原位杂交定位检测神经抑制再生基因Nogo-A mRNA体外培养的视神经少突胶质细胞的表达

目的观察神经生长抑制因子Nogo-A在体外培养的视神经少突胶质细胞的表达.方法用地高辛标记的寡核苷酸探针少突胶质细胞进行原位杂交,检测Nogo-A mRNA表达.结果原位杂交显示少突胶质细胞胞质中均呈现浓淡不一的淡黄色着色,细胞核不着色.结论原位杂交结果从基因水平证明,视神经少突胶质细胞能合成可以合成神经生长抑制因子NogoA.     

miR-219在新生SD大鼠炎症模型中通过ERK 1/2信号通路促进少突胶质细胞成熟

［］ 目的：建立新生SD大鼠炎症模型,模拟临床中新生儿合并炎症而导致的脑损伤,初步探究miR-219促进大脑少突胶质细胞成熟的机制,为进一步探讨新生儿合并炎症而导致的脑损伤发生机制提供参考。方法：采用Western-blot法检测少突胶质细胞成熟标记物MBP和ERK 1/2通路的mRNA转录和蛋白质表达水平,免疫荧光检测大鼠胼胝体少突胶质细胞的数量,并进一步观察ERK 1/2通路特异性抑制剂U0126对miR-219促少突胶质细胞成熟的影响。结果：与对照组相比,在使用miR-219 atagomir降低大鼠脑内miR-219的表达量后,MBP和ERK 1/2蛋白表达明显减少(P〈0.05),荧光结果显示胼胝体出少突胶质细胞数量明显减少。与炎症组相比,在使用miR-219 agomir增加大鼠脑内miR-219的表达量后,MBP和ERK 1/2蛋白表达明显增加(P〈0.05),荧光结果显示胼胝体出少突胶质细胞数量明显增加；使用ERK 1/2抑制剂U0126预处理后,MBP的表达明显减少(P〈0.05)。结论：在大鼠脑内miR-219对少突胶质细胞的促成熟作用是部分通过调控ERK 1/2通路活性发生的。     

胎牛血清对人胚胎神经干细胞分化的影响

目的：探索胎牛血清对人神经干细胞（NSCs）的影响。方法：采用细胞培养、免疫组化、流式细胞仪检测的方法，观察了不同浓度胎牛血清对人NSC分化的影响。结果：胎牛血清促进人NSC分化为神经系统的主要的3种细胞（神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞），且培养基中胎牛血清浓度为15％时，人NSC分化为星形胶质细胞的数量占80％－90％。结论：胎牛血清影响人NSC分化为神经元和神经胶质细胞的比例，并与胎牛血清的浓度有一定的关系。     

糖原合酶激酶3β对少突胶质前体细胞分化的影响

目的探讨抑制糖原合酶激酶3β活性对少突胶质前体细胞分化为成熟的少突胶质细胞的影响。方法原代分离培养少突胶质前体细胞,采用免疫印迹法和免疫荧光染色技术检测糖原合酶激酶3β在少突胶质前体细胞和少突胶质细胞中的表达。利用1.5 m M氯化锂抑制糖原合酶激酶3β96 h,采用免疫印迹法和免疫荧光染色技术检测糖原合酶激酶3β对少突胶质前体细胞发育的影响。结果随着少突胶质前体细胞发育为少突胶质细胞,总的糖原合酶激酶3β的表达量不变,而非活性形式的糖原合酶激酶3β(磷酸化的糖原合酶激酶3β)减少,说明活性糖原合酶激酶3β增加。加入氯化锂后,磷酸化的糖原合酶激酶3β显著增加,表明活性糖原合酶激酶3β减少,并且成熟的少突胶质细胞的标记物髓鞘碱性蛋白的信号显著减弱,表明抑制糖原合酶激酶3β的活性后明显阻碍了少突胶质前体细胞正常的分化过程。结论糖原合酶激酶3β在少突胶质前体细胞分化为成熟的少突胶质细胞的过程中起着重要的作用。     

大鼠脊髓源性少突胶质前体细胞的生物学特性

目的 探讨大鼠脊髓源性少突胶质前体细胞在体外条件下的增殖及分化等生物学特性,为进一步研究脊髓脱髓鞘疾病的髓鞘再生奠定基础.方法 采用免疫吸附法原代培养大鼠脊髓源性少突胶质前体细胞,并用免疫荧光染色鉴定其表面标志物A2B5及NG2;采用Alarm blue法检测其在体外的增殖能力,并绘制生长曲线;诱导原代培养的少突胶质前体细胞向成熟少突胶质细胞分化,并用免疫荧光染色鉴定成熟少突胶质细胞表面标志物MBP及GalC的表达情况.结果 免疫吸附法可以对大鼠脊髓组织中的少突胶质前体细胞进行有效的分离纯化,分离获得的少突胶质前体细胞A2B5及NG2表达呈阳性,Alarm blue法检测结果显示少突胶质前体细胞在体外具有良好的增殖能力,诱导分化实验证实少突胶质前体细胞可以分化为成熟少突胶质细胞并且MBP及GalC表达呈阳性.结论 采用免疫吸附法原代培养的大鼠脊髓源性少突胶质前体细胞在体外具有良好的增殖能力以及分化为成熟少突胶质细胞的能力.     

甲状腺激素促进神经再生的研究进展

甲状腺激素(thyroid hormones，TH)是中枢神经系统正常发育的重要调节因素，少突胶质细胞是中枢神经系统髓鞘形成细胞，神经纤维髓鞘的形成标志着中枢神经系统发育成熟。TH通过不同甲状腺激素受体来影响少突胶质细胞的分化与成熟，减慢少突胶质细胞前体细胞的增殖，促进其分化为成熟的少突胶质细胞，从而控制中枢神经细胞的正常发育。周围神经损伤后，其支配靶器官功能的重建依赖于神经营养因子、细胞外基质和激素。     

新生大鼠视神经少突胶质细胞原代培养及鉴定

目的：探讨视神经少突胶质细胞的分离方法和体外培养条件，为研究视神经损伤修复及少突胶质细胞相关课题研究奠定基础。方法：新生大鼠视神经取材，以DMEM／F12为基础的化学限定性培养基进行组织块培养，并用少突胶质细胞特异性标记物GC鉴定细胞。结果：培养第3天，视神经周围出现少突胶质细胞生长，呈圆形或梭形，10d左右基本铺满盖玻片。免疫细胞化学检测该细胞为阳性细胞，纯度较高。结论：采用视神经组织并用化学限定性培养基能成功获取体外培养的少突胶质细胞、较传统方法有获得细胞量大、纯度高、操作简便易行等特点。     

神经干细胞定向分化为少突胶质细胞的实验研究

目的:通过体外诱导使神经干细胞定向分化为少突胶质细胞,为从神经干细胞来源得到少突胶质细胞提供实验基础.方法:体外分离培养新生大鼠神经干细胞,加入甲状腺素(T3)和(或)胰岛素诱导分化,免疫细胞化学方法检测诱导末期NSC分化中GalC,GFAP的表达,通过比较增殖情况、分化率、GalC阳性细胞突起长度分析不同诱导因素组合对NSC定向诱导为少突胶质细胞的作用.结果:经甲状腺素和(或)胰岛素诱导后能够分化出少突胶质细胞,不同浓度T3和(或)胰岛素对少突胶质细胞分化的影响不同.结论:甲状腺素和胰岛素能诱导神经干细胞向少突胶质细胞分化,且促进分化细胞的增殖和成熟,T3(40ng/ml)和胰岛素(25μg/ml)共同使用时这一作用较明显.     

少突胶质细胞对PC12细胞JAK2基因表达的影响及其意义

目的 探讨少突胶质细胞对PC12细胞JAK2基因表达的影响及其意义。方法 用分离培养的少突胶质细胞及其细胞碎片分别作用于培养的PC12细胞,于不同作用时相点在观察PC12细胞突起变化的同时检测PC12细胞内JAK2mRNA的表达JAK2蛋白的磷酸化。结果 在给予少突胶质细胞及其细胞碎片处理后10min,JAK2 mRNA表达较对照组有显著增高（P＜0．05）,但处理12h后,其表达虽较处理10min及4h有显著下降,但仍显著高于对照组（P＜0．05）。对照组JAK2蛋白的活性较低,但少突胶质细胞及其细胞碎片加入后,JAK2蛋白很快便被磷酸化而激活,到处理后12h,激活的蛋白呈较处理10min有显著下降,但仍显著高于正常对照组（P＜0．05）。少突胶质细胞及其细胞碎片对其影响差别不显著（P＞0．05）。结论 少突胶质细胞作用于PC12细胞时可调节PC12细胞JAK2的表达与激活,这种表达与激活在一定程度上可能介导少突胶质细胞对PC12细胞突起生长的影响。     

Nogo-A分子对Neuro2A细胞突起生长的作用研究

【立论依据】 少突胶质细胞来源的Nogo-A分子,作为中枢神经系统损伤后重要的轴突抑制因子备受关注。近年来发现Nogo-A在神经元中呈现高表达,但是对于神经元中Nogo-A的自主性功能尚在起步研究阶段。我们更加关注,Nogo-A在神经元发育中潜在的功能。 【实验内容】 选择丙戊酸钠(VPA)诱导的神经母细胞瘤Neuro2A作为细胞分化模型,首先,考察Nogo-A分子在Neuro2A细胞未分化组,不同时间分化组中的表达模式;其次,利用RNA干扰技术下调Neuro2A细胞中内源性Nogo-A,考察细胞分化比例以及分化细胞中突起长度的变化情况。 【材料】 Neuro2A细胞系,VPA,DMEM培养基,胎牛血清,培养皿,Nogo-A抗体,免疫印迹相关耗材,shRNAs。 【可行性】 前期文献调研扎实。西安医学院科研平台拥有细胞培养室,可满足本实验中的细胞系培养。上述抗体已购置,针对Nogo-A的shRNAs已合成好。指导教师长期从事神经元分化与保护方面的研究,可提供了强有力的技术保障和实验指导。 【创新性】 少突胶质细胞表面的Nogo-A通过与神经元表面的NgR结合,激活RhoA-ROCK,进而抑制突起生长。近来大量的数据显示,神经元中的Nogo-A表达丰富,可能参与调控神经元的发生、分化。基于文献报道,本研究拟利用VPA诱导的Neuro2A细胞分化模型,明确Nogo-A在Neuro2A细胞分化过程中的表达变化,进一步利用RNA干扰策略下调内源性Nogo-A表达,通过细胞分化和突起生长的指标分析Nogo-A对Neuro2A细胞分化的影响,为研究神经元中Nogo-A的自主性功能提供依据。     

Differentiation of rat oligodendrocyte precursor cells in chemical conditional medium in vitro

Objective： To investigate in vitro differentiation of oligodendrocyte precursor cells （OPCs） into mature oligodendrocytes in chemical conditional medium. Methods： The mixed glial cells from cerebral cortices of 48-hour-old Sprague-Dawley （SD） rats were cultured in vitro. The OPCs were separated by shaking procedure around 9-10 d in the primary culture. Then the isolated OPCs were further transferred into the chemical conditional medium for cell differentiation. The pattern of OPCs maturation in vitro was continuously observed with contrast phase microscopy and mature oligodendrocytes were further identified by immunocytochemical assays. Results： OPCs grew well when co-cultured with glial cells and distinct cellular stratification formed about 9-10 d in the primary culture, which indicated the appropriate opportunity for the separation of OPCs. Following cultured in the chemical conditional medium, the OPCs progressively differentiated into the mature oligodendrocytes. These mature oligodendrocytes were also immunostained with the oligodendrocyte lineage-specific antibody, Oligo2. Conclusion： The OPCs isolated from the cerebral cortices of neonatal SD rats can progressively differentiate into mature oligodendrocytes in the chemical conditional medium in vitro.     

地塞米松对兔视神经钳夹伤治疗作用的实验研究

目的：观察地塞米松对家兔视神经钳夹伤后视网膜神经节细胞存活的影响及损伤视神经、视网膜Nogo-A表达的变化。方法：建立兔球后视神经钳夹伤模型，将健康成年家兔分为正常对照组、损伤组、治疗组。分别于损伤后3、7、14d天处死动物，观察单位面积视网膜神经节细胞存活数量及损伤后Nogo-A在视神经与视网膜中的表达变化。结果：视神经损伤后，治疗组视网膜神经节细胞的存活数量高于损伤组及对照组（P〈0.01）；对照组及损伤组损伤后3、7、14d视神经与视网膜中Nogo-A表达增强，至损伤后7d达高峰；治疗组视神经与视网膜Nogo-A表达亦增强，各时间点均弱于损伤组、对照组，差异有非常显著性（P〈0.01）。结论：视神经损伤后，地塞米松能够增加视网膜神经节细胞的存活数量，并下调Nogo基因的表达，这可能是地塞米松的药理作用机制之一。     

缺氧缺糖损伤对未成熟大鼠少突胶质前体细胞表达Nogo-A的影响

目的 观察Nogo-A在新生大鼠少突胶质前体细胞系(OLPs)缺氧缺糖(OGD)损伤后的表达变化,探讨其在OLPs损伤后的作用.方法 采用改良振荡分离纯化法体外培养OLPs,特异性抗体A2B5、O4和O1作细胞鉴定;用含连二亚硫酸钠的无糖培养基制作OLPs OGD模型,MTT法检测各组细胞存活率;用免疫荧光法和免疫印迹法观察Nogo-A在细胞OGD后的变化.结果 Nogo-A在OLPs OGD 10 min表达较正常对照组增强,30 min继续增高,60 min最高,差异有统计学意义(P＜0.05);MTT结果显示,OGD 30 min及60 min细胞存活率较对照组降低(P＜0.05).结论 OLPs在OGD后Nogo-A表达明显增强,细胞存活率降低,提示Nogo-A可能参与OGD后OLPs的再生抑制过程.     

Nogo-A基因敲除鼠视神经损伤后修复的实验研究

目的评价Nogo—A基因在视神经损伤后修复机制中的作用。方法Nogo-A基因敲除联合视神经损伤鼠为实验组（20只）,C57BL／6小鼠联合视神经损伤作为对照组（20只）。制备视网膜、视神经冰冻切片,采用免疫荧光技术检测视网膜神经节细胞和视神经中生长相关蛋白（GAP）43的表达。进行视网膜神经节细胞体外培养,进行GAP-43染色,采用图像分析系统计算细胞轴突长度。结果视神经中GAP-43表达：夹伤后1、3、7d对照组中表达少量GAP-43,实验组中GAP-43表达明显高于对照组（t=2．12,3．56、2．63,均P〈0．01）。GAP-43抗体染色可见着色在体外培养RGC轴突,实验组3d有较长轴突生长,对照组3d有较短轴突生长。RGC于培养1、3及7d,经自动图像分析系统处理,得出细胞突起长度,实验组突起长度明显高于对照组（F=41．36、31．23,均P〈0．01）。结论Nogo—A基因在抑制视神经损伤后轴突再生机制中起重要作用。     

Knocking-down of Nogo-A Gene Expression in PC12 Cell Line by Plasmid-based RNAi

To study the inhibitory effect of Nogo-A shRNA on cell line PC12, the Nogo-A shRNA （short hairpin RNA, or shRNA） was designed and synthesized. The annealed shRNA template was inserted into plasmid pGenesil-1 containing enhanced green fluorescent protein （EGFP） gene by gene cloning technique to generate eukaryotic expression vector. The recombinant plasmid was transfected into PC12 cells by lipofecamine2000 and the mRNA and protein expression level of Nogo-A gene was detected by RT-PCR and Western blotting 48 h after the transfection. Gene sequencing showed that that the Nogo-A shRNA eukaryotic expression vector was successfully constructed. No significant change was found in the Nogo-A mRNA and protein expression level in empty vector-transfected group as compared with controls （P〉0.05）, while the expression level in shRNA-transfected group decreased significantly （P〈0.05）. It is concluded that the pGenesil-1/Nogo-AshRNA recombinant plasmid can effectively suppress the expression of Nogo-A gene in PC12 cells.     

电针治疗对大鼠脊髓损伤后Nogo-A蛋白表达的影响

目的:探讨电针治疗对大鼠脊髓损伤(SCI)后Nogo-A蛋白表达的影响。方法:以96只2月龄Wistar大鼠为受试对象,SCI组于T9处行脊髓全横断,治疗组予电针治疗,采用Western blot测定各时间点及各组脊髓Nogo-A表达及变化,并以苏木精-伊红和免疫组化染色对受损脊髓进行形态学观察。结果:SCI后Nogo-A蛋白表达呈递增趋势,于14 d后最强;经电针治疗,Nogo-A表达减少。结论:Nogo-A是SCI后脊髓神经纤维再生的主要抑制因子,电针治疗对Nogo-A表达具有明显的抑制作用。     

髓鞘相关蛋白Nogo-A在纯化细胞核中的表达

目的：检测Nogo-A蛋白在纯化后的大鼠脊髓和小脑细胞核中的表达。方法：通过差速离心法得到大鼠脊髓和小脑样本的各亚细胞成分,利用非离子性去污剂NP-40纯化细胞核组分,采用Western blot方法检验核纯度并检测Nogo-A在各亚细胞成分中的表达。结果：纯化的细胞核抽提物中检测到特异的Nogo-A反应条带。结论：Nogo-A在纯化的细胞核中仍有明确表达,进一步证明了Nogo-A蛋白在中枢神经元的细胞核中有定位,并提示Nogo-A很可能以全长形式入核。     

Nogo受体及其拮抗剂与神经节苷脂在新生大鼠HIBD中的作用

目的观察Nogo-A受体拮抗剂NEP1-40及神经节苷脂对新生大鼠缺血缺氧性脑损伤后神经再生的作用。方法将100只7日龄新生大鼠随机分为10组:在6h、24h两个时间段分别设空白对照组,假手术组,缺氧缺血性脑损伤（HIBD）模型组,HIBD后NEP1 40治疗组及神经节苷脂治疗组，用原位杂交的方法观察各组别Nogo-A mRNA的表达情况。结果HIBD组两时段的Nogo-mRNA表达均高于同时段空白组及假手术组，差异有统计学意义；NEP1-40治疗组能抑制HIBD后mRNA的表达,与同时段模型组对比差异有统计学意义；神经节苷脂治疗组mRNA的表达在6h时与HIBD组无明显差异,在24h时较HIBD组低但高于空白组。P值均＜0.05。结论Nogo-A mRNA在缺氧缺血性脑损伤后表达显著增高,其编码的Nogo-A可抑制中枢神经损伤后的再生,NEP1-40能拮抗这一作用,从而可能在促进缺氧缺血性脑损伤后神经再生中起到作用。神经节苷脂GM-1在缺氧缺血性脑损伤后也可抑制Nogo-A mRNA的表达，有稳定细胞膜、减轻细胞水肿、促进神经再生的作用。     

髓鞘相关抑制因子在中枢神经系统轴突再生中的作用

成熟哺乳动物中枢神经系统损伤后轴突的再生是极其有限的。中枢神经再生困难之一是其内在的髓鞘相关抑制因子(MAIs)的存在,Nogo-A蛋白、髓鞘相关糖蛋白、少突胶质细胞髓鞘糖蛋白是三个经典的MAIs。这三个分子由少突胶质细胞产生,并通过Nogo受体和配对免疫球蛋白样受体B共同的神经受体激活小GTP酶Ras同源基因家族成员(Rho),进而活化的RhoA激活Rho相关激酶抑制中枢神经系统轴突的再生。现就MAIs在中枢神经系统轴突再生中的作用予以综述,并探讨其可能的治疗措施以促进中枢神经轴突再生和功能恢复。     

少突胶质前体细胞分离培养方法及其谱系限定细胞体外分化模型建立的改进

目的：对少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)的分离、培养及传代方法进行改良,探讨体外条件下OPCs的增殖与分化特性。方法： 取新生SD大鼠脊髓来源的细胞分离、纯化OPCs行原代培养,用含碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和血小板源性生长因子-aa(platelet-derived growth factor-aa,PDGF-aa)的培养液作扩增培养,MTT法检测OPCs的增殖能力;三碘甲腺原氨酸和睫状神经生长因子诱导OPCs分化,最终分化为成熟的少突胶质细胞(oligodendrocytes,OLs),并对分化细胞行形态学及免疫化学染色法鉴定。结果：95%以上的细胞具有双极或三极突起的典型OPCs形态并表达A2B5;MTT法检测显示OPCs在体外保持良好的增殖能力;细胞最终诱导分化为成熟的OLs并表达髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)。结论：OPCs在体外条件下可继续保持良好的增殖生长及定向分化能力。