双靶区反义RNA对乙型肝炎病毒转基因小鼠抗病毒疗效的研究

目的探讨针对乙型肝炎病毒（HBV） X、P双靶区反义RNA对乙型肝炎转基因小鼠HBV复制和表达的影响.方法构建表达HBV X、P双靶区正、反义RNA的重组载体质粒,与脂质体混合,经尾静脉注入小鼠体内,用酶联免疫法检测血清HBsAg;用荧光聚合酶链反应定量法检测血清HBV DNA含量;用免疫组化法检测肝细胞HBsAg、HBcAg的表达;小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏常规病理切片,观察反义RNA对小鼠脏器的影响.结果小鼠血清HBsAg表达,pLXSN-asX组和pLXSN-asXP组均于第四周明显低于给药前,最高抑制率分别达24%、27%;其余组未出现明显变化.与给药前相比,小鼠血清HBV DNA的复制,在pLXSN-asX组和pLXSN-asP组分别于第2周、第8周达到抑制高峰,抑制率均为58%;在pLXSN-asXP组于第1周、第8周出现两次抑制高峰,抑制率分别为66%、77%;其余组未出现明显变化.8周后,pLXSN-asX组、pLXSN-asP组和pLXSN-asXP组小鼠肝细胞HBsAg、HBcAg的表达显著低于其他组.小鼠脏器组织学观察未见异常.结论 HBV X、P双靶区反义RNA对乙型肝炎病毒转基因鼠有显著抗HBV作用,且在作用效率和作用时间上优于单靶区反义RNA.     

阳离子脂质体对反义寡核苷酸抗乙型肝炎病毒作用的促进

目的 :考察阳离子脂质材料 3β [N (N′,N′ 二甲基胺乙基 )胺基甲酰基 ]胆固醇 (3β [N (N′,N′ dimethylaminoethane) carbamoyl]cholesterol,DC chol)与反义寡核苷酸 (antisenseoligodeoxynucleotide ,asODN)的结合能力及asODN阳离子脂质体的细胞毒性和抗病毒活性。方法 :以DC chol从水相中萃取asODN的萃取率评价不同条件下DC chol与asODN的作用力 ;通过四唑盐比色法检测含DC chol的阳离子脂质体对HepG2 2 .2 .1 5的细胞毒性 ;以酶联免疫法 (ELISA)检测细胞上清培养液中HBsAg和HBeAg的含量 ,考察不同asODN阳离子脂质体的抗病毒活性。结果 :当正负电荷比 >0 .6时 ,DC Chol能有效的从水相中萃取asODN (萃取率 80 %～ 1 0 0 % ) ;碱性条件和强离子 (Na+ /Cl-)的存在不利于DC Chol与asODN的作用 ;DC chol阳离子脂质体具有一定的细胞毒性 ,在低质量浓度时 (0 .84～ 2 6 .94mg·L-1 )脂质体的细胞毒性与DC chol浓度成正比 ;当asODN在 1 .2 5～ 5 .0 0 μmol·L-1时 ,其抗病毒活性与剂量相关 ;脂质体可提高asODN对乙肝病毒的抗病毒活性 ,其中阳离子脂质体对asODN抗病毒活性的促进作用较明显 (从 6 0 %到 95 % )。结论 :表面修饰DC Chol阳离子脂质体能有效地促进asODN的抗乙肝病毒活性。     

反义X区RNA和反义P区RNA小鼠体内抗HBV的比较

目的:探讨针对乙型肝炎病毒(HBV)X区反义RNA和P区反义RNA对乙型肝炎转基因小鼠HBV复制和表达的影响.方法:构建表达HBV X区反义RNA和P区反义RNA的重组载体质粒,与脂质体混合,经尾静脉注入小鼠体内,用荧光聚合酶链反应定量法检测血清HBV DNA含量,用Nested-PCR法检测血清HBV DNA转阴率.结果:PLXSN-asX小鼠血清HBV DNA的复制于给药后2 d被抑制,至给药后8周抑制依然存在;PLXSN-asP小鼠血清HBV DNA的复制于给药后4 wk被抑制,至给药后8周抑制处于上升趋势. 与给药前相比,小鼠血清HBV DNA的复制,在PLXSN-asX组和PLXSN-asP组分别于2和8 wk达到抑制高峰,抑制率均为58%; 8周后小鼠血清HBV DNA转阴率PLXSN-asX组和PLXSN-asP组分别为25.0%(2/8), 12.5%(1/8).结论:HBV X区反义RNA与HBV P区反义RNA对乙型肝炎病毒转基因鼠抗HBV作用效率无显著差异,但X区反义RNA的起效时间明显早于P区反义RNA.     

双靶区反义RNA抑制乙型肝炎病毒

目的:研究双靶区反义RNA的逆转录病毒载体的转染、表达及其抗乙肝病毒(HBV) 的作用.方法:合成互补于HBV X区(1400-1430)的X片段、互补于HBV P区(2375-2405) 的P片段,分别构建表达单靶区反义X或P的重组逆转录病毒载体质粒和表达双靶区正义、反义 X 和 P 重组逆转录病毒载体质粒 ,转染PA317细胞,NIH3T3 细胞扩增法测假病毒颗粒的滴度.用假病毒颗粒感染2.2.15细胞,用酶标法检测2.2.15细胞上清 HBsAg和HBeAg含量.结果:对HBsAg的抑制率在感染后第3、5、7、9天时分别为 pLXSN:5%, 4%, 6%, 4%; pLXSN+Xpos/Ppos:1%, 5%, 5%, 11%; pLXSN+X:16%, 45%, 44%, 38%; pLXSN+P :34%, 59%, 55%,51%; pLXSN+X/P:73%, 83%, 81%, 79%.对HBeAg的抑制率在感染后第3 、5、7、9天时分别为pLXSN:2%, 6%, 4%, 3%; pLXSN+Xpos/Ppos:6%, 0, 0, 0; pLXSN+ X: 13%, 53%, 52%, 45%; pLXSN+P: 21%, 57%, 56%, 49%; pLXSN+X/P :62%, 87%, 84%,79%.结论:细胞内表达HBV反义RNA有明显抗乙肝病毒复制和表达的作用 ,而且双靶区反义RNA抗乙肝病毒的作用较单靶区反义RNA更明显.     

乙型肝炎病毒核心基因转基因小鼠的建立

目的：建立乙型肝炎病毒核心基因转基因小鼠。方法：构建乙型肝炎病毒核心基因真核表达载体pcDNA3-HBc;采用显微注射法将线性化的表达载体注射至小鼠受精卵的雄性原核巾,然后将注射存活的受精卵植入假孕母鼠的输卵管;取其产10d龄子代鼠进行鉴定。结果与结论：表达载体内切酶酶切及序列分析结果与预期一致;PCR鉴定转基因阳性小鼠比例为25％(6／24)。可表达核心蛋白基因的转基因小鼠成功建立。     

应用RNA干扰技术抑制乙型肝炎病毒抗原表达的实验研究

目的 构建针对乙型肝炎病毒(HBV)核心区的siRNA表达载体pSIHBV／C,观察其对HBV复制和表达的影响。方法 将构建成功的pSIHBV／C与1．3倍HBV真核表达质粒pHBV1．3共转染HepG2细胞,转染后24、48、72h,用Abbott试剂检测细胞上清中HBsAg和HBeAg,并用免疫荧光染色法观察细胞内病毒核心抗原和表面抗原的表达。结果 成功构建了针对HBV核心区的siRNA表达载体pSIHBV／C,并发现它能明显抑制HBsAg和HBeAg的分泌,转染后第2天抑制率达高峰,分别为92％、85％,而随机序列的siRNA无此作用。免疫荧光染色结果也证实转染24b后,随pSIHBV／C比例的升高,其对HBV抗原表达的抑制作用也随之增加,当pSIRNA／C与pHBV1．3比例为1：20时,pSIHBV／C对细胞内HBsAg和HBcAg表达的抑制作用最强。结论 乙型肝炎病毒核心区的siRNA具有显著和特异的抗HBV复制和表达的作用。     

乙型肝炎病毒基因疫苗免疫小鼠的初步研究

为构建编码HBV表面抗原蛋白S的重组真核表达质粒pCR3.1-S,将它直接肌肉注射BAIB/c小鼠,以ELISA法检测免疫小鼠血清,另用~3H-TdR掺入法测定淋巴细胞增殖活性。结果表明,HBV基因疫苗pCR3.1-S可诱发小鼠产生体液和细胞免疫应答。     

RNA干扰的抗病毒作用：阻止乙型肝炎病毒复制的新策略

近年来，科学家们发现了一种普遍存在的重要的基因调节机制，被称为RNA沉默或者是RNA干扰(RNAi)。虽然RNAi基因调节的机制并没有完全搞清楚，但科学家已将研究的重点放在治疗作用上，特别是抗病毒作用。本文介绍了近年利用小干扰RNA(siRNA)阻止乙肝病毒复制的多个成功的体内和体外研究。这些研究使我们离使用RNAi作为一种抗病毒治疗的手段越来越近。     

双靶区反义RNA抗乙型肝炎病毒的实验研究

目的 探讨表达乙型肝炎病毒（HBV）双靶区反义RNA的逆转录病毒载体对HBV复制和表达的影响。方法 用分子克隆法构建表达HBVX、P双靶区正、反义RNA的重组载体质粒,转染PA317细胞,用NIH3T3细胞扩增法检测假病毒颗粒滴度,以假病毒颗粒感染2.2.15细胞,用酶标法检测其上清HBsAg和HBeAg,并以荧光聚合酶链反应定量方法检测2.2.15细胞内DNA和RNA含量。结果 HBVX、P双靶区反义RNA抗HBV的作用较单靶区反义RNA更明显,且对HBVS、C、P三个开放读码区的DNA和RNA抑制作用大,正义RNA无明显抑制作用。结论 细胞内表达HBV反义RNA具有明显抗HBV复制和表达的作用。双靶区反义RNA作用更明显。     

RNA干涉对乙型肝炎病毒复制和表达的影响

目的：观察HBV S区和C区特异性的小发夹RNA（shRNA）表达载体对HepG2.2.15细胞中HBV复制和表达的影响。方法：采用含有pol Ⅲ启动子的真核表达载体pSilenceCircle-U6构建针对HBV S区和C区的特异性shRNA表达质粒SC-S和SC-C。实验设立SC-S组、SC-C组、无关对照SC-N组和空白对照组,采用不同浓度的重组载体转染HepG2.2.15细胞,并作用不同时间。应用ELISA方法检测细胞上清液中的HBeAg和HBsAg,用斑点杂交方法检测细胞上清中的HBV DNA。结果：成功构建了含目的序列的重组质粒SC-S和SC-C。SC-S对HBeAg和HBsAg表达的抑制率明显高于SC-C;随着给药浓度的增加,SC-S对HBeAg和HBsAg表达的抑制率逐渐增强;SC-S转染HepG2.2.15细胞后第3天产生明显抑制效应,对HBeAg及HBsAg表达的抑制率在第6天达高峰,第9天抑制率仍较高。斑点杂交结果显示,SC-S对HBV复制的抑制效应强于SC-C。结论：构建的HBV S区和C区特异性shRNA表达质粒有明显、高效抑制HBV复制和表达的作用。     

双靶区反义RNA抗乙型肝炎病毒的实验研究

目的 研究双靶区反义RNA重组载体质粒的转染、表达及抗乙型肝炎病毒的作用。方法 构建表达乙型肝炎病毒X、P双靶区正、反义RNA的重组载体质粒与脂质体混合,经尾静脉注入小鼠体内,用荧光聚合酶链反应定量法检测血清乙型肝炎病毒DNA含量,用Nested—PCR法检测血清乙型肝炎病毒DNA转阴率。结果 与给药前相比,小鼠血清乙型肝炎病毒DNA的复制,在逆转录病毒载体-asX组和逆转录病毒载体-asP组分别于第2、第8周达到抑制高峰,抑制率均为58％;在逆转录病毒载体-asXP组于第1、第8周出现两次抑制高峰,抑制率分别为66％、77%;其余组未出现明显变化。给药后8周,小鼠血清乙型肝炎病毒DNA,在逆转录病毒载体-asX组、逆转录病毒载体-asP和逆转录病毒载体-asXP分别有2只、1只,1只转阴,转阴率分别为25.0％、12．5％、16．7％。结论 乙型肝炎病毒X、P双靶区反义RNA对乙型肝炎病毒转基因鼠乙型肝炎病毒DNA的抑制作用优于单靶区反义RNA,但其对血清乙型肝炎病毒DNA的转阴率与单靶区反义RNA无显著性差异。     

HBV转基因小鼠尿液中乙肝病毒相关指标的分析

目的检测分析HBV转基因小鼠尿液中HBV相关指标表达情况,进一步认识转基因小鼠的生物学特性;并通过多种实验方法确定尿液中HBV相关指标的组织来源。方法使用酶联免疫吸附法(ELISA)和荧光定量PCR(real-time PCR)检测转基因小鼠尿液中HBV相关指标;并通过水动力转染的小鼠实验、RNA干扰方法抑制HBV表达转基因鼠实验、乙肝患者HBV阳性血清感染正常小鼠实验等多种实验方法确定其复制表达组织来源。结果 HBV转基因小鼠尿液中存在HBsAg、HBe Ag、及HBV-DNA表达,其中HBsAg的表达水平较高(6674±619.8 IU/m L),但低于血清中HBsAg的表达水平(16470±2704 IU/m L),尿液HBsAg雄性小鼠的表达水平高于雌性小鼠;而尿液HBe Ag表达水平较低,且尿液中HBe Ag的阳性率高于血液,HBe Ag的表达水平个体间和性别间有明显差异;尿液中存在HBV-DNA含量达到10~3~10~5copy/m L;未检测到相关抗体表达。通过水动力转染等实验表明转基因鼠尿液中的HBV相关指标来源于肾脏的复制表达,而不是由肝脏分泌进入血液循环以尿液排出,肾脏是HBV独立的表达场所。结论转基因小鼠尿液中存在HBV相关指标的表达,并随月龄长期表达,其中HBsAg及HBV-DNA表达水平较高且比较稳定,雄性小鼠尿液HBsAg的滴度高于雌性小鼠;HBe Ag雄性鼠表达水平相对雌性鼠较高且比较稳定;尿液中无各类抗体表达;肾脏也是HBV独立的复制表达场所。     

氧化苦参碱对乙型肝炎病毒转基因小鼠乙肝抗原表达的影响

目的：研究氧化苦参碱抗乙型肝炎病毒的作用,并初步探讨其作用机制。方法：以乙型肝炎病毒全基因组转基因小鼠ＩＣＲ－ＴｇＮ（ＨＢＶａｄｒ１．２）ＳＭＭＵ 为动物模型,运用ＥＬＩＳＡ和免疫组化的方法检测小鼠肝脏内乙肝抗原含量。结果：分别予氧化苦参碱１００, ２００, ３００ ｍ ｇ／ｋｇ 腹腔注射,１次／ｄ,３０ ｄ 后,乙型肝炎病毒转基因小鼠肝脏内ＨＢｓＡｇ 和ＨＢｃＡｇ 的含量较空白对照组（予等体积生理盐水腹腔注射）均有明显的下降,且对两者作用一致;进一步的研究表明氧化苦参碱２００ ｍ ｇ／ｋｇ 作用１０ ｄ,２０ ｄ 时小鼠肝脏内ＨＢｓＡｇ 和ＨＢｃＡｇ 的含量较治疗前有明显的下降。结论：氧化苦参碱能降低乙型肝炎病毒转基因小鼠肝脏内ＨＢｓＡｇ 和ＨＢｃＡｇ 的含量,有抗乙型肝炎病毒作用。     

不同转染方式在反义RNA抑制HBV基因表达中的比较

为了比较不同转染方式的转染效率，本文利用针对ＨＢＶＳ基因和ｅ基因的反义ＲＮＡ真核表达载体，分别以磷酸钙法和脂质体法转染人肝癌细胞系ＨｅｐＧ２．２．１５，通过ＲＩＡ方法检测转染３天后细胞培养液中ＨＢｓＡｇ和ＨＢｅＡｇ的表达水平，以观察内源性反义ＲＮＡ对ＨＢＶ基因表达的抑制作用。研究证实脂质体法转染效率更高，说明脂质体是较理想的基因治疗运载方式。     

针对HBVS区的siRNA的抗病毒活性

目的: 体外观察siRNA对HepG2 2.2.15细胞中乙型肝炎病毒(HBV)S-mRNA及HBsAg,HBeAg产生的影响. 方法: 设计并合成针对HBV S区的三条siRNA,构建含上述siRNA的表达载体pSilencer ZY1,pSilencer ZY2和pSilencer ZY3,pSilencer HK2测序及酶切鉴定后用脂质体介导重组质粒转染HepG2 2.2.15细胞,用酶免分析法对HepG2 2.2.15细胞上清中HBsAg,HBeAg进行检测,用逆转录聚合酶链反应检测HBV S-mRNA.结果: 成功构建了针对HBV S区的siRNA的表达载体,三条siRNA均可程度不同地抑制HepG2 2.2.15细胞上清中HBsAg,HBeAg的分泌,72 h抑制率达高峰,对HBsAg的抑制率分别为81%,29%及78%,对HBeAg的抑制率分别为35%,3%及49%,并有抑制HBV S-mRNA的作用.结论: 针对HBV S区的siRNA能明显抑制HBV的复制.     

抗HBV反义寡核苷酸的筛选

目的 筛选出对HBV有抑制作用的反义寡核苷酸(AS-ONs),为HBV的预防和治疗提供基础.方法 合成5条与HBV互补的反义寡核苷酸,转染HepG2.2.15细胞,运用荧光定量PCR和酶联免疫法测定反义寡核昔酸对细胞培养液中HBVDNA和HBsAg、HBeAg的抑制作用.结果 寡核苷酸序列Ⅰ(TAC CTC TYG T...     

HBV基因疫苗诱导正常及HBV转基因小鼠产生体液免疫应答

目的:用乙型肝炎病毒(HBV)蛋白基因真核表达载体诱导正常小鼠及HBV转基因小鼠产生特异性体液免疫应答,以探讨其预防及治疗HBV慢性感染的可行性.方法:将HBV S2.S基因的真核表达载体pCMV-S2.S(PS)和相应的空载体pcDNA3.0分别免疫正常C57BL/6小鼠及同一品系HBV转基因小鼠(n=5).每只小鼠肌内注射纯化质粒100 μg.用ELISA方法检测小鼠血清抗HBs和抗preS2效价及HBV转基因小鼠血清HBsAg和HBeAg的水平.注射基因疫苗后第8周,活检取转基因小鼠肝脏组织,制备石蜡切片并行H-E染色,光镜下观察其病理改变.结果:PS诱导正常及转基因小鼠产生了抗HBs及抗preS2,并且抗preS2的出现早于抗HBs约1～2周.PS免疫8 周后,转基因小鼠血清HBsAg和HBeAg为阴性.注射基因疫苗后第8周病理检查转基因小鼠肝脏组织,肝细胞出现程度不同的广泛浊肿和水样变性,而相应的对照组无明显改变.免疫前后肝组织内单个核淋巴细胞数量无显著变化.结论:研究表明HBV中蛋白基因疫苗能够有效诱导HBsAg特异性的体液免疫应答,能够清除转基因小鼠血清中的HBsAg和HBeAg;初步的实验结果为研制治疗HBV慢性感染的基因疫苗提供了依据.