脂肪源性干细胞促进大鼠受损坐骨神经传导及脊髓脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子的表达

目的:探讨脂肪源性干细胞(ADSCs)对坐骨神经损伤大鼠神经传导功能以及脊髓脑源性神经营养因子(BDNF)和睫状神经营养因子(CNTF)表达的影响。方法:将第4代ADSCs移植入脱细胞神经移植物(ANA)中,构建组织工程神经。大鼠随机分为正常组、杜氏改良Eagle培养基营养混合物F12(DMEM)组和ADSC组。DMEM组和ADSC组均建立坐骨神经损伤模型,后用相应的组织工程神经桥接损伤神经的断端。术后6周采用神经电生理记录仪检测各组大鼠坐骨神经传导速度和波幅,采用免疫荧光和Real-time PCR检测各组大鼠脊髓脑源性神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)蛋白和mRNA的表达。结果:ADSC组大鼠坐骨神经传导速度、波幅和脊髓BDNF和CNTF蛋白及mRNA表达均显著高于DMEM组。结论:ADSCs可增加坐骨神经传导速度和波幅、上调脊髓BDNF和CNTF的表达。     

大鼠坐骨神经压榨损伤后trkB、trkC在雪旺氏细胞内表达的变化

<正> 周围神经损伤后雪旺氏细胞可产生多种神经营养因子以促进受损神经元的存活;轴突再生与功能恢复.最近Ohnishi、Meyer等的研究表明雪旺氏细胞本身也受一些神经营养因子的影响:如BDNF可调节雪旺氏细胞的活性,促进其对新生轴突的髓鞘化;NT3、CNTF等对雪旺氏细胞的存活有一定的影响.本实验采用免疫组织化学的方法检测了BDNF与NT-3的高亲和性受体trkB、trkC在成年大鼠坐骨神经压榨损伤后的不同时期在雪旺氏细胞内表达的变化.动物右侧坐骨神经压榨损伤后分别存活5天、7天、14天、21天.经心灌注固定.在压榨损伤处近侧端与远侧端各取0.1cm长的神经,经后固定、浸糖后纵行冰冻切片.按ABC法做trkB、trkC受体的免疫组化反应.结果显示:在正常的坐骨神经雪旺氏细胞内trkB与trkC均有较强的表达.trkB在损伤后5天、7天在雪旺氏细胞内的表达稍有下降,在损伤后14天恢复到正常水平,远侧段与近侧段无明显差异.在损伤后21天雪旺氏细胞内trkB的表达明显增加,尤以远侧段为重.trkC在雪旺氏细胞内的表达在损伤后5天、7天与正常相比无明显差异,在损伤后14天表达明显增高,在损伤后21天远侧段的表达进一步增加     

睫状神经营养因子促进大鼠坐骨神经运动轴突再生

睫状神经营养因子(Ciliary Neurotrophic Factor,CNTF)作为神经营养因子家族一员,在神经系统发育和神经损伤修复过程中具有重要作用.但在周围神经再生时,睫状神经营养因子的作用如何,尤其是其对运动轴突、感觉轴突的作用,目前未见研究报道.本实验采用160～200克雄性SD大鼠,一侧作手术侧,另一侧不手术作正常对照侧.睫状神经营养因子组6只,生理盐水组5只.暴露股后部坐骨神经,切除约2mm长的坐骨神经,用硅管(内径1mm,外径2mm)套接神经断端,断端间距约5mm.睫状神经营养因子组术时将重组人睫状神经营养因子(25μg)溶液注入硅管中.生理盐水组所给液体为生理盐水.术后分别皮下注射睫状神经营养因子(350μg/kg/天)和生理盐水.术后4周,多点注射30%辣根过氧化物酶于两侧腓总神经中.动物再存活48小时,灌注固定,取脊髓L_(3～6)节     

同种异体脱细胞神经支架复合脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子转染骨髓间充质干细胞桥接受损坐骨神经

目的:探讨同种异体脱细胞神经支架(CEANA)复合脑源性神经营养因子(BDNF)和睫状神经营养因子(CNTF)转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)桥接修复周围神经缺损的优缺点及可行性。方法:取2只成年雄性犬的骨髓进行BMSCs的分离、培养。取传代培养的第3代细胞,采用电转法将重组表达载体pIRES-BDNF、pIRES-CNTF和pIRES-BDNF-CNTF转染至BMSCs。细胞转染后分成5组,采用反转录半定量PCR(RT-PCR)检测各组BMSCs的BDNF和CNTF的mRNA表达水平;采用免疫印迹检测其蛋白表达水平。取3只雄性实验犬,分离双侧坐骨神经,化学法制备CEANA。取15只雄性实验犬制备坐骨神经缺损模型,随机分为CEANA+BDNF组、CEANA+CNTF组、CEANA+BDNF+CNTF组、CEANA组(采用8cm CEANA端端吻合缺损的坐骨神经)、CEANA+BMSCs组。术后16周观察各组实验犬移植段神经横断面轴突数目、比目鱼肌的动作电位、双侧坐骨神经传导速度的差异。结果:手术后前3组实验犬的切口愈合良好。手术后第8周,前3组的髓鞘厚度、有髓神经纤维总数为CEANA+BDNF+CNTF组CEANA+CNTF组CEANA+BDNF组,CEANA+BDNF组和CEANA+CNTF组比较差异有统计学意义。结论:CEANA复合BDNF和CNTF转染BMSCs桥接移植修复犬坐骨神经缺损有良好的作用。     

NGF与CNTF对大鼠坐骨神经轴突再生的诱导趋化作用研究

目的：探讨神经生长因子（NGF）与睫状神经营养因子（CNTF）对大鼠坐骨神经轴突再生诱导趋化作用.方法：利用自行研制的梭形双通道乳胶管桥接大鼠坐骨神经10mm缺损段,并将50只SD大鼠随机分为5组.A组乳胶管的两支管内不加入任何物质;B组两支管内均加入医用几丁糖凝胶;C组两支管内注入医用几丁糖凝胶后,分别加NGF和CNTF;D组两支管内注入医用几丁糖凝胶后,分别加NGF和NGF＋CNTF;E组两支管内注入医用几丁糖凝胶后,分别加CNTF和NGF＋CNTF.术后3、4周观察两支管内神经定向趋化情况,并对术后4周再生神经行HE染色和超微结构观察.结果：A组和B组两支管内神经再生速度及超微结构无明显差异;C组术后3周再生神经优先向CNTF侧趋化,术后4周CNTF侧神经再生成功率和超微结构优于NGF侧（P＜0.05）;D组和E组,再生神经向NGF＋CNTF侧趋化,且再生成功率、HE染色和超微结构观察均显示,NGF＋CNTF侧再生神经的速度及质量优于对照侧.结论：CNTF较NGF对大鼠坐骨神经有较强的诱导趋化作用,而且两者间存在明显的协同作用.     

睫状神经营养因子调节受损视神经胶质细胞去分化相关基因的表达

目的 探讨睫状神经营养因子(CNTF)对受损视神经胶质细胞去分化的作用及机制.方法 将65只SD大鼠随机分为对照组、损伤组和CNTF组,制备视神经损伤及损伤后添加CNTF的动物模型.术后7、14 d取术侧视神经损伤远侧段,分别用基因芯片检测其基因表达谱,实时荧光定量PCR、免疫组织化学、HE染色等方法检测相关基因、蛋白表达和细胞数量的变化.结果 术后7 d,与损伤组相比,CNTF组筛选出608条表达上调和417条表达下调的差异基因,包括染色质构型、转录调节、神经干细胞、神经分化和发育、增殖凋亡、离子通道、受体、信号转导等相关基因.实时荧光定量PCR结果验证了基因芯片结果的可靠性.CNTF组视神经损伤远侧段细胞数量增多,远侧段Nestin、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、细胞外信号调节激酶1/2(Erk1/2)和近侧段神经丝(NF)阳性物质增多.结论外源性CNTF通过调节受损视神经大胶质细胞的去分化相关基因及蛋白的表达,促进了胶质细胞的去分化和轴突再生.     

重组睫状神经营养因子对受损周围神经施万细胞相关基因表达的作用

目的研究重组睫状神经营养因子(CNTF)对受损周围神经施万细胞基因表达的作用。方法用硅管套接切断的大鼠坐骨神经，在受损神经局部给予重组CNTF，术后用免疫组织化学ABC法结合计算机图像分析观测S100蛋白(S100)、生长相关蛋白-43(GAP-43)、磷酸化酪氨酸(PTyr)、信号转导子和转录激活子(STAT)3的免疫反应阳性物质在修复侧远段神经的分布和相对含量。结果CNTF组修复侧远段神经相应区域S100、GAP-43、PTyr、STAT3阳性物质的含量显著或非常显著高于生理盐水组。结论重组CNTF能上调受损神经施万细胞S100、GAP-43、PTyr和STAT3的表达，提示重组CNTF通过强化受损神经施万细胞JAK-STAT途径，E调其S100和GAP-43的基因表达。     

长时间坐骨神经横断伤后远侧端雪旺氏细胞活性变化

目的:研究坐骨神经长时间损伤不同时间后远侧端雪旺氏细胞(Schwann cells,SCs)的活性变化。方法:根据坐骨神经横断时间,SD大鼠分4组:正常对照组(A组)、损伤1月组(B组)、损伤2月组(C组)和损伤3月组(D组)。取坐骨神经损伤远侧端和正常坐骨神经进行SCs培养;S-100免疫细胞化学染色等形态学观察细胞形态;应用CCK8试剂检测SCs活力;ELISA定量检测SCs分泌的神经生长因子(nerve growth factor,NGF);以神经元的突起长度为指标来检测各组SCs来源的条件培养液对运动神经元的营养作用。结果:坐骨神经损伤后,其远侧端SCs形态发生改变,其中B组最明显;B组SCs活力最强,C、D组与B组相比均明显下降(P<0.05);SCs分泌的NGF量随着损伤时间的延长而逐渐下降(P<0.05);B组SCs来源的条件培养基中生长的神经元突起长度最长,C、D组与B组相比均短(P<0.05)。结论:周围神经长时间损伤后远侧端SCs发生了形态的改变;其细胞活力,分泌NGF以及促进神经元突起生长方面的能力都发生下降,但并未完全随着损伤时间延长而进一步下降。     

睫状神经营养因子对大鼠去神经骨骼肌的营养作用

目的：通过测定SD大鼠坐骨神经离断后比目鱼肌（SOL）和趾长伸肌（EDL）肌纤维横截面积,观察持续给睫状神经营养因子（CNTF）对神经骨骼肌萎缩的影响。结果：SD大鼠坐骨神经离断后,持续给0．2mg/kg.d的CNTF20天后,损伤侧SOL和EDL肌纤维横截面积分别比实验对照组高27％（P＜0．01）和14％,SOL肌纤维横截面积比EDL增加的幅度大,而给予0．05mg/kg.d的CNTF20天后,动物肌纤维横截面积与实验对照组无明显差异。结论：CNTF可显著改善坐骨神经离断后SD大鼠骨骼肌的萎缩,并且CNTF效应的强弱与用药剂量和肌肉类型有关,0．2mg/kg.dCNTF作用明显强于0．05mg/kg.dCNTF,慢肌（SOL）比快肌（EDL）对CNTF更敏感。     

周围神经65KD蛋白在损伤性大鼠坐骨神经中的表达

目的：研究周围神经６５ＫＤ蛋白在损伤性大鼠坐骨神经中的分布与表达。方法：取损伤１５ｄ后的大鼠坐骨神经近侧端及远侧端,冰冻切片,与抗６５ＫＤ蛋白单克隆抗体与切片孵育后,加羊抗小鼠ＩｇＧＨＲＰ,ＤＡＢ反应成色。结果：大鼠坐骨神经远侧端及近侧端中均有６５ＫＤ蛋白阳性免疫反应产物,阳性免疫反应产物位于雪旺氏细胞。阳性免疫反应产物的密度及强度在神经的远侧端大于近侧端。结论：神经诱向因子６５ＫＤ蛋白由雪旺氏细胞产生。在损伤后神经近、远侧端都存在６５ＫＤ蛋白,远侧端的强度大于近侧端,这一浓度梯度可能是诱导再生的神经纤维定向生长过程中的一个重要因素。     

重组人睫状神经营养因子对大鼠坐骨神经再生长的影响

目的: 观察重组人睫状神经营养因子(CNTF)对大鼠坐骨神经再生长的影响,并与神经生长因子(NGF)的作用进行比较。方法: 随机将动物分成正常对照组、模型组、CNTF给药小剂量组(48 μg/kg)、中剂量组(216 μg/kg)、大剂量组(1 080 μg/kg)、NGF 给药组(20 μg/kg),每组各10只。模型组采用大鼠坐骨神经切断再缝合法造成坐骨神经损伤模型,给药组采用不同药物剂量对神经损伤部位肌肉注射给药45 d后,测定神经动作电位潜伏期和传导速度。结果: 与模型组相比较,CNTF各给药组神经动作电位潜伏期显著缩短(P<0.01),传导速度显著增快(P<0.01);同时,216 μg/kg、1 080 μg/kg CNTF组和NGF组对神经动作电位潜伏期的影响无显著差别(P>0.05),但是216 μg/kg、1 080 μg/kg CNTF组的神经动作电位传导速度比NGF组显著增快(P<0.01)。结论: CNTF对大鼠坐骨神经再生具有一定的促进作用,而且其作用可能优于NGF。     

pro-BDNF在初级感觉神经元内的顺行和逆行输送

摘　要　研究表明脑源性神经营养因子(BDNF)在神经元内可顺行运输至末梢并释放到下一级神经元参与突触可塑性等功能。而成熟的BDNF由其前体分子(pro -BDNF)经蛋白酶水解形成。体外研究表明pro -BDNF可以激活神经营养因子受体TrkB并导致TrkB的磷酸化,但pro -BDNF在体内的作用目前仍不清楚。本文拟探讨内源性pro -BDNF在周围神经的运输。将大鼠坐骨神经结扎或压榨背根制成模型,动物存活不同时间后取坐骨神经、背根神经节和脊髓进行pro -BDNF免疫组织化学染色检测。结果显示:pro- BDNF免疫阳性产物沉积于坐骨神经和背根损伤处的近侧端和远侧端, 24h达高峰,近侧端可持续达 7d而远侧端可达3d;在坐骨神经的近侧端和远侧端、背根神经节和脊髓可检测到全分子量大小的完整pro -BDNF;在转染pro- BDNF质粒后,PC12细胞内可见pro -BDNF免疫阳性产物分布于胞体和突起。这些结果提示pro- BDNF可以象成熟BDNF一样在感觉神经内顺行和逆行运输,并可由神经元分泌、释放而发挥生理作用。     

生长相关蛋白及其mRNA在大鼠损伤坐骨神经中的表达

为了研究大鼠周围神经损伤后远侧端组织中生长相关蛋白 (GAP-4 3 )及其 m RNA的表达 ,采用正常 SD大鼠坐骨神经横断损伤的模型 ,于术后不同时间取坐骨神经远侧端组织 ,以 Western Blot和 RT-PCR法检测 GAP-4 3及其 m RNA的表达。RT-PCR法检测结果显示 ,正常大鼠坐骨神经组织中 GAP-4 3 m RNA表达量较低 ,而损伤坐骨神经的远侧段 GAP-4 3 m RNA的表达量明显增加 ,于损伤第 2周时达高峰。用抗 GAP-4 3抗体进行 Western Blot检测 ,结果表明 ,正常坐骨神经 43 k Da处出现弱阳性反应的蛋白区带 ,而损伤后坐骨神经远侧段 43 k Da处阳性反应条带着色明显加深 ,损伤后第 3周时阳性反应着色最强。本研究结果提示 ,GAP-4 3及其 m RNA在大鼠损伤坐骨神经远侧段组织中表达增强 ,其 m RNA表达上调高峰在神经损伤后的第 2周 ;而其蛋白合成增加最为明显的时间是在神经损伤后的第 3周。     

生长相关蛋白在损伤坐骨神经中的表达

目的：研究大鼠周围神经损伤与再生过程中生长相关蛋白的表达。方法：取正常SD大鼠坐骨神经和离断损伤后不同时间近侧端和远侧端神经组织，采用Anti-GAP－43抗体以Western blot方法检测GAP－43的表达变化。结果：NC膜上43kDa位置出现阳性反应条带，在正常坐骨神经中反应微弱，损伤后明显加强，随损伤时间延长，神经近侧端的反应无明显改变，神经元侧端的反应逐渐加强，以第3周为最强，之后逐渐减弱，结论：GAP－43在正常坐骨神经中低表达，损伤后近侧端与远侧端表达均增加，远侧端的表达增加以第3周为高峰。     

神经营养因子(NGF、NT-3、BDNF及CNTF)和受体trkA、trkB、trkC在正常大鼠脊髓和胳鼠脊髓移植体的免疫组织化学研究

本研究采用免疫组织化学方法观察了NGF家族（NGF、NT－3、BDNF）和非NGF家族的CNTF以及NGF家族因子受体trkA、trkB、trkC在正常大鼠脊髓腰段的分布和胎鼠脊髓移植体在移植后4周的表达。在正常大鼠脊髓腰段,各神经营养因子及受体反应物主要存在于脊髓灰质,特别是前角的运动神经元。但在脊髓后角的分布稍有不同,BDNF阳性细胞的胞浆染色较深,胞核不染色;而NT－3的胞核染色较胞浆为深,核仁不染色。在胎鼠脊髓移植体,NGF、BDNF、CNTF和NT－3及受体trkA、trkB、trkC均有不同程度的染色。本实验结果揭示了在正常大鼠脊髓神经元内各神经营养因子及受体的表达,提示神经营养因子除具有靶源性来源以外,还有神经元自分泌的产物。而在胎鼠移植体内和其周围组织神经营养因子及其受体的表达,可能是在移植体内的移植细胞自分泌和成鼠脊髓损伤的刺激所引起的,这在移植体的存活和发育中有重要作用。     

运动神经营养因子给药途径研究

给药途径问题是神经营养因子临床应用所临的许多尚待解决的问题之一，本实验用自制具有显著运动神经营养活性的胚胎肢芽提取法，在乳鼠坐骨神经怕动物模型上，研究对比了损伤远隔部位肌肉注射和损伤局部注射两种给药途径地创伤性运动神经元死亡的保护效果，结果是：损伤侧脊髓前角运动神经元存活率，远隔肌内注射组为４８．６％，损伤局部注射组为７９．２％，生理盐水组为２３．７％，此结果提示：神经营养因子作为药和用于防止创伤     

不同损伤模型内源性BDNF在背根节和损伤脊髓中的表达及其作用

目的:探讨不同损伤模犁中脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophin,BDNF)在背根节(dorsal rootganglion,DRG)和损伤脊髓的表达及作用.方法:建立单纯坐骨神经损伤模型、单纯脊髓背索损伤模型以及合并损伤(坐骨神经损伤1周后冉损伤脊髓背索)模型,用免疫荧光组织化学方法和酶联免疫吸附实验(ELISA)方法观察不同模型中BDNF在DRG和损伤脊髓的表达,从脊髓损伤处嘴侧5mm处注入快蓝(Fast Blue,FB)以逆行标记DRG中感觉神经元,并结合FB逆行示踪观察FB阳性神经元BDNF的表达情况.结果:坐骨神经损伤1周后损伤侧的腰4、5背根节中BDNF蛋白表达上调.与单纯脊髓损伤组相比,合并损伤组在脊髓损伤的尾侧端可见较多的BDNF阳性纤维,这些纤维呈膨体样结构,主要分布于坐骨神经损伤侧脊髓尾侧端的白质里,合并损伤组FB标记的感觉神经元数目也较单纯脊髓损伤组多,且大部分FB标记的感觉神经元是BDNF阳性的神经元.结论:坐骨神经损伤后内源性的BDNF在DRG和损伤脊髓中表达上调,可能参与坐骨神经损伤引起的脊髓损伤后再生过程.     

重组睫状神经营养因子对周围神经再生中多种细胞的作用

为了解重组睫状神经营养因子 ( CNTF)对周围神经再生中多种细胞的作用 ,用硅管套接切断的成年大鼠坐骨神经 ,在受损神经局部一次性给予重组睫状神经营养因子 :用免疫组织化学 ABC法结合计算机图像分析观测再生神经中 GAP-4 3、S10 0、CD68、MHC- 免疫反应阳性物质的变化。与生理盐水对照组相比 ,证明 CNTF组再生神经中上述四种物质显著增多。结果提示重组睫状神经营养因子能促进轴突的再生、Schwann细胞的迁入、单核细胞的渗出和活化     

肌源神经营养因子(MDNF)对体外培养大鼠脊髓运动神经元划伤后Bcl-2表达的影响

为检测大鼠肌源神经营养因子对体外培养大鼠脊髓运动神经元划痕损伤后 Bcl-2表达的影响 ,本实验从成鼠和乳鼠骨骼肌中提取出肌源神经营养因子。在胎鼠脊髓运动神经元培养第 7d时将其随机分成对照组和实验组 (成鼠组和乳鼠组 ) ,取 10 0μl肌源神经营养因子 ( 0 .1μg/ ml)加入实验组 ,对照组加入等量的 PBS,同时进行划痕损伤。损伤后第 3d计数各组存活的运动神经元 ,行 Nissl染色和免疫组化反应 ,计数 Bcl-2免疫反应 ( Bcl-2 -IR)阳性神经元数量 ,并在图像分析仪上对 Bcl-2 -IR阳性神经元作光密度分析。结果发现 ,损伤后第 3d,实验组运动神经元存活数 ,Bcl-2 -IR阳性神经元数和平均光密度均明显高于同期对照组 ,而乳鼠肌源神经营养因子组功效优于成鼠肌源神经营养因子组。结果提示 ,大鼠肌源神经营养因子对体外培养的受损运动神经元具有增强 Bcl-2表达、减少凋亡和损伤修复等作用 ,且乳鼠的此因子效能尤佳     

胎鼠肢芽提取液生物活性研究

目的：从胎鼠肢芽中提取运动神经元具有生物活性的神经营养因子，方法：用Ｗｉｓｔａｒ大鼠第１５天胎鼠肢芽制备提取液，以成年Ｗｉｓｔａｒ大鼠骨骼肌提取液及生理盐水对对照，在切断坐骨神经的乳鼠动物模型上，检测其运动神经营养活性，用ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电脉对两种提取液组份进行对比。结果：术后３０天损伤侧相应的腰髓运动神经元存活率，注射肢芽提取液组为７９．２％，成体骨骼肌提以液组为４２．１％，生理盐水组为２