靶向LASS2基因的小干扰RNA对人肝癌细胞侵袭能力的影响

目的:研究靶向人源性长寿保障基因2(homosapiens longevity assurance homologue 2,LASS 2)的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对人肝癌细胞MHCC97-L体外侵袭能力的影响.方法:通过脂质体转染将靶向LASS2的siRNA转染MHCC97-L细胞,运用实时荧光定量PCR(real-time fluorogentic quantitative PCR,RFQ-PCR)检测转染后LASS2 mRNA的表达,筛选有效的siRNA片段;运用 BCECF氢离子敏感荧光探针检测MHCC97-L细胞跨膜运输氢离子的功能;采用Western印迹法分析MHCC97-L细胞及上清液中基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)的表达情况;应用明胶酶谱法检测MHCC97-L细胞上清液中MMP-2的活性; Transwell法检测细胞体外侵袭能力.结果:筛选得到靶向LASS2的有效siRNA-1片段.MHCC97-L细胞转染LASS2 siRNA-1后,其跨膜运输氢离子的能力增强,与空白对照组比差异有统计学意义(P<0.05);MMP-2蛋白的表达及分泌无明显变化,但分泌的MMP-2活性形式增加,与空白对照组和无关序列组比明显提高,差异有统计学意义(P<0.05);且细胞的体外侵袭能力明显高于无关序列组和空白对照组(P<0.05).结论:靶向LASS2的siRNA能有效下调其表达,并能提高MHCC97-L细胞在转染LASS2 siRNA后的体外侵袭能力.     

阿霉素对不同转移能力肝癌细胞及肝癌干细胞相关基因表达的影响

目的 探讨阿霉素（adriamycin, ADM）对不同转移能力肝癌细胞及肝癌干细胞相关基因表达的影响。方法　利用MTT法检测ADM对人肝癌细胞系MHCC97-L、HCCLM3的抑制作用,计算各自的半数致死浓度（median lethal dose, LD50）;Western blot法检测ADM作用下人肝癌细胞系MHCC97-L、HCCLM3中干细胞基因Nanog、Oct-4、Sox2、ARID1A、Wnt5b的表达,并分析干细胞基因在两种细胞中表达变化的差异。结果 ADM浓度越高,对人肝癌细胞的抑制作用越明显,其对MHCC97-L和HCCLM3的半数致死浓度分别为0.4212 μmol/L和0.5249 μmol/L;随着ADM（LD50）作用时间的延长,MHCC97-L和HCCLM3中Wnt5b的表达水平先升高后降低,Nanog蛋白的表达先降低后升高,Sox2在HCCLM3中表达水平逐渐升高。Wnt5b和Nanog 4 h内在低转移能力肝癌细胞系MHCC97-L中的表达变化均值均小于其在高转移能力肝癌细胞系HCCLM3时的表达变化均值,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 ADM可促进MHCC97-L和HCCLM3细胞的凋亡,且对MHCC97-L的作用强于HCCLM3;干细胞相关基因Wnt5b与肝癌细胞的恶性程度呈负相关;Nanog和Sox2均与肿瘤的转移密切相关,且Nanog和Sox2可能与肝癌耐药密切相关。     

miR-509-3p在肝癌组织中的表达及对肝癌细胞迁移侵袭的影响

背景与目的：肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界范围内致死率第三高的恶性肿瘤，microRNA（miRNA）被认为在HCC的发病机制中起重要作用。本研究旨在探讨在原发性肝癌中miR-509-3p的表达水平、细胞功能及调控的相关基因。方法：通过实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）技术检测miR-509-3p在46例肝癌患者组织样本、人肝癌细胞系及永生化人正常肝细胞系中的表达水平，采用transwell实验检测miR-509-3p对肝癌细胞转移的影响。采用蛋白质印迹法（Western blot）检测miR-509-3p与上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相关基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）之间的关系。结果：RTFQ-PCR技术检测结果显示，miR-509-3p在46例肝癌患者的肝癌组织样本以及MHCC97H、HCCLM3和SMMC-7721肝癌细胞系中异常高表达。体外功能实验证实抑制miR-509-3p表达能降低MHCC97H和HCCLM3肝癌细胞的迁移能力。Western blot检测结果显示，在MHCC97H和HCCLM3肝癌细胞中抑制miR-509-3p的表达可以降低MMP-9和MMP-2蛋白的表达。结论：本研究表明miR-509-3p通过正向调控MMP-9和MMP-2蛋白的表达而促进肝癌细胞的迁移和侵袭。     

重组腺病毒载体介导人LASS2基因在肝癌细胞转移中的抑制作用

目的:探讨人源性长寿保障基因(homo-sapiens longevity assurance homologue 2 of yeast LAG1,LASS2)对人肝癌HCCLM3细胞体外转移的影响及可能的作用机制.方法:构建含人LASS2基因的重组腺病毒并转染入HCCLM3细胞;采用蛋白质印迹法检测HCCLM3细胞中LASS2蛋白的表达水平;划痕实验及体外侵袭实验检测LASS2基因过表达对HCCLM3细胞在迁移和侵袭等转移能力上的改变;免疫共沉淀法验证LASS2蛋白与V-ATPase(vacuolar H+-ATPase)质子泵中的c亚基(ATP6L)在细胞内相互结合的情况;通过对细胞内外H+浓度的测定,探讨LASS2过表达对V-ATPase功能抑制的情况.结果:成功构建了含人LASS2基因的重组腺病毒,LASS2基因在HCCLM3细胞中能有效表达;LASS2过表达可使HCCLM3细胞的侵袭和迁移能力均明显下降(P＜0.01),其中侵袭能力下降达(48.3±7.6)％,穿过划痕的细胞个数从对照组的(59.00±6.87)个下降至(10.83±3.75)个;LASS2蛋白与ATP6L蛋白在HCCLM3细胞内特异性结合;LASS2过表达后,细胞内外H+浓度发生明显变化,表明V-ATPase质子泵功能受到抑制.结论:LASS2基因在HCCLM3细胞中过表达可抑制肝癌细胞的迁移和侵袭能力,其机制可能与LASS2蛋白结合ATP6L,抑制其分泌H+功能相关.     

CTHRC1基因在人肝癌中高表达并促进MHCC97L肝癌细胞的转移

目的：分析CTHRC1基因在人肝癌组织和肝癌细胞株中的表达情况及其对MHCC97L肝癌细胞转移能力的影响。方法：采用northem blot、RT—PCR和荧光定量PCR分析人肝癌组织和肝癌细胞株中CTHRC1 mRNA水平。构建包含CTHRC1基因编码框的真核表达载体pCMV-3Tag-CTHRC1，通过体外实验分析CTHRC1在MHCC97L细胞中过表达对MHCC97L细胞迁移、侵袭等转移能力的影响。结果：Northern blot、RT—PCR和荧光定量PCR结果显示，14例肝癌患者中11例存在癌组织CTHRC1 mRNA表达水平高于癌旁组织，8种肝癌细胞株中5种肝癌细胞株存在着CTHRC1的高表达。当CTHRC1过表达后，MHCC97L细胞的迁移及侵袭能力显著增强（P〈0．001）。结论：CTHRC1基因在人肝癌组织和人肝癌细胞株中存在着高表达，同时该基因可使肝癌细胞MHCC97L的转移能力明显增强，提示CTHRC1基因可能在肿瘤转移中起重要作用。     

TEY1基因在不同转移潜能肝癌细胞中表达的定量分析

背景和目的:我们先前的研究提示,肝癌转移抑制基因可能在人染色体8p上。TEY1基因(TEnni-Yokusei1,转移抑制的日文)是最近从人染色体8p发现的前列腺癌转移抑制基因。本研究通过对不同转移潜能肝癌细胞株中TEY1基因的表达水平进行定量分析,探讨TEY1基因作为肝癌转移抑制基因的可能性。方法:提取肝癌细胞株MHCC97-H、MHCC97-L、HCCLM3和正常肝细胞系L02的RNA,反转录合成第一链cDNA,对反转录产物进行荧光定量PCR。用看家基因GAPDH的cDNA起始浓度作为参照标化TEY1的cDNA起始浓度,对标化结果进行单因素方差分析。结果:MHCC97-H、MHCC97-L、HCCLM3和L02标化后的TEY1cDNA起始浓度分别为(3.57±2.62)×10-4、(5.02±1.95)×10-4、(2.82±0.78)×10-5、(15.20±0.58)×10-4。肝癌细胞的TEY1基因表达水平和正常细胞之间存在显著性差异(P<0.001);HCCLM3的TEY1基因表达水平与MHCC97-H和MHCC97-L相比差异有显著性(P<0.05);MHCC97-L的TEY1基因表达水平是MHCC97-H的1.4倍,但两者无显著性差异(P>0.05)。结论:TEY1基因表达水平与肝癌细胞的转移潜能呈负相关,可以推测TEY1基因可能是肝癌转移的抑制基因。     

热休克蛋白90α在人类肝癌细胞外的表达及其对侵袭、迁移能力的影响

目的探讨细胞外热休克蛋白90α（HSP90α参与肝癌细胞转移的可能分子机制。方法采用免疫印迹法检测HSP90α在低、高转移性肝癌MHCC97-L和MHCC97-H细胞外的表达。选取高转移潜能MHCC97-H细胞,应用不穿透细胞膜的小分子抑制剂抑制细胞外HSP90α表达,体外侵袭实验观察细胞侵袭、迁移能力的变化,明胶酶谱法分析基质金属蛋白酶2（MMP-2）活性的改变。免疫印迹和免疫共沉淀法检测细胞外辅助分子伴侣HSP70和MMP-2的表达及其与HSP90d的相互作用。利用RNA干扰技术下调细胞HSP70表达,观察细胞外HSP90仅与MMP-2相互作用及其细胞转移潜能的变化。结果HSP90d在不同转移潜能肝癌细胞内外均表达,且与肝癌细胞转移潜能呈正相关。MHCC97-H细胞经特异性HSP90抑制剂二甲氨基乙氨基-17-去甲氧基格尔德霉素-N-氧化物（DMAG—N—oxide）作用24h后,穿过上室基底膜的细胞数较未处理组和空白对照组明显下降（P〈0．01）,分别为（28．11±3．56）、（80．12±4．16）、（82．24±4．12）个。体外侵袭实验显示,穿过Matrigel人工基底膜的细胞数低于未处理组和空白对照组,分别为（36．54±4．12）、（95．12±3．48）、（101．11±3．36）个,差异有统计学意义（P=0．017）,并伴有细胞外MMP-2活性减低。HSP70和MMP-2均可在MHCC97-H细胞外表达,且能与HSP90α相互结合。小分子干扰RNA（siRNA）能有效抑制细胞HSP70表达,MHCC97-H细胞外HSP90d和MMP-2相互作用减弱,MMP-2活性下降,细胞侵袭、迁移能力受抑制。同时联合应用MMP-2抑制剂,具有协同抑制效应。结论细胞外HSP90饯可能通过与HSP70形成伴侣复合体介导MMP-2成熟活化,增强肝癌细胞侵袭、迁移运动,提示其可能是潜在的对肝癌转移实施防治的靶点。     

miR-199-3p通过对FGF2的调控抑制肝癌细胞MHCC97H的增殖、迁移作用及机制

目的:探讨miR-199-3p通过靶向调控抑制靶基因FGF2从而抑制肝癌MHCC97H细胞的增殖和迁移及机制。方法:qRT-PCR检测癌旁正常组织及肝癌肿瘤组织中miR-199-3p的表达水平;Transwell细胞侵袭实验检测肝癌细胞株Huh7、MHCC-97L、SMMC7721、HepG2和MHCC97H株其侵袭能力;qRT-PCR检测miR-199-3p在5株肝癌细胞系中的表达量;通过生物信息软件预测靶基因FGF2 mRNA 3' UTR的碱基存在miR-199-3p可能互补结合的位点并用荧光报告基因法及WB进行验证;通过qRT-PCR、免疫组化及Western blot检测FGF2在肝癌肿瘤组织和癌旁正常组织及各类肝癌细胞株表达的影响;Transwell、划痕、CCK8及流式细胞法检测miR-199-3p与FGF2对肝癌MHCC97H细胞增殖、侵袭、迁移及周期S期聚集能力的调控;采用MHCC97H细胞构建肝癌肿瘤异种移植小鼠模型进行肿瘤观测及免疫组化实验验证miR-199-3p对肝癌的调控作用。结果:miR-199-3p的表达水平与肝癌细胞侵袭转移能力相关;miR-199-3p能够通过抑制FGF2的mRNA翻译,抑制FGF2蛋白水平表达;FGF2与肝癌细胞侵袭转移能力相关;miR-199-3p可以负调控FGF2抑制肝癌MHCC97H细胞的生物行为;miR-199-3p 可抑制肝癌细胞中阳性信号,细胞增殖水平显著降低。结论:miR-199-3p通过抑制FGF2抑制肝癌细胞MHCC97H的增殖和迁移。     

不同转移潜能人肝癌细胞系的基因表达分析

目的：比较不同转移潜能人肝癌细胞系的基因表达谱,寻找与癌转移相关的基因表达改变。方法：采用基因芯片技术,比较遗传背景相同但转移力有明显差异的两个细胞系MHCC97－L和HCCLM3,分析其基因表达谱的差异。结果：在1626个候选基因中,筛选出25个差异表达基因。HCCLM3与MHCC97－L相比,表达上调的基因有8个,包括细胞增生基因E25、信号传导基因NKK6和免疫相关基因SP40,40等;下调的有17个,包括细胞周期调控基因Rb2、信号传导基因PKCβ2和错配修复基因hMSH2等。结论：肝癌转移是多基因作用的综合结果,筛选的基因对预测转移和抗转移干预措施可能有指导意义。     

肿瘤外周酸性微环境促进肝癌HCCLM3细胞的转移

目的:探讨肿瘤外周酸性微环境对肝癌HCCLM3细胞转移的影响.方法:将肝癌细胞HCCLM3分别培养在不同pH值(pH 7.4、pH 7.0和pH 6.6)的细胞培养液中,通过细胞体外迁移实验和体外侵袭实验分析HCCLM3细胞在迁移和侵袭能力方面的改变,通过Western印迹、明胶酶谱及原位酶谱法分析HCCLM3细胞在基质金属蛋白酶2(matrix metallopeptidase-2,MMP-2)合成、分泌和激活方面的变化.结果:当细胞外周微环境向酸性变化时,HCCLM3细胞的迁移及侵袭能力均明显增强(P<0.01),虽然细胞内MMP-2的合成未发生明显改变,但细胞分泌的MMP-2及MMP-2的激活均明显增强(P<0.01).结论:细胞外周酸性微环境可以上调细胞MMP-2的分泌及激活,并促进肝癌细胞HCCLM3的体外侵袭和迁移能力,提示肿瘤外周酸性微环境对肝癌细胞HCCLM3的转移具有促进作用.     

BNIPL-2 promotes the invasion and metastasis of human hepatocellular carcinoma cells

Enhanced cell migration and invasion play key roles in cancer metastasis. However, the molecules involved in this process are not fully understood. In this study, a full-length human BNIPL-2 (Bcl-2/adenovirus E1B 19 kDa interacting protein 2 like-2) cDNA was transfected into human hepatocellular carcinoma cells with low metastatic potential (MHCC97-L). The in vitro and in vivo effects of BNIPL-2 on cell invasion and metastasis were examined. In vitro analysis showed that the overexpression of BNIPL-2 increases cell invasion and promotes cell migration. The rates of intrahepatic and pulmonary metastasis in nude mice were also increased. Cdc42 activation assays and immunoblot analysis indicated that the activation of Cdc42 and the upregulation of CD44 were involved in the metastasis of cancer cells. The overexpression of BNIPL-2 promotes the invasion and metastasis of MHCC97-L cells. Thus, BNIPL-2 is a gene related with cancer metastasis.     

应用CpG岛芯片技术分析人肝癌细胞株CpG岛甲基化差异基因

目的 在全基因组水平研究与肝细胞癌发生及转移相关的cpc岛甲基化谱型改变.方法 采用加拿大University Health Network芯片中心的12K人CpG岛芯片,对多系列人肝癌细胞株HepB、HepG2、PLC/RPF/5/RPF/5、SMMC-7721、BEL-7402、MHCC97-H、MHCC97-L、HCCLM3和HCCLM6进行全基因组CpG岛甲基化差异扫描,以Chang's liver细胞株为对照.其中MHCC97系列细胞株(MHCC97-H、HCCLM3、HCCLM6)均以低转移潜能细胞株MHCC97-L作为对照,筛选转移潜能相关差异基因.对数据进行归一化处理及聚类分析,筛选出具有甲基化差异的基因,并随机选取2个基因进行甲基化特异性PCR(MSP)验证.结果 以Cy5/cy3≥2或者≤0.5为差异显著性标准,筛选出9个肝癌细胞株中差异表达趋势一致的CpG岛差异甲摹化位点58个,其上下游肿瘤相关基因66个,包括抑癌基因及其配体基因、凋亡基因及抗凋亡基因、细胞增殖分化基因、细胞周期相关基因、细胞信号通路关键基因等.MHCC97系列高转移潜能细胞株MHCC97-H、HCCLM3和HCCLM6筛选出转移潜能相关CpG岛甲基化差异位点分别为16、13和6个,肿瘤相关基因分别为24、16和6个.MSP验证与芯片结果相符.结论 在肝癌的发生、发展过程中,存在一系列关键基因CpG岛甲基化改变.在肝癌细胞株中,抑癌基因及相关信号通路关键基因可能由于其启动子区CpG岛高甲基化而表达下调,而促癌基因及相关信号通路关键基因可能由于其启动子区CpG岛低甲基化而上调表达.     

低强度超声对肝癌细胞MHCC97H迁移与侵袭能力影响的体外研究

背景与目的：低强度超声(low intensity ultrasound, LIUS)能杀伤肿瘤细胞,促进肿瘤细胞的凋亡,但对肿瘤细胞迁移侵袭作用的影响仍不清楚。该研究旨在探讨LIUS对肝癌细胞MHCC97H迁移侵袭的影响及可能的机制。方法：实验根据超声照射强度的不同分为对照组(0 W/cm²)、0.5 W/cm²组、1.0 W/cm²组和1.5 W/cm²组;LIUS处理后划痕实验和Transwell小室体外迁移和侵袭实验检测肿瘤细胞的迁移和侵袭能力;显微镜及F-actin细胞骨架荧光染色观察处理后细胞骨架的变化;实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)及蛋白质［印］迹法(Western blot)检测各组MMP-2、MMP-9的表达变化。结果：LIUS(小于等于1.5 W/cm²)能促进肝癌细胞MHCC97H的迁移侵袭,划痕实验及Transwell迁移和侵袭实验都表明LIUS处理后肿瘤细胞迁移侵袭数量增加;光学显微镜及荧光显微镜发现LIUS处理后肝癌细胞的形态发生变化;RTFQ-PCR及Western blot的结果表明超声处理后MMP-2 mRNA 及蛋白表达水平上升,MMP-9的mRNA 表达水平上升。结论：LIUS可能通过改变肿瘤细胞的骨架及增加MMP-2的表达促进肝癌细胞MHCC97H的迁移及侵袭能力。     

CHST13抑制肝癌细胞侵袭能力的研究

目的 通过研究磺基转移酶CHST13在人肝癌高转移细胞株MHCC97-H和人肝癌低转移细胞株MHCC97-L中的差异表达,明确其与肝癌转移的相关性,从而证实肝癌转移诊断及抗肿瘤治疗新靶点.方法 采用实时PCR、Western blot分析磺基转移酶CHST13在人肝癌高、低转移细胞株的差异表达,通过RNA干扰技术干预CHST13基因,检测干扰前后MHCC97-L细胞的体外侵袭力及体内成瘤性.结果 CHST13在人肝癌高、低转移细胞株中表达具有明显差异;下调MHCC97-L细胞中CHST13基因表达后,穿过基底膜的细胞数量[（30±3）个]明显多于未处理组[（14±2）个],体外侵袭力显著增强（t=2.8,P=0.005）;相对于正常细胞[（0.5±0.06）g],干扰后细胞的肿瘤平均重量[（0.9±0.10）g]明显增大,体内成瘤性明显提高（t=2.5,P=0.01）.结论 磺基转移酶CHST13与肝癌细胞的侵袭、成瘤性密切相关,其有望成为肝癌临床治疗的新靶点.     

肺组织粗提物影响人原发性肝癌细胞侵袭转移机制的初步探讨

背景与目的：转移复发是原发性肝癌治疗失败的主要原因,而肺组织是原发性肝癌远处转移的好发部位。在小鼠不同组织粗提物诱导高转移潜能的人原发性肝癌细胞的体外趋化侵袭实验中,肺组织提取物具有最强的诱导能力。本研究旨在探讨小鼠肺组织粗提物促进人肝癌高转移细胞株移动侵袭的机制。方法：采用F型肌动蛋白聚合实验和流式细胞仪,分析C57BL／6小鼠肺组织粗提物诱导高转移潜能人肝癌细胞株MHCC97-H细胞骨架的变化。肺组织粗提物与MHCC97-H细胞孵育后,利用双重荧光染色分析F型肌动蛋白和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)表达的关系。结果：经无血清培养液或脾组织粗提物孵育后,MHCC97-H细胞呈梭型或多边形。与肺组织粗提物孵育后,随时间的增加,MHCC97-H细胞片层样或丝状伪足明显增多,流式细胞仪分析显示F型肌动蛋白在30s内增加1．9倍,激光扫描共聚焦显微镜观察MHCC97-H细胞F型肌动蛋白从细胞外周浓染到重新分布于细胞的导引侧。无血清培养基孵育MHCC97-H细胞后,MMP-9和F型肌动蛋白主要位于细胞的核周池;经肺组织粗提物孵育后,MHCC97-H细胞MMP-9和F型肌动蛋白则定位于细胞伪足的前端。结论：肺组织粗提物可能通过诱导MHCC97-H细胞形成伪足和改变MMP-9运送方式,从而促进MHCC97-H细胞移动侵袭。肺组织粗提物可能与人肝癌细胞器官特异性转移有关。     

趋化因子CXC受体3在肝细胞癌中的表达及意义

背景与目的:最近研究揭示趋化因子及其受体网络在肿瘤侵袭转移中起重要作用。本研究旨在探讨趋化因子CXC受体3(CXCR3)在肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)中的表达,及其与HCC临床病理特征的关系。方法:选取7株人HCC细胞系、18例正常肝组织、64例HCC患者的癌组织和癌旁肝组织作为研究对象。采用RT-PCR和实时定量PCR方法,研究这些组织中CXCR3mRNA的表达情况。采用免疫组织化学方法,研究CXCR3蛋白的表达情况和HCC复发转移的关系。结果:在高转移细胞系MHCC97-H中,CXCR3与!2微球蛋白的mRNA拷贝均数之比为33.0×10-4,在低转移细胞系MHCC97-L中,该数值为8.7×10-4,在无转移能力的5株细胞系则未检出CXCR3的mRNA表达。在MHCC97-H和MHCC97-L中均见CXCR3蛋白强阳性染色,而在无转移能力的细胞系中只有HepG2见到微弱染色,其余4株均未见染色。CXCR3蛋白在HCC组织中的强阳性染色,与HCC的侵袭性正相关(P=0.003)。HCC组织中CXCR3蛋白强阳性的患者和CXCR3阴性或弱阳性的患者的1、2年无瘤生存率分别为66.7%、31.3%和75.0%、59.5%,差异有显著性(P=0.044)。结论:CXCR3的表达与HCC的侵袭和转移相关。