应用PCR方法检定单核细胞增多性李斯特菌

目的建立单核细胞增多性李斯特菌（单增李斯特菌）快速、敏感、特异的ＰＣＲ诊断方法。方法选取ｈｌｙＡ基因作为靶序列设计一对引物，用该引物对５４株标准李斯特菌和２１株无关菌进行ＰＣＲ扩增，得到进一步验证。采用ＰＣＲ和常规鉴定方法同时对从国内食品分离的３３株李斯特菌进行鉴定。结果可扩增含有保守ＨｉｎｄⅢ切点的７４３ｂｐ片段。表现出极好的单增李斯特菌种特异性。纯培养的检测极限为５５个菌。发现其中１８株用两种方法都鉴定为单增李斯特菌，两种方法的结果完全符合。当用于食物标本检测时，ＰＣＲ反应遭强烈抑制。经过２５小时的增菌培养，对培养物进行化学抽提、纯化的菌体经加热裂解后直接用作ＰＣＲ反应模板，可使抑制作用大大降低。每毫升牛奶人工接种４个菌可用该法特异检出。结论建立了ＰＣＲ方法，可初步用于单增李斯特菌的快速、特异、敏感诊断。     

应用RCP方法检定单核细胞增多性李斯特菌

目的 建立单核细胞增多性李斯特菌（单增李斯特菌）快速、敏感、特异的ＰＣＲ诊断方法。方法 选取ｈｌｙＡ基因作为靶序列设计一对引物，用该引物对５４株标准李斯特菌和２１株无关菌进行ＰＣＲ扩增，得到进一步验证，采用ＰＣＲ和常鉴定方法同时对从国内食品分离的３３株李斯特菌进行鉴定。结果 可扩增含有保守Ｈｉｎｄ Ⅲ切点的７４３ｂｐ片段。表现出极好的单增李斯特菌种特异性。纯培养的检测极限为５５个菌。发现其中１８株     

单核细胞增生李斯特菌PCR鉴定技术的研究

目的建立单核细胞增生李斯特菌PCR鉴定技术.方法选择Hly Inl基因设计扩展片段分别为300～400bp、600～700bp的二对特异性引物,进行PCR扩增.结果单增李斯特菌标准菌株及本实验室分离保存的单增李斯特菌均扩增出两条明显条带,其它食品中常见致病菌及非单核细胞增生李斯特菌均不见扩增条带.52株李斯特菌生化符合菌中,有30株菌同时扩增出两条明显条带,与Mini-VIDSA测定法比较,两者符合率达92.31%.结论本实验建立的PCR鉴定技术为一种简便、快速、敏感、特异的单增李斯特菌鉴定方法.     

食品中单增李斯特菌PCR检测方法建立与评价

目的建立单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）快速、敏感、特异的PCR诊断方法。方法采用聚合酶链式反应技术（PCR）特异性扩增单核细胞增生李斯特菌溶血素基因（hlyA），并评价该方法的特异性与敏感性。结果在706bp处出现nuc基因的目的片断，只有单增李斯特菌的目的片段获得扩增，其他菌种扩增均呈阴性；该方法可以检测到3．3ng／L的DNA。结论PCR方法比传统细菌检测方法更特异、快速、灵敏和简便。为食品中单增李斯特菌的快速检测提供了新的手段。     

单增李斯特菌PCR-ELISA快速检测技术研究

目的建立快速检测单增李斯特菌的PCR-ELISA方法,将其应用于人工污染的食物样品检测。方法根据GenBank数据库资料,应用分子生物学软件DNAMAN6.0和Primer Premier5.0,以单增李斯特菌的致病基因hlyA为基础,选用PCR引物,应用地高辛标记试剂盒,获得单增李斯特菌特异的地高辛标记片段。根据PCR目的片段序列,设计特异性捕获探针,建立了单增李斯特菌PCR-ELISA快速检测方法。应用该方法对不同血清型的单增李斯特菌食品分离株进行了检测,并将PCR方法与PCR-ELISA方法对人工污染单增李斯特菌的牛奶样品的检测敏感性进行了比较。结果应用单增李斯特菌特异的PCR-ELISA方法完成检测约需6h。该方法对单增李斯特菌分离株检测的结果,与国家食源性疾病检测网的鉴定结果100%符合。经过12h的增菌培养,PCR-ELISA方法最低可从25ml样品中检出1CFU,检测敏感性为传统PCR方法的10～100倍。结论建立了单增李斯特菌PCR-ELISA快速检测方法。该方法敏感性高、特异性强、可靠性好,对于提高食源性疾病预警、预测能力,增强检测的时效性和准确性,具有推广应用价值。     

两种方法检测单增李斯特菌的比较研究

[目的]探讨建立快速、准确的单增李斯特菌的检测方法。[方法]采用荧光定量PCR和传统细菌培养法,同时对单增李斯特菌进行检测,并对其敏感性与特异性进行比较。[结果]荧光定量PCR检测的敏感性可达19cfu／ml,敏感性高于细菌培养法,且特异性强,从细菌核酸提取至完成检测仅需3h。[结论]荧光定量PCR检测是快速敏感的方法,在应对突发公共卫生事件中能起到重要作用。     

奶液模拟标本中单增李斯特菌real-time PCR检测方法的建立

目的建立了基于TaqMan探针的real-time PCR技术针对奶液模拟标本中单增李斯特菌的快速检测方法。方法用单增李斯特菌hlyO基因的部分片段作为靶基因,制作标准曲线,定量检测奶液中的单增李斯特菌。结果通过对不同李斯特菌及一些较为常见的致病菌的DNA进行扩增,只有单增李斯特菌能够产生扩增曲线,其余菌株均不产生扩增曲线。单增李斯特菌的检测灵敏度可以达到9copies/反应体系。结论该方法特异性好,灵敏度高,整个实验可在1.5h内完成,可用于食品中单增李斯特菌的快速检测和疫情暴发时的相关病原调查。     

李斯特菌属荧光定量PCR检测方法的建立

目的采用荧光定量PCR技术,建立可以同步检测李斯特菌属与单增李斯特菌的快速检测方法。方法选取单增李斯特菌hlyM基因和李斯特菌属23Sr DNA基因为靶基因,分别设计引物和探针,在构建二者的阳性重组质粒基础上,对李斯特菌属和单增李斯特菌进行荧光定量PCR的检测。结果建立的李斯特菌属和单增李斯特菌单重荧光定量PCR检测方法与双重荧光定量PCR的检测方法敏感度一致,分别为18.6拷贝/μl和23.2拷贝/μl。结论建立的双重荧光定量PCR方法可以同步检测李斯特菌属与单增李斯特菌。     

荧光实时定量PCR检测单核李斯特菌方法学建立及应用

目的 建立检测单核细胞增多性李斯特菌的荧光定量PCR方法，并利用此方法检测人工污染的牛奶中单增李斯特菌菌量。方法 选择单增李斯特菌特异性的基因Listeriolysin O基因为靶目标设计引物，采用煮沸法抽提纯单增李斯特菌株（1／2a）DNA，建立SYBRGREEN实时定量PCR检测体系：结果 定量PCR对李斯特菌可产生特异扩增信号，对其他菌（大肠杆菌）无响应。标准曲线的相关系数为0．9521。最小检菌量约为100个菌落形成单位／反应体系。在人为污染牛奶检测中，与传统细菌计数方法结果相比，相关系数为0．839。结论 实时定量PCR是一种快速、灵敏的定量检测单增李斯特菌的方法，可用于牛奶样品的检测。     

单增李斯特菌鉴定方法比较研究

[目的]对单增李斯特菌鉴定方法进行研究。[方法]分别用API检测方法、16SrRNA序列分析法和焦磷酸测序法对17株单核细胞增生李斯特菌进行检测。[结果]3种方法均能准确鉴定单增李斯特菌。[结论]焦磷酸测序方法检测单增李斯特菌特异性强、经济、操作简便、检测快速,为单增李斯特菌的快速、高通量检测提供了一种新的手段。     

水体污染中常见致病菌的多重PCR分子检测研究

[目的]建立同时检测沙门氏菌、志贺氏菌、绿脓杆菌、肠出血型大肠杆菌和副溶血弧菌等5种水体常见致病菌的多重PCR检测技术,为这些致病菌感染的快速诊断提供实验依据。[方法]筛选设计5对特异引物,建立优化的多重PCR扩增体系和条件。[结果]对5种致病菌的检测,多重PCR灵敏度分别为：肠出血型大肠杆菌O157102 cfu、志贺氏菌102 cfu、副溶血弧菌102 cfu、绿脓杆菌101 cfu、沙门氏菌102 cfu。应用于人工污染水样及天然水样的检测,均有清晰、特异的预期条带产生,并与传统检测结果一致,每个样品所需时间为6～8 h,相对于传统检测方法,极大地缩短了检测时间,提高了检测灵敏度。[结论]该方法适用于大通量样品的检测研究,可推广应用于食品检测、环境监测等领域。     

LAMP法和PCR法快速检测阪崎肠杆菌的比较

[目的]建立阪崎肠杆菌环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测技术,并与PCR检测方法进行比较,为阪岐肠杆菌感染的快速诊断提供实验依据。[方法]根据阪崎肠杆菌外膜蛋白OmpA基因,设计特异性引物,建立LAMP和PCR检测技术体系,并对2种方法检测的灵敏度、特异性和实际样品的检测结果进行比较。[结果]建立了优化的LAMP和PCR检测体系,灵敏度检测结果显示,LAMP检测限为101cfu/ml,PCR检测限为102cfu/ml,LAMP检测灵敏度高于PCR;对36株近源菌进行特异性检测,结果显示,LAMP仅8株阪崎肠杆菌得到阳性结果,PCR产物则出现非特异性条带,LAMP特异性比PCR高。应用于46份奶粉样品的检测,LAMP和PCR均有清晰、特异的预期条带和结果产生,并与常规检测结果一致。[结论]LAMP检测技术作为一种快速检测阪崎肠杆菌的方法具有简便、灵敏快速,与PCR方法比较,特异性强、操作简便、检测成本低,耗时短,更有望发展成为快速检测阪岐肠杆菌的有效手段。     

TaqManTM实时荧光PCR快速检测沙门氏菌的初步研究

[目的]建立实时荧光TaqManTM检测沙门氏菌的快速检测方法,为食物中毒快速准确的定性检测及食品中沙门氏菌染菌的调查提供手段,也为建立实时荧光TaqManTM同时检测多种细菌性食物中毒目标菌奠定基础. [方法]通过分析沙门氏菌invA、hilA、fimA、hns、spy、hut基因和16S rDNA等目的基因,对比不同目的基因的优缺点,最终选择hut基因作为目的基因,在Genebank进行中查找多条hut基因序列,并利用DNAssist软件进行同源性分析,选取相对保守区段,用Beacon Designer软件自行设计引物和TaqManTM探针,并利用硅胶模型基因组DNA提取法制备基因组DNA,通过对TaqManTM实时荧光PCR缓冲液浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶浓度、引物浓度和探针浓度等反应条件的优化,初步建立沙门氏菌的TaqManTM实时荧光PCR快速检测方法. [结果]选取的hut基因同源性达到99％以上,特异性好.通过对各实验条件的优化,得到沙门氏菌TaqManTM实时荧光PCR的最佳反应条件,初步建立TaqManTM实时荧光PCR检测沙门氏菌的快速检验方法,该方法能在1h内完成整个检测过程.[结论]TaqManTM实时荧光PCR检测不但灵敏度高、特异性好,而且检测周期短,能提高沙门氏菌的检出率和检测准确性,可望应用于沙门氏菌食品及食物中毒的快速定性检测.     

甲型H1N1流感病毒real-time RT-PCR检测方法的研究与应用

[目的]建立一种特异、灵敏、快速的Real-Time RT-PCR方法用于检测甲型H1N1流感病毒核酸.[方法]采用WHO所推荐的引物与探针序列,对Real-Time RT-PCR反应体系和反应条件进行调整优化,检测该方法的特异性和灵敏度.并对疑似甲型H1N1流感病例咽拭子标本进行检测.[结果]该方法对甲型H1N1流感病毒的检测的灵敏度达10-7(HA滴度为1:128),可从疑似甲流感患者咽拭子中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需2.5 h左右.[结论]建立的TagMan探针法Real-Time RT-PCR是一种检测甲型H1N1流感病毒的快速、特异、敏感的新方法,适合于基层疾控机构及医院开展甲型H1N1流感的应急检测.     

大肠杆菌O_(157)∶H_7实时荧光PCR快速检测方法的建立

[目的]利用特异性荧光探针为特点的TaqM an荧光定量PCR技术,建立大肠杆菌O157∶H7污染的快速敏感特异的检测方法。[方法]以大肠杆菌O157∶H7的rfbE基因作为靶序列,设计一对引物和探针,以大肠杆菌O157∶H7菌株提取核酸DNA作为模板,优化引物和探针的浓度比和Mg2+浓度,以大肠杆菌O157∶H7和10种相关细菌考核检测体系的灵敏性、稳定性和特异性。[结果]建立的反应体系在引物和探针的浓度为0.6μmoL/L、0.8μmoL/L,Mg2+浓度为4mmoL/L时,具有良好的特异性和敏感性。在10株相关菌株的检测中,除大肠杆菌O157∶H7出现很好的阳性外,其余菌株均为阴性。在纯菌条件下,定量检测低限为17 cfu/mL。同一样品重复检测3次C t值的变异系数均小于5%。[结论]该方法特异性强,稳定性高,操作简便快捷,适应食品微生物检验发展需要,具有较大的推广及应用价值。     

3种方法鉴定单核细胞增生李斯特菌比较

[目的]采用分子生物学方法(accuprobe和PCR)对传统方法经ATB鉴定为单核细胞增生李斯特菌和疑为单核细胞增生李斯特菌的菌株进行鉴定比较,建立灵敏,快速,可靠的鉴定方法。[方法]对经传统方法结合ATB鉴定分离的菌株(单核细胞增生李斯特菌)分别采用accuprobe和PCR试剂盒进行鉴定比较。[结果]对10株经传统方法结合ATB鉴定的Lm菌(包括疑似Lm菌)经PCR鉴定,3株为阳性,7株为阴性,与accuprobe法鉴定结果一致。[结论]分子生物学方法检测单核细胞增生李斯特菌是对传统方法的有效补充,可用于大批量样品中致病菌的快速鉴定     

PCR方法快速检测食品中的金黄色葡萄球菌

目的建立聚合酶链反应(PCR)方法快速检测牛奶、冰淇淋及肉中的金黄色葡萄球菌(金葡菌)。方法针对金葡菌耐热核酸酶基因(nuc)、纤维蛋白原结合蛋白基因(ClfA)设计并合成2对引物进行PCR扩增,特异的检测金葡菌,并对52株金葡菌和31株非金葡菌进行扩增,验证方法的特异性。在牛奶、冰淇淋及肉中人工污染不同菌量,增菌培养,在不同时间段提取DNA进行PCR扩增,确定该方法在食品中的检出限。结果nuc、ClfA两对引物对金葡菌的检出均有很好的特异性,在3种食品中的检出限均为10cfu/g(ml),全部检测可在24h完成。结论建立了适用于牛奶、冰淇淋及肉中的金葡菌检测的快速、灵敏、特异的PCR方法。