人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的:构建人MCHR2真核表达载体,转染HEK293细胞,建立稳定转染细胞系. 方法:采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和PCR鉴定后,脂质体转染法转染HEK293细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,RT-PCR,Western Blot及免疫荧光法检测MCHR2的表达. 结果:成功构建了pcDNA3.1-MCHR2真核表达载体并已稳定转入HEK293细胞,建立了稳定转染细胞系,成功地表达目的基因. 结论:稳定转染细胞系的建立和基因表达为进一步研究MCHR2的功能提供了良好的实验基础.     

稳定、高效表达人MCHR2的SHG-44细胞系的建立

目的:构建黑色素浓集激素受体2(MCHR2)真核表达载体pcDNA3.1( )MCHR2,转染SHG-44细胞,建立稳定、高效表达人MCHR2的SHG-44细胞系.方法:PCR法从人胎脑cDNA文库扩增MCHR2全长cDNA片段.用基因重组方法将其克隆到pcDNA3.1( ),构建真核表达载体pcDNA3.1( )MCHR2,并用LipofectamineTM转染到SHG-44细胞,通过G418筛选,建立稳定表达MCHR2的SHG-44细胞系,用RT-PCR、Western印迹及免疫荧光法检测MCHR2的表达.结果:扩增出MCHR2的全长cDNA)成功构建pcDNA3.1( )MCHR2;RT-PCR、Western印迹及免疫荧光法检测到MCHR2的表达,提示成功建立了稳定、高表达MCHR2的SHG-44细胞株.结论:MCHR2-SHG-44细胞株的建立为进一步研究MCHR2的功能奠定了良好的实验基础.     

人MCHR1真核表达载体的构建

目的 构建人MCHR1真核表达载体.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),酶切和测序鉴定.结果 酶切和测序鉴定正确,表明pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体构建成功.结论 pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体成功构建,为进一步研究MCHR1的功能提供了良好的实验基础.     

人DR5真核表达载体的构建及稳定转染NS-1细胞系的建立

目的:构建人死亡受体5(DR5)真核表达载体,转染NS-1细胞,建立稳定转染的NS-1细胞系。方法:采用RT-PCR方法,以人Jurkat细胞cDNA为模板扩增人DR5基因的cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.0,经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染NS-1细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的NS-1细胞系,用FACS法检测DR5的表达。结果:成功构建了pcDNA3.0/DR5真核表达载体,并建立了稳定转染的NS-1细胞系,成功地表达目的基因。结论:真核表达载体成功构建和稳定转染NS-1细胞系的建立为进一步进行基因治疗研究奠定良好的实验基础。     

CD40-IgG1Fc融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的 构建人CD40-IgG1Fc融合蛋白的真核表达载体CD40-IgG1Fc/pcDNA3.1( ),并在中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)表达.方法 应用T-A克隆技术和亚克隆技术,构建人CD40膜外段和IgG1Fc段融合蛋白的真核表达载体CD40-IgG1Fc/pcDNA3.1( ),将其转染入CHO细胞株并筛选,进行稳定表达.通过RT-PCR、Western blot法及ELISA法证实融合基因的表达.结果 成功构建真核表达载体CD40-IgG1Fc/pcDNA3.1( ),并建立CHO细胞稳定表达株.Western blot及ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达.结论 通过基因工程生产的人CD40-IgG1Fc融合蛋白,能够特异性阻断CD40-CD40L的相互作用.     

稳定表达人MCHR2的SH-SY5Y细胞系的建立

目的：构建黑色素浓集激素受体2（MCHR2）/增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合蛋白真核表达载体pEGFPN1-MCHR2,转染人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y,建立稳定表达人MCHR2的SH-SY5Y细胞系MCHR2-SH-SY5Y。方法：采用聚合酶链反应(PCR)法从人胎脑cDNA文库扩增MCHR2全长cDNA片段。用基因重组方法将其克隆到质粒pEGFPN1,构建真核表达载体pEGFPN1-MCHR2,并用Lipofectamine^TM转染到SH-SY5Y细胞,通过G418筛选,建立稳定表达MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞系,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blotting检测MCHR2的表达并用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白亚细胞定位。结果：扩增出人MCHR2全长cDNA;成功构建真核表达载体pEGFPN1-MCHR2;RT-PCR、Western blotting检测到MCHR2-SH-SY5Y细胞MCHR2的表达,激光共聚焦显微镜观察转染pEGFPN1-MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞融合蛋白定位于细胞膜,而转染空质粒pEGFPN1的SH-SY5Y细胞EGFP定位于细胞质。结论：成功建立稳定表达人MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞株。     

NNMT真核表达载体的构建并转染SMMC7721肝癌细胞株

目的构建pcDNA3.1(-)/NNMT(尼克酰胺-N-甲基化酶)真核表达载体并将其稳定转染到肝癌细胞系SMMC7721中。方法采用PCR法从PGEX4T-1/NNMT重组质粒中克隆得到NNMTcDNA全长序列,并将扩增的cDNA片段与pMD19-T载体连接后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中。重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导入到人肝癌细胞系SMMC7721,经G418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用RT-PCR检测转染前后该细胞株NNMT基因的mRNA表达水平。结果真核表达载体构建成功,经RT-PCR检测,重组质粒转染株的NNMT基因mRNA表达水平高于对照组,证实NNMT基因已经稳定转染到SMMC7721细胞中并得到表达。结论成功建立了人基因NNMT的稳定转染细胞株,为进一步研究NNMT的功能奠定了基础。     

人颗粒溶素基因真核表达载体的构建及在肝癌细胞中表达的实验研究

目的： 构建人颗粒溶素（GNLY） 全长编码序列的真核表达载体,转染肿瘤细胞,观察GNLY在细胞内的表达及其对细胞增殖的抑制作用. 方法：用RT-PCR技术获取人GNLY 全长编码序列cDNA,克隆至pGEM-T 载体进行测序,再将克隆片段插入质粒pcDNA3.1（＋）中,构建真核表达载体pcDNA3.1（＋）/GNLY,用阳离子聚合物转染试剂转染肝癌细胞系SMMC-7721,检测目的基因mRNA的表达,WST-8法检测细胞增殖活性. 结果：获得人GNLY全长编码序列cDNA ,并成功构建真核表达载体pcDNA3.1（＋）/GNLY;转染SMMC-7721细胞后,检测出目的基因mRNA的表达;重组质粒转染组与空质粒对照组细胞增殖活性有非常显著性差异（P〈0.01和P〈0.001）,并且随着转染基因浓度的增加,细胞增殖活性逐渐降低,2.0μg/ml pcDNA3.1（＋）/GNLY转染组细胞增殖活性下降至0.329. 结论：pcDNA3.1（＋）/GNLY真核表达载体构建成功,GNLY基因转染对SMMC-7721细胞能产生细胞毒性效应,对肝癌细胞具有一定的杀伤作用.     

抑癌基因PTEN真核表达载体的构建及对人卵巢癌细胞系SW626增殖的影响

目的 构建抑癌基因PTEN的真核表达载体,研究外源性PTEN基因稳定表达对人卵巢癌细胞系SW626体外增殖的影响.方法 构建PTEN基因的真核表达载体pcDNA3.1/PTEN,转染重组质粒pcDNA3.1/PTEN于体外培养的人卵巢癌细胞系SW626,筛选并获得稳定表达PTEN基因的细胞克隆,应用RT-PCR和western blot分析PTEN基因的mRNA及蛋白质表达,MTT实验分析细胞增殖能力.结果 稳定转染PTEN基因的细胞系有外源目的 基因的mRNA及其蛋白表达.MTT实验表明,pcDNA3.1/PTEN 转染组细胞增殖能力低于pcDNA3.1(-)转染组和对照组 (P＜0.05).结论 外源性抑癌基因PTEN的稳定表达可抑制人卵巢癌细胞系SW626的增殖.     

人血管生成素相关家族蛋白-1 angioarrestin基因真核表达载体的构建与鉴定

目的:克隆人血管生成素相关家族蛋白-1 angioarrestin基因,构建angioarrestin基因的真核表达载体.方法:从人肝cDNA文库中经PCR扩增出angioarrestin基因及其C-端FD domain,经纯化、回收目的片段,将其插入克隆载体pcDNA3.1/His-Myc(-)B,构建重组质粒pcDNA3.1-ARP和 pcDNA3.1-FD,稳定转染大细胞肺癌NCI-H460细胞,RT-PCR和Western印迹法鉴定.结果:从人肝cDNA文库中扩增出1 473 bp的angioarrestin目的片段及其C-端560 bp FD domain,构建的重组质粒pcDNA3.1-ARP和pcDNA3.1-FD 经PCR及酶切鉴定与预期相符,经RT-PCR和Western印迹法确定稳定转染NCI-H460细胞成功.结论:成功构建了angioarrestin 和C-FD基因的真核表达重组质粒并转染NCI-H460细胞,为angioarrestin抗肿瘤血管形成作用机制的研究奠定了初步基础.     

人胰岛淀粉样多肽沉淀细胞模型的体外构建

目的构建人胰岛淀粉样多肽(hIAPP)基因真核表达载体,并在无内源性IAPP表达的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株上进行体外表达实验,建立可产生hIAPP沉淀的细胞模型。方法应用RT-PCR技术扩增得到hIAPP cDNA,将其克隆至真核表达质粒pcDNA3.1( )中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1( )-IAPP;随后用lipofectamine 2000介导转染CHO细胞,以RT-PCR法检测重组质粒在mRNA水平的表达,以Thiaflavin S染色的方法检测重组质粒在蛋白水平的表达。结果构建的pcDNA 3.1-hIAPP真核表达体系成功转染体外培养的CHO细胞,目的基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达,转染后培养48 h内的CHO细胞用Thioflavin S染色,与阴性对照相比较,证实有hIAPP的表达而导致细胞内淀粉样沉积发生。结论构建了hIAPP真核表达质粒,并成功在体外表达,从而建立了可产生IAPP淀粉样沉淀的体外哺乳动物细胞模型,为进一步研究胰岛淀粉样沉积的发病机制提供了良好的平台。     

pcDNA3.1(-)/UBE2C质粒在Chang Liver细胞中的表达和鉴定

[摘要] 目的 构建pcDNA3.1(-)/UBE2C真核表达质粒并建立人正常肝细胞Chang Liver的稳定表达株。方法 采用RT-PCR法从HepG2细胞中克隆得到UBE2C cDNA全长序列, 将之与pMD18-T载体连接。双酶切和测序鉴定后,再将UBE2C片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)。构建好的pcDNA3.1(-)/UBE2C真核表达质粒经双酶切和测序鉴定后,采用脂质体法将其转入Chang Liver细胞株中,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株,再用Western blot法检测转染后UBE2C的蛋白表达水平。结果 pcDNA3.1(-)/UBE2C质粒经双酶切鉴定和DNA测序证实,目的基因UBE2C的序列完全正确,真核表达质粒成功构建。Western blot检测显示,转pcDNA3.1(-)/UBE2C组UBE2C的蛋白表达水平高于转pcDNA3.1(-)组,具有统计学意义（P﹥0.01）。结论 成功构建UBE2C基因的真核表达质粒并建立其稳定表达的Chang Liver细胞株,为下一步研究奠定基础。     

人肠三叶因子重组真核表达载体的构建及在CHO/dhfr-细胞中的稳定表达

目的：构建人肠三叶因子（hITF）重组真核表达载体,并检测其在CHO/dhfr-细胞中的表达。方法：通过重叠延伸PCR法获得hITF cDNA片段,将目的基因插入真核表达载体pIRES/dhfr,得到重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr;经脂质体介导转染CHO/dhfr-细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO/dhfr-细胞系;用RT-PCR及ELISA法检测hITF的表达。结果：成功构建了重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达了目的基因。结论：成功构建了重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr,并在CHO/dhfr-细胞中分泌表达hITF蛋白,为进一步进行重组hITF的临床前研究奠定良好的实验基础。     

重组GSTP1真核表达质粒的构建及稳定转染NCI-H520细胞系的建立

目的构建pcD N A3.1(+)/G STP1真核表达载体并将其稳定转染到肺鳞癌细胞N C I-H 520中,建立稳定转染的N C I-H 520细胞系,为后续研究奠定基础。方法以pD N R-LIB-G STP1为模板,用PC R扩增G STP1 cD N A的编码区,并将扩增的cD N A片段与载体连接后亚克隆到真核表达载体pcD N A3.1(+)中。重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导入到人肺鳞癌细胞系N C I-H 520,经G 418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用W estern blotting检测转染前后该细胞株G STP1基因在蛋白水平的表达。结果 pcD N A3.1(+)/G STP1经酶切鉴定及D N A测序证实序列完全正确,真核表达载体构建成功;经W estern blotting检测,重组质粒转染株中G STP1基因的蛋白表达水平明显高于对照组,证实G STP1基因已稳定转染到N C I-H 520细胞中并得到表达。结论成功构建了pcD N A3.1(+)/G STP1真核表达质粒,建立了稳定表达G STP1的N C I-H 520细胞系,为进一步研究G STP1的生物学功能奠定了基础。     

波形蛋白真核表达质粒载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的构建重组人波形蛋白中间丝真核表达质粒载体pcDNA3.1-VIM并检测波形蛋白在肝癌HepG2细胞中的稳定表达。方法通过RT-PCR技术从人胎盘组织总RNA中扩增波形蛋白基因,经限制性核酸内切酶BamHⅠ-EcoRⅠ消化,然后插入pcDNA3.1(+)载体,脂质体介导重组质粒和空质粒分别转染HepG2细胞,G418筛选稳定表达细胞株,采用免疫细胞化学技术检测目的基因的表达。结果经DNA序列分析和限制性核酸内切酶消化,证实重组载体pcDNA3.1-VIM已正确克隆,建立的稳定细胞株高表达波形蛋白。结论成功地构建了重组质粒pcDNA3.1-VIM载体和建立了稳定表达波形蛋白的人肝细胞癌细胞株,为进一步研究波形蛋白与癌细胞生物学行为之间的相互关系奠定了基础。     

人淋巴细胞趋化因子真核表达质粒的构建及其在细胞中的表达

目的构建人淋巴细胞趋化因子(human lymphotactin，hLpm)真核表达质粒，并在膀胱肿瘤细胞株BIU-87中的表达重组质粒。方法用RT—PCR法自活化的人外周血淋巴细胞扩增hLpm的含编码区序列的cDNA，克隆至pGM—T Easy T载体，测序正确后，将目的片段插入pcDNA3．1( )载体，获得阳性克隆pcD—NA3．1( )-hLpm，用脂质体将其转染BIU-87细胞，经G418筛选稳定表达克隆，用免疫荧光染色技术鉴定经筛选的克隆。结果克隆的cDNA序列与GenBank中U23772的序列编码区内第225位碱基不同．系同义突变；构建了真核重组表达载体pcDNA3．1( )-hLptn；筛选获得了稳定表达转染hLpm的BIU-87细胞株。结论成功构建的hLpm真核表述系统可在人膀胱肿瘤细胞株BIU-87中稳定表达，为研究hLpm基因介导的人膀胱肿瘤特异性主动免疫治疗奠定了基础。