反义大鼠凝血酶受体基因的构建及其对主动脉血管平滑肌细胞 …

凝血酶激活凝血酶受体引起的一毓细胞事件和内源性ＰＤＧＦ－Ａ,ｂＦＧＦ的产生可能是血管病变发生发展过程中平滑肌细胞增生的机理及探索有效治疗途径,针对凝血酶受体 一段洋起始点,翻译起始点,凝血酶结合和切位点的序列作为靶序列,了凝血酶受体反义ＲＮＡ重组表达载体ＰＬＸＳＮ／ＡＴＲ,并将甚地入凝血酶刺激的动脉平滑肌细胞,结果 组基因转染能掏凝血酶对大鼠有肌细胞ＤＮＡ合成的刺激作用。提示序列特异的凝血酶受体反     

双基因共表达在血管再狭窄研究中的应用

目的 观察携带反义凝血酶受体(ATR)和p21的双基因载体共表达后对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用，为再狭窄基因治疗寻求新途径。方法 以携带ATR或/和p21的单、双基因载体重组腺病毒伴随病毒(rAAV)感染培养的人主动脉平滑肌细胞(hASMC)，用半定量RT-PCR检测各基因的整合与表达，MTT法测定病毒感染后不同时间点的细胞存活率。将携带AP双基因的rAAV导入WKY大鼠拉伤侧的颈总动脉，免疫组织化学法分别检测凝血酶受体(TR)和p21两基因在动脉壁中的表达。结果 RT-PCR结果显示，TR单基因的mRNA表达降低，p2l单基因表达升高，AP双基因得到了共表达；MTT法测定的生长曲线显示，双基因对hASMC增殖的抑制作用大于两个单基因；免疫组织化学证实，AP双基因导入后，TR基因的表达受到完全抑制，p2l基因的表达明显增加，血管新生内膜与平滑肌细胞的增殖受到了抑制。结论 ATR和p21双基因共表达在体外可明显抑制ASMC的增殖，在体内可明显抑制血管内膜新生和中膜的增生。     

反义凝血酶受体基因表达抑制大鼠动脉内膜损伤后内膜增生

目的 了解凝血酶及其受体在血管损伤后动脉内膜增生中的作用,以进一步阐明经皮冠状动脉血管腔内成形术（PTCA）后再狭窄的发生机制,为寻找再狭窄的防治途径提供线索。方法 采用球囊导管损伤动脉内膜的方法建立大鼠颈动脉球囊损伤模型。用纳米粒子包装凝血酶受体重组反义基因质凿pLXSN/ATR,用保护灌注的方法局部定位转染损伤后的大鼠颈动脉。结果 PCR检测发现重组基因整合,RNA斑点杂交观察到实验组大鼠颈动脉壁内有重组反义凝血酶受体基因表达,正义凝血酶受体基因的表达受到明显抑制,反义基因转染组新生内膜,中膜比例降低了40．9％。结论 反义凝因酶受体重组基因转基因表达对大鼠颈动脉球囊损伤后动脉内膜的增生具有抑制作用,提示凝血酶及其受体在PTCA后再狭窄过程中有重要作用,为再狭窄的防治提供了新的线索。     

骨桥蛋白反义核苷酸对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

背景:骨桥蛋白在血管损伤后新生内膜中的表达明显上调,而且能促进血管平滑肌细胞和外膜细胞的增殖、迁移。目的:探索骨桥蛋白反义核苷酸对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响。方法:培养大鼠A10主动脉血管平滑肌细胞,通过MTT比色法测定骨桥蛋白反义核苷酸对平滑肌细胞增殖的影响,流式细胞仪测定骨桥蛋白反义核苷酸对平滑肌细胞周期分布的影响;通过RT-PCR方法检测血管平滑肌细胞转染骨桥蛋白反义核苷酸对增殖细胞核抗原表达的影响。结果与结论:骨桥蛋白反义核苷酸对血管平滑肌细胞的增殖有明显的抑制作用,随时间延长对细胞增殖抑制率下降。骨桥蛋白反义核苷酸主要作用于G1/S限制点,能阻止血管平滑肌细胞由G0/G1期向S期推进,从而将血管平滑肌细胞阻滞于G0/G1期,抑制血管平滑肌细胞的增殖。血管平滑肌细胞转染骨桥蛋白反义核苷酸后,增殖细胞核抗原的表达水平均较对照组降低(P0.05)?因此,得出骨桥蛋白反义核苷酸通过阻止血管平滑肌细胞由G0/G1期向S期推进,从而抑制血管平滑肌细胞的增殖,进而抑制血管内膜增生。     

内皮素-内皮素受体在凝血酶促进血管平滑肌细胞增殖中的作用

目的 :探讨凝血酶引起血管平滑肌细胞增殖是否通过内皮素 内皮素受体途径介导。方法 :在培养的鼠主动脉平滑肌细胞中 ,加入不同浓度的凝血酶培养 2 4h ,放免法观察细胞和培养液中内皮素的浓度 ;然后观察内皮素受体A和B阻滞剂对凝血酶促进平滑肌细胞增殖( 3 H TdR掺入 )的抑制作用。结果 :凝血酶可剂量依赖地引起血管平滑肌细胞培养液中内皮素的含量明显增加 ,内皮素受体A阻滞剂可明显抑制凝血酶诱导的血管平滑肌细胞增殖 ,而内皮素受体B阻滞剂无作用。结论 :凝血酶可剂量依赖地引起血管平滑肌细胞内皮素的合成和释放 ,内皮素受体A阻滞剂可部分阻断凝血酶诱导的血管平滑肌细胞增殖 ,凝血酶引起血管平滑肌细胞增殖的延迟作用可能与此有一定关系。     

应用基因重组和基因转移技术抑制血管平滑肌细胞增生的研究进展

应用基因重组和基因转移技术抑制血管平滑肌细胞增生的研究进展梁红佘铭鹏平滑肌细胞增生是动脉壁对刺激的反应。动脉内膜平滑肌细胞增生和表型转换是动脉粥样硬化形态学的主要特征之一，在动脉粥样硬化的发生中起着极重要的作用。动脉再狭窄，严重地影响诸如经皮冠状动脉...     

腺病毒介导hRAMP1基因转染血管平滑肌细胞的增殖和凋亡

背景：外源性受体活性修饰蛋白1基因转染可能对血管平滑肌细胞增殖调控具有重要的作用。 目的：探讨腺病毒载体介导人受体活性修饰蛋白1基因对体外培养的兔血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响。 方法：分离培养获得兔主动脉血管平滑肌细胞,分别以携带人受体活性修饰蛋白1基因的腺病毒和空腺病毒转染后,分成人受体活性修饰蛋白1组、空病毒组和对照组。 结果与结论：腺病毒转染细胞后随时间延长,报告基因绿色荧光蛋白表达逐渐增加,72 h表达最强,感染率达80%,96 h时仍有绿色荧光蛋白表达。人受体活性修饰蛋白1组的受体活性修饰蛋白1蛋白表达增加,血管平滑肌细胞凋亡率增加,细胞增殖明显抑制,与空病毒组和对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。提示人受体活性修饰蛋白1基因感染血管平滑肌细胞后明显抑制血管平滑肌细胞增殖,促进细胞凋亡。     

凝血酶及其受体在PTCA术后再狭窄形成中的作用

ＰＴＣＡ术后，受损伤动脉局部凝血酶产生增加，凝血酶受体表达上调，可促进局部血小板性血栓形成，促进血管平滑肌细胞的增殖，增加其他生长因子如ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ等的产生及其促血管平滑肌细胞增殖作用。对抑制凝血酶生成、抑制其活性或阻断其受体等措施的进一步研究，可为ＰＴＣＡ术后再狭窄的预防提供有效方法。     

转染PDGF-B反义核酸和tPA基因预防狗冠脉搭桥术吻合口再狭窄

目的： 探讨联合应用组织型纤溶酶原激活物（tPA）基因质粒和血小板源性生长因子（PDGF-B）反义核酸预防冠状动脉搭桥术后吻合口再狭窄。方法： 建立狗冠状动脉搭桥术吻合口再狭窄模型，构建tPA基因质粒并设计合成（PDGF-B）反义寡核苷酸，在冠状动脉搭桥术同时以超声波辅助转染心肌细胞和吻合口血管平滑肌细胞，采用常规病理、免疫组织化学、原位杂交以及形态测量方法观察对吻合口局部血栓形成、血管内膜细胞增殖细胞核抗原（PCNA）和PDGF-B mRNA表达以及内膜增生的影响。结果： 成功转染tPA基因和（PDGF-B）反义核酸；2种基因联合应用显著抑制血管内膜细胞表达PCNA和PDGF-B mRNA，抑制率分别为65.01%和81.75%；显著减少局部血管内膜厚度、内膜面积和吻合口血栓形成，使吻合口狭窄率显著减少62.63%。结论： 联合转染tPA表达质粒和PDGF-B的反义寡核苷酸在一定程度上抑制猪实验性冠状动脉搭桥术后吻合口再狭窄。     

慢病毒载体构建小鼠CMKLR1基因缺陷性血管平滑肌细胞系

背景：趋化素在动脉粥样硬化时的表达水平上调,趋化素及其受体CMKLR1可能参与了动脉粥样硬化的病理过程。 目的：建立CMKLR1基因缺陷性小鼠血管平滑肌细胞株。 方法：以小鼠CMKLR1基因mRNA序列作为干扰靶点,设计3组靶向CMKLR1基因的shRNA序列,构建慢病毒载体,筛选出干扰最佳的shRNA,在293T细胞对慢病毒进行包装和滴度测定。体外培养小鼠血管平滑肌细胞,转染慢病毒形成CMKLR1基因缺陷性血管平滑肌细胞株,用real-time PCR检测感染慢病毒后细胞中CMKLR1 mRNA水平。 结果与结论：基因测序结果表明慢病毒载体构建成功,慢病毒的滴度约为8.7×10⁶ TU/mL,pLVX-shRNA3对CMKLR1基因的抑制效果最显著(P < 0.001)。将pLVX-shRNA3转染至血管平滑肌细胞中形成基因缺陷细胞株,用real time PCR血管平滑肌细胞中CMKLR1 mRNA水平,该细胞株中CMKLR1 mRNA水平显著下降(P < 0.001),表明慢病毒介导的siRNA可有效沉默小鼠血管平滑肌细胞中CMKLR1基因的表达。     

趋化因子受体CCR5反义RNA在真核细胞中的表达

目的 构建趋化因子受体CCR5反义RNA真核表达载体并获取重组假病毒颗粒以用于抗HIV-1研究，方法 用RT-PCR法从健康人外周血单个核细胞（PBMCs)中获得趋化因子受体CCR5翻译起始区的基因片段，并以正、反两个方面定向插入到真核表达载体pLXSN上，重组载体用脂质体转染剂（lipofectAMINE)转染PA317包装细胞，抗-G418克隆的细胞上清经逆转录后用荧光定量PCR（FQ-PCR）测定假病毒滴度，进一步感染NIH/3T3细胞。结果 CCR5正、反义RNA的真核表达载体。经PA317细胞包装形成的假病毒颗粒已成功地感染NIH/3T3细胞，目的基因在该细胞中得到整合与表达。结论 从PBMCs中获得的趋化因子受体CCR5基因片段通过逆转录病毒载体可转移至真核细胞中并得到表达，为进一步研究CCR5反义RNA的抗HIV-1作用奠定了基础。     

P物质对气道平滑肌细胞增殖的调节作用

目的：观察Ｐ物质对犬气道平滑肌细胞增殖的调节作用。方法：以第四代ＡＳＭＣ为研究对象,分别以ＳＰ和「Ｓａｒ＾９,Ｍｅｔ（Ｏ２）＾１１」－ＳＰ（ＮＫ－１受兴奋剂）刺激,观察两者对细胞增殖的影响。又分别以ＧＲ ７１２５１（ＮＫ－１受体拮抗剂）,新霉素「磷脂酶Ｃ（ＰＬＣ）抑制剂」和尼群地平为干预因素,观察它们对ＳＰ作用的影响。     

beta-hexosaminidase-induced activation of p44/42 mitogen-activated protein kinase is dependent on p21Ras and protein kinase C and mediates bovine airway smooth-muscle proliferation.

Late-phase and sustained activation of p44/42(MAPK) has been reported to be a critical factor in cell mitogenesis. We therefore hypothesized that p44/42(MAPK) is involved in mannosyl-rich glycoprotein-induced mitogenesis in bovine airway smooth-muscle cells (ASMC). Treatment of adherent ASMC with beta-hexosaminidase A (Hex A, 50 nM), an endogenous mannosyl-rich glycoprotein, resulted in a late-onset (30-min) activation of p44/42(MAPK) that lasted for 4 h. Activation of p44/42(MAPK) induced by Hex A was inhibited by an 18-mer phosphorothioate-derivatized antisense oligonucleotide (1-5 microM) directed to human p44(MAPK); the mitogen-activated protein kinase kinase (MEK1) inhibitor PD98059 (5 microM); the p42(MAPK) inhibitor Tyrphostin AG-126 (0.2 microM); the farnesyl transferase inhibitors SCH-56582 (10 microM) and FPT III (10 miroM), which inhibit p21Ras activation; and Calphostin C (0.2 microM), an inhibitor of protein kinase C. These agents also inhibited Hex A-induced cell proliferation in bovine ASMC. These data suggest that Hex A activates p44/42(MAPK) in a p21Ras- and PKC-dependent manner and that this activation mediates Hex A- induced mitogenesis in bovine ASMC.     

血管内皮生长因子及其受体2与被动致敏的人气道平滑肌细胞增殖相关性研究

目的探讨血管内皮生长因子（VEGF）及其受体2（KDR）在被动致敏的人气道平滑肌细胞（ASNC）中表达变化及其对ASMC增殖的影响。方法培养人ASMC，用支气管哮喘病人血清被动致敏ASMC。用免疫组织化学技术检测ASMC增殖细胞核抗原（POJA）的表达，MTT法检测细胞代谢活性及流式细胞仪分析细胞周期；用RT-PCR及Western blot方法分别检测VEGF和KDR mRNA及蛋白质在不同组人ASMC的表达程度。结果（1）被动致敏组ASMC较对照组和干预组增殖显著增加（P〈0．05）。（2）被动致敏组ASMC的VEGF121、VEGF165和VEGF189的mRNA表达分别较对照组和干预组显著增加（P〈0．05或P〈0．01）。（3）被动致敏组ASMCVEGF及KDR蛋白质的表达较对照组和干预组显著增加（P〈0．05）。直线相关性分析显示，ASMC中PCNA表达与ASMC中VEGF121、165、189及KDRmRNA表达水平呈正相关（r分别为0．73、0．82、0．77、0．70，P〈0．05）；ASMC中PCNA表达与ASMC中VEGF及KDR蛋白质表达水平也呈正相关（r分别为0．69、0．67,P〈0．05）。结论被动致敏的ASMC中VEGF及其受体KDR表达上调。并与ASMC增殖密切相关。该结果提示VEGF及其受体2可能参与了哮喘气道重建中ASMC增殖的过程。     

血小板活化因子对大鼠气道平滑肌细胞的促增殖作用

目的：研究血小板活化因子(platelet-activating factor, PAF)对离体培养的大鼠气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cell, ASMC)增殖的影响。方法： 离体培养大鼠气道平滑肌细胞，细胞分为对照组、PAF组；后者又 分为10-6、10-7、10-8、10-9 mol·L-1 4小组，MTT(四唑盐)比色法检测细胞增殖活力并确定PAF最佳作用浓度；用最佳作用浓度刺激ASMC 12 h、24 h、36 h以流式细胞仪测定细胞周期，免疫细胞化学染色(SABC 法)检测该PAF刺激48 h后细胞核增殖抗原(PCNA)的表达。 结果： PAF在10-6-10-9 mol·L-1范围内均能促进ASMC的增殖(P<0.01)，且10-7 mol·L-1时增殖作用最强；用这一最佳浓度的PAF干预12 h后，G0/1期细胞百分比(68.67%)明显低于对照组(85.57%)(P<0.01)；PCNA免疫细胞化学染色发现10-7mol·L-1的PAF作用48 h后，ASMC的PCNA表达率为(71.05±1.22)%，显著高于对照组(53.27±2.56)% (P<0.05)。结论： PAF能以时间依赖方式促进ASMC的增殖，但该作用并不表现为浓度依赖性。     

1,25-二羟基维生素D3协同转染反义端粒酶RNA诱导肝癌细胞凋亡的实验研究

目的观察在抑制肝癌细胞端粒酶活性表达情况下,1,25-二羟基维生素D3(1,25-VD3)对肝癌细胞凋亡的影响。方法经脂质体介导,将反义端粒酶RNA真核表达载体pBBS212/hTR导入维生素D3受体(VDR)阳性的肝癌细胞株SMMC7721细胞中培养。细胞克隆转移扩大培养,将其分为对照组、药物组、转染组和转染药物组。添加1,25-VD3,分别作用于转染药物组、药物组,用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)和电子显微镜检测肝癌细胞凋亡。结果转染组和对照组细胞的端粒酶活性分别为0.686和1.685,说明反义端粒酶RNA可显著降低肝癌细胞端粒酶活性。对照组、药物组、转染组和转染药物组细胞凋亡率分别为3.4%、12.2%、8.8%、23.6%;差异有显著统计学意义(P<0.01)。超微结构检查也证实存在凋亡发生。1,25-VD3或转染反义端粒酶RNA对肝癌细胞有促细胞凋亡作用,两者协同对肝癌细胞凋亡作用显著增强。结论转染反义端粒酶RNA,可降低肝癌细胞端粒酶活性,可显著增强1,25-VD3对肝癌细胞的促凋亡作用,并且对细胞的增殖也存在明显的抑制作用。     

反义CD40RNA对EB病毒转化的B细胞CD40分子表达和增殖能力的影响

目的 :探讨瞬时表达的反义CD4 0RNA ,对EB病毒转化的健康人B细胞膜表面CD4 0分子表达和增殖能力的影响。方法 :应用T A克隆技术和亚克隆技术 ,构建人反义CD4 0RNA的真核表达载体pcDNA3/CD4 0 ,并以其转染本室建立的EB病毒转化的健康人B细胞。应用流式细胞仪 (FACS) ,检测B细胞膜上CD4 0分子表达的变化。应用MTT比色法检测反义CD4 0RNA对B细胞增殖能力的影响。结果 :与转染空载体pcDNA3组相比 ,转染pcDNA3/CD4 0细胞上CD4 0分子的表达降低 (P<0 .0 1) ,其增殖能力明显降低 (P <0 .0 1)。结论 :反义CD4 0RNA技术 ,可作为有效的免疫调控手段。CD4 0基因本身在细胞的生长代谢中也起着重要作用