肾癌相关基因GYLZ-RCC18对肾癌细胞系GRC-1抗死亡作用机制的研究

目的：应用反义基因转染技术探讨肾癌相关新基因GYLZ－RCC18与肾癌细胞死亡（包括坏死及凋亡）之间的关系,并探讨肾癌基因疗法的新途径。方法：用脂质体包裹的新基因GYLZ－RCC18第一编码区起始处的20个碱基的反义和正义寡核苷酸导入肾癌细胞系GRC－1,应用流式细胞技术和伊红排斥实验连续检测GYLZ－RCC18反义寡核苷酸对肾癌细胞凋亡、坏死的影响。结果：导入GYLZ－RCC18反义寡核苷酸后,可大量杀伤GRC－1细胞并明显促进GRC－1细胞坏死,于第4天达到杀伤高峰约60％;同时可连续8d诱导凋亡峰,最高于第2天达约约22．5％,两种作用 曲线形状和峰值不完全一致。结论GYLZ－RCC18是肾癌相关的重要的新的癌基因,GYLZ－RCC18的表达可通过两种不同的机制即抗癌细胞坏死机制和抗凋亡机制发挥对肾癌细胞的保护作用,GYLZ－RCC18可能对肾癌细胞生存和耐药至关重要,通过导入反义基因的方法阻断肾癌细胞中GYLZ－RCC18的表达,可有效地杀伤肾癌细胞,对此新基因的研究将有助于为肾癌的基因的基础研究和临床治疗提供新的思路和途径。     

肾癌相关新基因GYLZ-RCC18的表达及意义

目的 探讨GYLZ－RCC18功能及在肾癌发生发展中的作用。方法 应用SMARTRACE技术克隆GYLZ－RCC18全长,应用逆转录聚合酶链式反应（RT－PCR）特异扩增第1阅读框中504bp序列,分析在肾癌中的表达特点及与肾癌分级、分期的关系。结果 GYLZ－RCC18基因全长约为3．5kb,在肾癌组织特异表达,正常肾组织低表达或不表达,两者表达量差异 约1－9倍。GYLZ－RCC18表达在高分级分期肾癌中的表达明显高于低分级分期者。结论 GYLZ－RCC18是肾癌组织相对特异表达的新基因,高表达与肾癌的早期发生及晚期进展密切相关。     

肾癌特异相关基因GYLZ-RCC18的表达及对肾癌细胞生长及增殖活性的影响

目的 通过检测肾癌相关新基因GYLZ－RCC18（基因号：BE825133）在肾癌中的表达特点及其对肾癌细胞生长、增殖的影响，探讨GYLZ－RCC18基因的功能及其在肾癌发生发展中的作用。方法 应用逆转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）的方法检测肾癌相关基因GYLZ－RCC18在31例肾癌标本中的表达特点；观察GYLZ－RCC18反义寡核苷酸对肾癌细胞生长、增殖活性、形态学的影响。结果 GYLZ－RCC18基因在肾癌组织特异表达，正常肾组织较肾癌组织低表达或不表达，两者表达量差异为1－9倍。GYLZ－RCC18基因的表达在高分级、高分期肾癌明显高于低分级、低分期肾癌；导入GYLZ－RCC18反义寡核苷酸后，可明显抑制癌细胞的生长和增殖活性，并减少分期肾癌，导入GYLZ－RCC18反义寡核苷酸后，可明显抑制癌细胞的生长和增殖活性，并减少GRC－1细胞的核分裂。结论 GYLZ－RCC18是肾癌组织相对较特异表达的新基因，它的高表达与肾癌发生发展以及生长、增殖密切相关，它的成功克隆为阐明肾癌发生发展的分子生物学机制开辟了新的途径，为今后肾癌的特异诊断，基因治疗提供了新的理论依据。     

肾癌差异表达基因GYLZ-RCC18的全长克隆及意义

目的 克隆并鉴定肾癌与下沉肾组织之间差异表达的基因。为研究肾癌发生发展机制提供新的突破口。方法 应用抑制性消减杂交技术,构建人肾癌组织与正常肾组织差异表达的ｃＤＮＡ消减文库,并从中克隆鉴定出肾癌特异表达的基因。结果：构建成功高消减效率的人肾癌组织ｃＤＮＡ消减文库,对其中１０个克隆的插入ｃＤＮＡ片段进行测序后,经基因库检索表明１０个片段均为未知新序列,其中ＧＹＬＺ－ＲＣＣ１８基因为５个拷贝,这提示以上１０个ｃＤＮＡ片段可能来自６个新基因。差异分析显示ＧＹＬＺ－ＲＣＣ１８的肾癌组织中有明显表达,而在正常肾组织中无表达,应用ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ技术获得ＧＹＬＺ－ＲＣＣ１８基因的全长,并证明ＧＹＬＺ－ＲＣＣ１８是一个５′端有Ｄ３种不同剪切方式亚型的基因家族。结论 ＧＹＬＺ－ＲＣＣ１８基因是肾癌特异表达的新基因。人肾癌ｃ     

c-myc反义RNA对肾癌细胞GRC-1的体外生物学影响

目的探讨ｃｍｙｃ反义ＲＮＡ对肾癌细胞系ＧＲＣ１的体外生物学影响。方法利用重组基因技术构建含ｃｍｙｃ反义ＲＮＡ的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３／ｍｙｃＡＳ,再通过脂质体介导完成重组体的细胞转染。结果与对照组相比,转染反义ＲＮＡ后的细胞体外生长速度减慢,软琼脂集落形成能力降低,部分细胞恢复生长接触性抑制;流式细胞仪显示肿瘤细胞Ｓ期百分率下降,细胞阻滞于Ｇ０／Ｇ１期;细胞ＤＮＡ合成减慢,３ＨＴｄＲ掺入率降低;原位杂交检测证实,转染后细胞内源性ｃｍｙｃ基因转录水平降低;被转染细胞在超微结构上也有相应改变。结论ｃｍｙｃ反义ＲＮＡ确能在体外实验中抑制肾癌细胞生长和逆转肿瘤恶性表型。     

反义肽核酸抑制人肾癌细胞系Ki-67基因的研究

目的探讨Ki-67基因翻译起始区反义肽核酸对人肾癌细胞Ki-67基因表达及生长的影响。方法人工合成反义肽核酸,脂质体转染肾癌细胞系786-0,采用免疫印迹法（Western blot）、3H-TdR掺入试验和原位末端标记（TUNEL）法检测肾癌细胞Ki-67抗原的表达、细胞增殖和凋亡情况。结果在反义肽核酸浓度大于1.0μmol/L情况下,western blot实验发现Ki-67抗原表达下降,3H-TdR掺入试验表明掺入率减低,TUNEL法显示细胞凋亡增加。结论Ki-67基因翻译起始区反义肽核酸能阻遏人肾癌786-0细胞系Ki-67抗原的表达,抑制肿瘤细胞增殖和生长,加快其凋亡,并且有明显的剂量依赖性。     

抗bcl-2核酶基因转染促进GRC-1肾癌细胞凋亡的研究

目的　观察抗ｂｃｌ２ 核酶促进ＧＲＣ１ 肾癌细胞凋亡的情况。　方法　体外构建抗ｂｃｌ２核酶基因逆转录病毒真核表达载体ｐＤＯＲＲＺ,用脂质体介导的ＤＮＡ 转染法导入ＧＲＣ１ 细胞,用ＤＮＡ 和ＲＮＡ 打点杂交、流式细胞仪（ＦＣＭ） 、电镜及光镜观察。　结果　核酶（ ＲＺ） 基因成功导入ＧＲＣ１ 细胞并在其内表达,转基因后ＧＲＣ１ 细胞的ｂｃｌ２ 蛋白量明显减少,ＦＣＭ 检测转基因后ＧＲＣ１ 细胞周期Ｇ１ 期前出现了典型的亚２ 倍体凋亡峰,电镜下观察ＧＲＣ１ 细胞出现典型的凋亡现象。　结论　人工合成的抗ｂｃｌ２ 核酶基因能够成功地导入ＧＲＣ１ 肾癌细胞并抑制ｂｃｌ２ 蛋白的合成,促进ＧＲＣ１ 细胞的凋亡。     

功能性β1整合素-GFP融合蛋白稳定过表达肝癌细胞系的建立

目的建立β1整合素-绿色荧光蛋白（GFP）稳定过表达人肝癌细胞系并检测其对各基质蛋白的黏附能力。方法构建β1整合素-GFP融合蛋白真核细胞重组表达质粒，并将其转染至人肝癌Hep3B细胞，建立稳定过表达β1整合素的肝癌细胞系。利用RT-PCR，Western印记，免疫沉降和荧光显微镜观察融合基因；检测转染细胞的增殖情况及对各基质蛋白的黏附能力。结果获得即整合素-GFP融合蛋白稳定转染过表达Hep3B细胞系；转染的β1整合素能与内因性α1，α5，α6整合素亚型形成二聚体；转染β1整合素对细胞增殖无明显影响，但使细胞对各基质蛋白的黏附能力明显增高。结论建立了功能性β1整合素-GFP稳定过表达的人肝癌细胞系，为进一步研究β1整合素基因的功能提供了一个有效的细胞系。     

胆囊癌细胞中转染Survivin和bcl-2反义寡核苷酸后凋亡作用的对比研究

目的:比较转染Survivin、bcl -2反义寡核苷酸(ASODN)对胆囊癌细胞系 GBC SD的凋亡促进作用。方法:设计并合成特异性靶向 Survivin及 bcl- 2 的 ASODN。胆囊癌细胞分为 5 组:空白对照组、Survivin ASODN转染组、bcl- 2 ASODN转染组、Survivin SODN转染组和bcl -2 SODN转染组,转染24h后,采用逆转录 聚合酶链反应(RT PCR)检测Survivin基因、bcl- 2基因表达的变化,流式细胞仪技术检测细胞凋亡率,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测 ASODN对细胞的生长抑制率。结果:转染 Survivin及bcl 2 ASODN后,胆囊癌细胞内Survivin基因表达下调 47.8%,bcl- 2 基因表达下调 52.4%;细胞凋亡率分别为(11.4±3. 9)%、(7. 3±3. 2)%,与对照组差异有统计学意义(P< 0. 01)。而转染 SurvivinASODN组及bc1 2ASODN组相比差异也有显著性(P<0.05)。两转染组相对于空白对照组的生长抑制率分别为54.3%、41.6%。结论:Survivin和bcl 2反义寡核苷酸均可有效的抑制Survivin及bc1- 2基因的表达,从而诱导胆囊癌细胞的凋亡,两者相比,Survivin反义寡核苷酸可更为有效地诱导胆囊癌细胞的凋亡。     

反义人端粒酶逆转录酶基因转染对人胃癌细胞系的影响

目的探讨反义人端粒酶(hTERT)基因治疗的可行性。方法构建hTERT基因的反义表达载体,经脂质体介导转染人未分化胃癌细胞系HGC-27,通过Southernblot检测外源反义基因的整合;RT-PCR及DNA测序法检测反义基因的转录;RT-PCR半定量方法检测被封闭目的基因mRNA的转录水平;TRAP及PCRELISA方法检测细胞的端粒酶活性;流式细胞仪检测细胞周期变化。结果外源反义hTERT基因已整合入细胞并获稳定转录,且能显著封闭目的基因转录的mRNA,并显著抑制HGC-27细胞的端粒酶活性,抑制HGC-27细胞的增殖并促进其凋亡。结论端粒酶反义hTERT基因可有效地应用于胃癌的基因治疗。     

逆转录病毒载体介导的HSV1—TK基因在人肾癌GRC—1细胞中 …

探讨ＨＳＶ１－ＴＫ基因在人肾癌ＧＲＣ－１细胞中表达的可能性及意义。方法采用基因工程技术构建带ＨＳＶ１－ＴＫ基因的逆转录病毒重组体Ｇ１Ｎ－ＴＫ、用脂质体法对人肾癌ＧＲＣ－１细胞进行转染及用新霉素筛选。结果成功克隆出ＨＳＶ１－ＴＫ基因的ＧＲＣ－１／ＴＫ细胞,并对无环鸟苷敏感。     

HSV-TK/ACV系统促肾癌细胞株GRC-1细胞凋亡的实验研究

目的：观察HSV－TK／ACV系统对肾癌GRC－1细胞的杀伤作用及旁观者效应。方法将含不同浓度的肾癌GRC－1／TK细胞与肾癌GRC－1细胞混合培养,分为4组,分别含GRC－1／TK细胞0％、25％、50％及100％,分别用无环鸟苷60μg/ml进行处理,观察细胞形态改变、测定活细胞数并行流式细胞术、电子显微镜检查。结果实验组与对照组GRC－1细胞均无明显变化;含25％以上GRC－1／TK细胞可观察到明显的杀伤作用,并有凋亡峰及凋亡小体形成。结论HSV－TK／ACV系统对肾癌GRC－1细胞具有明显的杀伤作用及旁观者效应,机制可与细胞凋亡有关。     

gp130在肾癌细胞系RCC-949中的表达缺陷

目的 探讨白细胞介素－６（ＩＬ－６）受体系统在肾癌细胞系ＲＣＣ－９４９中表达的意义。方法 应用免疫细胞化学方法检测肾癌细胞系ＲＣＣ－９４９中ＩＬ－６蛋白的表达,观察ｒｈＩＬ－６对ＲＣＣ－９４９生长的作用,用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法检测其ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ和ｇｐ１３０ ｍＲＮＡ的表达。结果 肾癌细胞系ＲＣＣ－９４９可以在转录和翻译水平表达ＩＬ－６,但该细胞系的ｇｐ１３０ ｍＲＮＡ表达     

先天耐药人肾细胞癌细胞系RCC—925的建立及其生物学特性

自原发性人肾细胞癌组织取材，行体外培养，经４年连续传代培养，建立了人肾细胞癌细胞系ＲＣＣ９２５。细胞为贴壁生长的上皮样细胞，生长稳定，接触抑制消失，有重叠生长。超微结构具有恶性细胞特征。细胞群体倍增时间为３３．２６小时，细胞分裂第三天达高峰，分裂指数为３５‰，平均集落形成率为５０．５％。染色体众数为６６～７５条，具有明显的超二倍体特征。裸鼠移植瘤形态与原手术瘤组织相似。对ＣｏｎＡ有高凝集反应。ＬＤＨ同功酶显示特征酶谱。细胞对长春新碱高度耐药，对阿霉素低度耐药，具有先天多药耐药性，ｍｄｒ１基因的ｍＲＮＡ水平呈高表达。     

肾母细胞瘤过表达基因和WT1基因在肾癌组织中转录水平的定量研究

目的 研究肾癌组织中肾母细胞瘤过表达基因（NOV）及WT1基因mRNA定量表达水平及意义。方法 肾癌组织标本57例。男40例，女17例，平均年龄65岁。T139例、T213例、T3a5例；G114例、G223例、G320例。应用实时RT—PCR方法定量检测癌组织及36例癌旁正常肾组织中NOV和WT1的mRNA表达，并对2种基因表达水平进行相关性分析。结果 肾癌组织NOVmRNA表达水平中位值（1．17）显著低于癌旁正常组织（4．32，P〈0．05），乳头状肾癌组织表达量（2．67）显著高于透明细胞癌（1．06，P〈0．05），G．肿瘤表达量（4．61）显著高于G2～G3肿瘤（1．11，P〈0．05）。NOV表达与肿瘤分期、大小等无显著相关。WT1mRNA在肾癌组织中的表达水平中位值（0．13）显著低于癌旁正常组织（1．93，P〈0．05），WT1表达与肿瘤分期、分级、组织类型等均无关。NOVmRNA与WT1mRNA表达水平无明显相关。结论 NOV基因与肾癌的发生和分化相关。WT1在肾癌组织中表现为低表达。NOV表达是否受WT1的调节尚需进一步研究。     

野生型MTS1基因导入对人膀胱癌细胞系生长抑制作用的研究

通过逆转录病毒载体将外源野生型ＭＴＳ１基因导入该基因功能丧失的人膀胱癌细胞系Ｔ２４中，结果发现，转染ＭＴＳ１基因的膀胱癌细胞的生长速率减低，流式细胞仪检测显示Ｓ期指数及增殖指数明显降低，电镜观察显示超微结构出现生长抑制特征，接种裸鼠无致瘤性。