A2β,生技霉素 B3,C1 (4″- O-丁酰 ,异丁酰 ,丙酰 ,乙酰螺旋霉素 )及生技霉素 B2α,B2β,C2 ,D1 (4″- O-丁酰 ,异丁酰 ,丙酰 ,乙酰螺旋霉素 ) ,以及新的 4″-酰化螺旋霉素生技霉素 B0 [4″- O- (3-甲基 - 2 -丁烯酰基 ) -螺旋霉素 ]。还有可能是 4″- O-酰化螺旋霉素生物合成中间体的生技霉素 A0 (普拉特霉素 A1 ) ,生技霉素 P1 、P2 (螺旋霉素 , )和生技霉素 P3(新螺旋霉素 )。文中报道了这些化合物的分离 ,性质及结构。并总结报道了具有重要鉴别意义的这些化合物中 C- 3,C- 4″酰基侧链的 1 H及 1 3C- NMR数据。     

生技霉素A及B的分离及结构鉴定

从含有４＂－酰化酶基因的螺旋霉素产生菌－基因工程菌的培养物中分离到一组４＂酰化螺旋霉素，命名为生技霉素。其在体内对小鼠实验感染的治疗作用比乙酰螺旋霉素强。生技霉素主要组份为生技霉素Ａ和Ｂ。通过溶媒提取，真空层析，制备薄层层析等方法得到了生技霉素Ａ、Ｂ的纯品。生技霉素Ａ的紫外最大吸收在２３０．８ｎｍ。具有与螺旋霉素、麦迪霉素、吉他霉素类似的红外吸收光谱，分子量为９８２（ＦＡＢＭＳ：Ｍ＋Ｈ，９８３）。分子式Ｃ５１Ｈ８６Ｎ２Ｏ１６。通过对ＦＡＢＭＳ，１Ｈ－ＮＭＲ，１３Ｃ－ＮＭＲ，ＤＥＰＴ，ＣＯＳＹ及ＨＥＴＣＯＲ谱分析，鉴定生技霉素Ａ的结构为４＂－异戊酰螺旋霉素Ⅲ，并对４＂－异戊酰螺旋霉素Ⅲ的８４个连碳氢的１Ｈ－ＮＭＲ信号作出了明确归属。生技霉素Ｂ与生技霉素Ａ具有类似的紫外及红外吸收光谱。分子量为９６８（ＦＡＢＭＳ：Ｍ＋Ｈ，９６９），比Ａ小１４个质量单位。主要根据１Ｈ－ＮＭＲ及１３Ｃ－ＮＭＲ谱的分析及与生技霉素Ａ的１Ｈ－ＮＭＲ及１３Ｃ－ＮＭＲ谱的比较，鉴定生技霉素Ｂ的结构为４＂－异戊酰螺旋霉素Ⅱ。     

天然来源的新化合物4~"-异丁酰螺旋霉素Ⅲ(生技霉素A_(2β))

生技霉素是一组４＂－酰化螺旋霉素，继从生技霉素产生菌发酵液中分离到主要组分生技霉素Ａ和Ｂ之后，利用两相分配及柱层析的分离方法，又分离到分子量为９６８的化合物生技霉素Ａ２。根据其ＵＶ、ＩＲ、ＦＡＢ－ＭＳ、１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲ、ＤＥＰＴ谱、１Ｈ－１ＨＣＯＳＹ的分析及与４＂－异戊酰螺旋霉素Ⅲ（即生技霉素Ａ）光谱数据的比较表明生技霉素Ａ２含分子式皆为Ｃ５０Ｈ８４Ｎ２Ｏ１６的４＂－异丁酰螺旋霉素Ⅲ（生技霉素Ａ２β）和４＂－丁酰螺旋霉素Ⅲ（生技霉素Ａ２α）。生技霉素Ａ２碱水解产物中游离脂肪酸的气相色谱及ＧＣ－ＭＳ分析支持了以上结论。     

利用强启动子PermE*提高4"-异戊酰基转移酶基因在变铅青链霉菌TK24中对螺旋霉素的4"-异戊酰化水平

目的 提高螺旋霉素生物转化为4"-异戊酰螺旋霉素的水平,为构建以4"-异戊酰螺旋霉素为主要组分的必特螺旋霉素新一代基因工程菌提供指导.方法 构建重组质粒pKC1139-e-ist-ist和pKC1139-ist-ist,它们分别含有5'-上游插入红霉素抗性基因强启动子PermE*的4"-异戊酰基转移酶基因串连双拷贝,和4"-异戊酰基转移酶基因串连双拷贝;将它们分别导入到变铅青链霉菌TK24中,比较它们对螺旋霉素的4"-异戊酰化能力.结果 在加入终浓度为50μg/mL螺旋霉素时,变铅青链霉菌TK24[pKC1139-e-ist-ist]比变铅青链霉菌TK24[pKC1139-ist-ist]对螺旋霉素的4"-异戊酰化水平提高近4倍.结论 在变铅青链霉菌TK24中,PermE*可以增强4"-异戊酰基转移酶基因表达,明显提高对螺旋霉素的4"-异戊酰化水平.