脐带间充质干细胞在不同培养体系条件下的生物学特性

背景：体外培养的脐带间充质干细胞在不同培养体系下生长状态差异显著,因此选取一种更适合的培养基相当必要。目的：对比观察人脐带间充质干细胞在3种培养基中的生长增殖情况,并检测细胞免疫表型以及间充质干细胞的诱导分化能力。方法：在无菌条件下用贴块法收获人脐带间充质干细胞,用T75培养瓶培养传代后,取第3代脐带间充质干细胞分别种入到含体积分数为5%胎牛血清的DMEM/F12培养基、含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和Mesen PRO RSTM培养基中,培养第1,3,5,7天进行细胞计数,绘制细胞生长曲线。采用流式细胞仪分析第3代脐带间充质干细胞免疫表型,并检测其成骨及成脂肪诱导分化能力。结果与结论：培养出的第3代人脐带间充质干细胞高表达CD44、CD73、CD90、CD105,不表达CD29、CD31、CD34、HLA-DR。经成脂诱导后,油红O染色可见胞浆中有大量红色小脂滴;成骨诱导后,茜素红染色后镜下可见成骨样细胞团,说明脐带间充质干细胞在体外具有多向分化的潜能。在倒置显微镜下观察可见含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中的细胞集落密集,形态均匀,而其他2种培养基中的细胞集落密集程度和形态都不如前者好。在培养传代细胞时,可优先选择含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。     

人血小板裂解液替代胎牛血清大规模扩增人脐带间充质干细胞

背景：目前国内外大多数实验仍采用经典的培养基和胎牛血清进行脐带间充质干细胞培养,血清培养潜在的不安全因素限制了未来临床应用的可行性。目的：以人血小板裂解液替代胎牛血清培养、鉴定人间充质干细胞,以期进一步应用于临床低密度扩增人间充质干细胞。方法：人血小板裂解液通过反复冻融、离心、过滤、浓缩等方法制备。以 IMDM 为基础培养基,添加5%浓缩血小板裂解液作为实验组培养基;以添加体积分数10%胎牛血清为对照组培养基。采用酶消化法分离培养人脐带间充质干细胞,以3000/cm2的浓度进行传代培养,待细胞扩增至P5代后,进行细胞形态与直径、免疫表型、成骨成脂分化、克隆形成率等细胞生物学特性检测,并比较两者之间的差别。结果与结论：人血小板裂解液扩增的脐带间充质干细胞形态细长,有更高的细胞累积群倍数;克隆形成检测结果显示两者形成的克隆效率差异无显著性意义,流式细胞术检测结果显示两者有相似的细胞表型,体外诱导分化显示两者都具有成骨、成脂分化能力,但人血小板裂解液扩增的间充质干细胞成骨分化能力更强。提示人血小板裂解液可以取代胎牛血清用于临床低密度扩增人间充质干细胞。     

人脐带间充质干细胞的分离鉴定及多向诱导分化

背景：脐带间充质干细胞取材方便、无创,不受伦理学限制,比一般干细胞原始,免疫原性小,其应用前景广阔,是一种理想的种子细胞。 目的：分离鉴定脐带间充质干细胞,并诱导其向成骨细胞和成脂细胞分化。 方法：组织块贴壁法分离纯化脐带间充质干细胞,取对数生长期的第3代细胞,观察细胞形态、生长方式;流式细胞仪检测干细胞表型CD90、CD105、CD34和CD45的表达情况,并在体外检测能否将其诱导分化为成脂细胞及成骨细胞。 结果与结论：用组织块法成功分离培养出脐带间充质干细胞,流式细胞学鉴定显示细胞强表达 CD90和CD105,不表达 CD34和 CD45;能在体外将其成功诱导为脂肪细胞和成骨细胞。结果显示组织块贴壁法能够从人脐带中分离出间充质干细胞,该细胞可向成脂细胞及成骨细胞分化。     

脐带间充质干细胞促进骨愈合的体外实验及临床应用1例

背景：华通胶来源脐带间充质干细胞比成人间充质干细胞更原始,研究表明其端粒酶活性更高、培养倍增时间更短、分化的细胞谱系更广。目的：观察脐带间充质干细胞在体外分化为成骨细胞的能力及治疗骨折不愈合的效果。方法：从脐带Wharton胶获取细胞培养、扩增,取传代细胞行免疫表型测定和成骨细胞诱导分化,并以脐带间充质细胞移植治疗1例骨折感染外露后长期不愈病例。结果与结论：培养细胞形态类成纤维细胞,可长期稳定培养,传代细胞表达间充质干细胞免疫表型,成骨诱导分化的细胞茜素红染色胞浆中有大量的钙沉积,VonKossa染色有钙结节形成。患者采用脐带间充质干细胞混悬液外用4次,肉芽组织迅速增生填满窦道并上皮化,12d创面愈合。说明,脐带间充质干细胞具有高度自我更新能力和分化潜能,能够向成骨细胞分化,将其移植治疗骨不连可以显著改善局部微环境。     

脐带间充质干细胞促进骨愈合的体外实验及临床应用1例

背景:华通胶来源脐带间充质干细胞比成人间充质干细胞更原始,研究表明其端粒酶活性更高、培养倍增时间更短、分化的细胞谱系更广.目的:观察脐带间充质干细胞在体外分化为成骨细胞的能力及治疗骨折不愈合的效果.方法:从脐带Wharton胶获取细胞培养、扩增,取传代细胞行免疫表型测定和成骨细胞诱导分化,并以脐带间充质细胞移植治疗1例骨折感染外露后长期不愈病例.结果与结论:培养细胞形态类成纤维细胞,可长期稳定培养,传代细胞表达间充质干细胞免疫表型,成骨诱导分化的细胞茜素红染色胞浆中有大量的钙沉积,Von Kossa染色有钙结节形成.患者采用脐带间充质干细胞混悬液外用4次,肉芽组织迅速增生填满窦道并上皮化,12 d创面愈合.说明,脐带间充质干细胞具有高度自我更新能力和分化潜能,能够向成骨细胞分化,将其移植治疗骨不连可以显著改善局部微环境.     

组织块培养的人脐带源性间充质干细胞的生物学特性

背景:间充质干细胞主要来源于骨髓,但骨髓源性间充质干细胞存在病毒污染的可能,且随年龄增长其细胞数量和扩增分化能力会出现明显下降,因此需要寻找新的间充质干细胞来源。目的:拟采用组织块培养法从人脐带中分离间充质干细胞,并观察其生物学特性。设计、时间及地点:观察性实验,于2007-03/2008-05在吉林大学白求恩医学院组胚教研室完成。材料:脐带来自正常足月产健康婴儿,产妇及家属均知情同意。方法:采用组织块法分离培养和扩增间充质干细胞:将脐带剪碎至1mm×1mm×1mm大小组织块,置于培养瓶中,并在组织块表面覆盖载玻片防止其漂浮,加入含体积分数为0.10胎牛血清的DMEM/F12培养液培养。细胞贴壁后,每隔三四天更换培养基,待细胞出现集落生长达60%以上汇合后,弃组织块,消化后,按1:2～1:3的比例传代。取第7代细胞在含地塞米松、抗坏血酸、β-磷酸甘油、含体积分数为0.10胎牛血清的DMEM/F12培养液与含体积分数为0.10胎牛血清、地塞米松、胰岛素、吲哚美辛、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤、抗坏血酸、青霉素和链霉素的DMEM/F12培养液中诱导其成骨及成脂分化。主要观察指标:光、电镜观察获得的人脐带源性间充质干细胞形态,MTT法检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞周期、免疫表型,碱性磷酸酶染色及油红O染色鉴定细胞分化能力。结果:组织块贴壁后1周可见多数呈长梭形或扁平形的成纤维样细胞,2周后,细胞形态变为均一的纺锤形。透射电镜观察第5代和第7代细胞均为幼稚形态的细胞,细胞膜表面不光滑,核大,不规则,核仁明显,常染色质多,异染色质少,胞浆少,胞浆内可见较多游离核糖体,此外还可见粗面内质网和线粒体。流式细胞术分析细胞周期显示,第3,5,7代70%以上的细胞处于G0/G1期;第3,5,7代细胞均强烈表达CD105、CD90、CD44,不表达CD34、CD31、CD45。第7代细胞在体外可定向诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞。结论:采用组织块培养法可从人脐带中分离出具有间充质干细胞特性的细胞。     

人脐带间充质干细胞分离培养及向脂肪与成骨细胞的分化

背景:研究报道显示人脐带间充质干细胞体外分离方法及效率、培养条件各不相同,并且尚未有统一的鉴定标准.因此建立高效、经济的培养体系十分必要.目的:建立从人脐带组织分离培养间充质干细胞的方法,并进行向脂肪细胞和成骨细胞的诱导分化.方法:采用组织块贴壁法和酶消化法分离纯化获得人脐带间充质干细胞,取对数生长期的第3代细胞,分析其细胞形态、增随方式和某些免疫表型,并在体外诱导其向脂肪细胞和成骨细胞分化.结果与结论:采用组织块贴壁法和酶消化法均能成功获得贴壁生长的人脐带间充质干细胞,并在体外扩增培养.流式细胞术分析结果显示,人脐带间充质干细胞强表达CD29,CD44,CD59,CD105,阴性表达CD28,CD31,CD34,CD45,CD40,CD86,HLA-DR.人脐带间充质干细胞在适当的诱导条件下能向脂肪和成骨细胞分化,体外能连续传代40次以上,且形态和表型保持稳定.这证实了人脐带组织存在间充质干细胞,且具有向脂肪和成骨细胞分化的潜能,因此将可能成为细胞治疗和组织工程新的种子细胞.     

脐血间充质干细胞分离扩增及向成骨与脂肪细胞的分化

背景：和骨髓间充质干细胞相比，脐血间充质干细胞取材方便，其免疫原性较低，能耐受更大程度上的HLA配型不符，分离出的间充质干细胞纯度更高。目的：分析新生儿脐血间充质干细胞体外分离、纯化、扩增，以及向成骨及脂肪细胞定向诱导分化的方法与条件。设计、时间及地点：观察性实验，于2004-09/2005-11在四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室，干细胞与组织工程研究室完成。材料：胎龄37～40周的新生儿脐血。方法：以Ficoll-HyPfdque淋巴细胞分离液密度梯度法、沉降红细胞后密度梯度法及CD34^＋免疫磁珠负选法分离脐血单个核细胞。将分离获得的单个核细胞采用L-DMEM培养基＋体积分数0．1胎牛血清或Mesencult^TM培养基＋体积分数0．1胎牛血清进行间充质干细胞培养传代，获得的第3代集落生长细胞进行流式细胞仪表面抗原测定，并诱导其向成骨、脂肪细胞分化。主要观察指标：①脐血间充质干细胞的鉴定。②经茜素红染色及油红染色证实其诱导分化。结果：经沉降红细胞后密度梯度离心分离的单个核细胞，使用Mesencult^TM培养基＋体积分数0．1胎牛血清培养成功率高，第3代可出现明显的集落生长，而另两种方法分离培养的细胞则难以形成集落；集落细胞表面抗原测定表达CD29，CD59，D71，不表达CD34，CD45及HLA-DR等分子。成骨定向诱导分化的集落细胞经茜素红染色胞浆中出现有大量的钙沉积，成脂肪定向诱导分化的集落细胞油红染色示胞浆充满油滴空泡。结论：使用Mesencult^TM培养基＋体积分数0．1胎牛血清培养由甲基纤维素沉降脐血红细胞后密度梯度离心分离的单个核细胞培养成功率高，第3代可出现明显的集落生长。经诱导后可分化为成骨细胞和脂肪细胞。     

人脐带间充质干细胞体外诱导分化为成纤维细胞

背景：脐带间充质干细胞具有多向分化能力,但其向成纤维细胞分化研究较少。目的：验证人脐带间充质干细胞向成纤维细胞的分化能力。方法：采用贴壁法分离脐带间充质干细胞,流式细胞仪分析其表面抗原。取第3代脐带间充质干细胞进行成脂成骨诱导分化,以碱性成纤维细胞生长因子诱导脐带间充质干细胞向成纤维细胞分化。结果与结论：贴壁法能稳定从脐带中分离出干细胞,脐带间充质干细胞极低表达 CD31、CD45、CD40、HLA-DR,强表达 CD29、CD90、CD44、CD105。脐带间充质干细胞成脂诱导后油红O染色显示胞浆中充满红色的油滴;成骨诱导后茜素红染色可在细胞密集区见红色的钙结节。碱性成纤维细胞生因子诱导后细胞表达Ⅰ型胶原明显高于对照组。提示贴壁法分离脐带间充质干细胞可靠、纯度高,碱性成纤维细胞生长因子可诱导脐带间充质干细胞向成纤维细胞分化。     

梯度血清递减体外培养人脐带间充质干细胞

背景：人脐带间充质干细胞的扩增与培养条件密切相关,而含体积分数10%-20%胎牛血清的培养基可促进细胞生长。目的：建立梯度血清递减扩增培养脐带间充质干细胞的培养技术。方法：采用胶原酶Ⅱ消化分离获得脐带间充质干细胞悬液,并通过贴壁培养进行纯化,细胞贴壁后采用梯度血清递减方法,即第1代80%含血清培养基,20%无血清培养基;第2代50%含血清培养基,50%无血清培养基;第3代20%含血清培养基,80%无血清培养基;第4代100%无血清培养基。另一种传代中始终采用含体积分数10%胎牛血清的α-MEM完全培养液。用流式细胞仪检测细胞的表面标记,进行成骨诱导试验,同时与经典的含10%胎牛血清的α-MEM培养体系进行比较。结果与结论：梯度血清递减培养法与经典α-MEM培养体系所获得的细胞在扩增能力、细胞形态、免疫表型等方面相似。细胞在两种培养体系中均能保持良好的分化潜能。但梯度血清浓度法培养间充质干细胞可使用更少量胎牛血清,提高临床应用安全性。     

地塞米松浓度与脐带间充质干细胞的成骨分化

背景：在地塞米松、维生素C和β-甘油磷酸钠的共同作用下,人脐带间充质干细胞可以向成骨细胞分化。作为糖皮质类激素的地塞米松,其浓度对人脐带间充质干细胞体外成骨分化存在着影响。目的：探寻人脐带间充质干细胞向成骨细胞诱导分化过程中地塞米松的优选浓度。方法：采用植块法从正常足月新生儿脐带中分离培养间充质干细胞。取第3代细胞进行日常细胞培养和诱导分化实验。流式细胞术检测所获细胞的表面标记表达情况,成脂、成骨诱导分化鉴定人脐带间充质干细胞。倒置相差显微镜观察成骨分化过程中细胞形态的变化。以含1×10^-8mol／L,5×10^-8mol／L,1×10^-7mol／L3种浓度地塞米松的成骨诱导液对人脐带间充质干细胞进行成骨诱导。盐酸四环素荧光及VonKossa染色法对比观察钙结节形成。反转录一聚合酶链反应法对比检测细胞骨桥蛋白基因表达。结果与结论：植块法分离的人脐带间充质干细胞形态均一,多为梭形,平行排列生长或旋涡状生长。流式细胞术检测CD29,CD73和CD90呈阳性表达,CD31,CD34和HLA-DR呈阴性表达。成脂诱导后可观察到细胞内有脂滴形成,油红O染色呈阳性。盐酸四环素荧光结果和VonKossa染色结果显示,所形成的钙结节大小及数量,均随着地塞米松浓度的增加而增强、增多。反转录一聚合酶链反应检测结果显示,3种浓度地塞米松组的骨桥蛋白基因均有表达,且表达强度随着地塞米松浓度的增加而增强。提示成骨诱导液中地塞米松浓度为1×10^-7mol／L时,能更有效地诱导人脐带间充质干细胞向成骨细胞分化。     

脐带来源间充质干细胞在成脂培养条件下骨形态发生蛋白2的表达

背景：脐带间充质干细胞在成脂培养条件下成脂相关信号因子过氧化物酶体增殖体激活受体Y的表达水平增高,同时成骨相关信号因子骨形态发生蛋白的表达水平也增高。目的：检测成脂诱导条件下脐带间充质干细胞的过氧化物酶体增殖体激活受体Y及骨形态发生蛋白2的表达水平变化,并对结果进行初步探讨。方法：取脐带来源的间充质干细胞,以成脂诱导体系对细胞进行诱导分化培养,倒置显微镜下观察细胞体外培养生长情况：油红O染色法观察成脂现象,茜素红及von kossa染色观察是否有沉淀形成：荧光定量PCR方法检测成脂相关因子过氧化物酶体增殖体激活受体Y及骨形态发生蛋白2的表达变化情况。结果与结论：获得脐带来源间充质干细胞,并成功进行了成脂诱导分化。荧光定量PCR检测发现在成脂诱导条件下脐带间充质干细胞的过氧化物酶休增殖体激活受体Y和骨形态发生蛋白2的表达水平令都呈升高趋势,但是前肯对分化方向的调控起主要作用。     

冻存脐带间充质干细胞向成骨细胞的分化

背景：在骨组织工程中,脐带间充质干细胞是的一种新兴的种子细胞。目前认为低温冻存是长期保存细胞的有效方法。目的：探究冻存的脐带间充质干细胞能否被诱导分化成成骨细胞。方法：采用组织块贴壁法从脐带的华尔通氏胶组织中分离出间充质干细胞。然后,用倒置显微镜观察原代细胞的细胞形态。脐带间充质干细胞的免疫表型和细胞周期用流式细胞仪检测。在冻存6个月后,复苏第2代脐带问充质干细胞进行冻存复苏,并传代培养至12代。对第12代的脐带间充质干细胞进行成骨诱导,它的成骨能力分别通过碱性磷酸酶活性检测,骨钙素和骨涎蛋白的免疫荧光检测以及茜素红染色检测来确定。结果与结论：原代脐带间充质干细胞呈现典型的成纤维细胞样形态。流式细胞仪显示培养的细胞高表达间充质干细胞的表面标志CD73、CDl05和CD90,但是不表达造血细胞的表面标志CD34和CD45。复苏后细胞的存活率是90％。细胞周期显示P8的细胞有75％处于Go／G1期,25％处于S＋G2M期。经成骨诱导液处理的第12代细胞显示出比对照组更高的碱性磷酸酶活性（P〈0．01）。此外,在成骨诱导液中诱导的细胞对骨钙素和骨涎蛋白的染色呈阳性,并形成矿化了结节。冻存后的脐带间充质干细胞仍保持了它们的生物学特性,并且在成骨诱导液中能被诱导分化成成骨细胞。     

脐血来源间充质干细胞的分化潜能

背景：脐血源间充质干细胞是来源于发育早期中胚层的一类多能干细胞,因其具有多向分化潜能的特点而日益受到关注。目的：综述脐血来源间充质干细胞的诱导分化潜能。方法：应用计算机检索Pubmed数据库中1999年1月至2012年12月关于脐血源间充质干细胞分化潜能的文章,在标题和摘要中以＂umblical cord blood,mesenchymal stem cells,potential,differentiation＂为检索词进行检索。最终选择关于脐血源间充质干细胞分化潜能的52篇文献进行综述。结果与结论：虽然很多实验已经证实人脐血间充质干细胞可以成功向多种细胞系分化,但对其了解程度尚浅。如果能掌握脐血间充质干细胞分化潜能的特点,那么很可能用它来修复许多骨缺损、心肌缺损等。目前研究正处于起步阶段,在分离纯化技术、分化方向的调控、体外扩增、免疫原性等方面尚有待进一步深入研究。     

脐带间充质干细胞的归巢机制

背景：脐带间充质干细胞因其具有取材方便、无污染、易扩增、无伦理学差异、多向分化等优点被作为用于组织工程学及再生医学的理想种子细胞。目的：对脐带间充质干细胞的归巢机制进行阐述。方法：以“Umbilical cord mesenchymal stem cells,homing mechanism or home,脐带间充质干细胞,归巢机制,归巢特点”为关键词应用计算机检索Pubmed数据库、CNKI数据库2003至2012年,选择内容与脐带间充质干细胞、归巢机制、临床应用相关的文章,这些文献为近期发表或发表在权威杂志,共纳入31篇文献。结果与结论：脐带间充质干细胞的免疫调节、多向分化等优势使其作为一种新的治疗手段应用于临床,使众多疾病的治愈成为可能,其中向缺血或损伤组织炎性归巢的特征是脐带间充质干细胞安全有效的应用于临床的关键。了解脐带间充质干细胞归巢特点,研究其归巢机制,使其高效归巢是脐带间充质干细胞应用于细胞治疗的关键问题。     

携带人胰岛素基因腺病毒载体转染人脐带间充质干细胞及其成脂分化

背景：胰岛素是成脂诱导剂的重要组成成分。然而胰岛素存在半衰期,会随着体内代谢不断灭活及降解,植入体内的细胞或材料无法像体外那样以更换培养液来达到目的。实验拟通过转染胰岛素基因,使转染后的干细胞稳定分泌胰岛素,促进其成脂分化。目的：探讨携带人胰岛素基因腺病毒载体转染人脐带间充质=F细胞后对其成脂分化能力的影响。方法：取第3代人脐带间充质干细胞,以感染复数为20转染腺病毒载体。实验分为4组：对照组为第4代人脐带间充质干细胞;实验组1为腺病毒转染的第4代人脐带间充质干细胞;实验组2为第4代人脐带间充质干细胞＋成脂诱导液;实验组3为腺病毒转染的第4代人脐带间充质干细胞＋成脂诱导液。结果与结论：转染48h后实验组1和实验组3的人脐带间充质干细胞在荧光显微镜下显现弱荧光,72h后荧光较强。经脂肪诱导培养液培养14d后,实验组1,2,3油红O染色后显微镜下呈红色,对照组未见脂滴形成,实验组1可见一些细小脂滴形成;实验组3与实验组2相比,脂滴大且多,定量分析显示,实验组3油红0染色阳性的面积和吸光度大于实验组2（P〈0．05）。由此说明携带人胰岛素基因腺病毒载体转染人脐带间充质干细胞后可促进其成脂能力。