休止期毛乳头细胞差异表达基因的分析

目的筛选休止期毛乳头细胞差异表达基因,探讨脱发机制.方法从同一斑秃患者头皮获得脱发区和非脱发区毛乳头,应用SMART cDNA和抑制性消减杂交建立消减文库,对部分克隆进行杂交筛选、测序及同源性检索分析.结果成功构建了休止期(斑秃脱发区)毛乳头cDNA消减文库,代表毛乳头在休止期表达上调的基因,测序发现1条与甲状腺相关的自身抗原基因,还发现脱发区毛乳头差异表达与抑制性信号转导途径有关的基因.这些基因多是首次发现在毛囊中有表达.结论斑秃毛乳头可能由于表达自身抗原基因而导致针对其的自身免疫反应的启动,后者通过多种信号转导途径影响毛乳头的生长和功能发挥.     

人毛乳头细胞凝集性生长差异表达基因cDNA文库的构建

目的 构建毛乳头细胞凝集性生长状态下差异表达基因的消减cDNA文库。方法 分别提取凝集性生长和非凝集性生长状态下毛乳头细胞中的总RNA，应用SMART cDNA合成技术和抑制性消减杂交技术分离毛乳头细胞凝集性生长状态下差异表达基因的cDNA片段并建立消减cDNA文库；利用PCR对随机挑选的100个白色菌落进行插入片段的验证，对其中证实有插入片段的30个克隆进行cDNA斑点杂交验证。结果 所构建的消减cDNA文库扩增后得到320个阳性克隆，随机挑选的100个阳性克隆中95％的均有长度在100—600bp的插入片段，cDNA斑点杂交验证显示27个(90．0％)克隆为阳性。结论 结合SMART cDNA合成技术，应用抑制性消减杂交成功地构建了毛乳头细胞凝集性生长差异表达基因消减cDNA文库，为进一步筛选和克隆毛乳头细胞凝集性生长相关基因奠定了基础。     

乳腺癌相关差异表达基因的筛选及分析

目的构建乳腺癌组织与癌旁正常乳腺组织差异表达的cDNA消减文库,筛选乳腺癌相关基因并进行分析。方法应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术对15对乳腺癌组织及正常癌旁乳腺组织进行差异基因的消减,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,采用数字表法随机挑选克隆经PCR鉴定后,对200个阳性克隆插入片段的序列进行测定及同源性分析。结果建立了乳腺癌差异表达片段cDNA消减文库;通过测序和同源性分析,得到173个差异表达基因,其中26个与肿瘤发生发展相关;26个基因中有15个已被文献明确报道在乳腺癌组织或细胞中有差异表达。结论应用SSH技术成功建立了乳腺癌差异表达基因cDNA消减文库,为乳腺癌的发病机制研究及寻找潜在的治疗靶点提供了有力的支持。     

应用抑制消减杂交和斑点印迹杂交对膀胱癌差异表达基因的研究

目的：研究膀胱移行细胞癌和正常膀胱黏膜的差异表达基因。方法：应用抑制消减杂交技术(Suppression subtractive hybridization SSH)构建人膀胱移行细胞癌和正常粘膜差异表达的cDNA消减文库，进一步利用斑点印迹杂交(Dot blot)从中筛选出TCC差异表达的基因，随机选取部分克隆进行测序，结果在GenBank中作同源性对比分析。结果：成功构建了具有高消减效率的人TCC的cDNA消减文库，从文库的376个阳性克隆中随机选取100个克隆扩增、筛选后得到89条200～900bp的差异表达基因片段，测序后发现5条未知新基因片段和41种已知基因。结论：利用SSJ和Dot blot研究膀胱癌差异表达基因，为大批量筛选和克隆其差异表达的基因提供了行之有效的方法，也为研究基因功能和TCC的发生机制奠定了基础。     

抑制性消减杂交法构建甲状腺癌差异表达基因文库

目的：筛选并克隆在甲状腺癌组织与正常甲状腺组织之间差异表达的基因。方法：(1)应用抑制性消减杂交(SSH)进行基因差示表达分析,构建人甲状腺癌组织与正常甲状腺组织之间差异表达的cDNA消减文库;(2)克隆、鉴定甲状腺癌组织特异性高／低表达的基因;(3)登录Genbank,运用Blastn程序进行同源性分析。结果：成功构建了高消减效率的人甲状腺癌cDNA消减文库,对其中数个克隆的插入cDNA片段进行测序,经检索Genbank表明,正向SSH产物中有3个片段与来源于结肠上皮腺癌和Lung Epidermoid carcinoma的EST有100％同源性,提示它们来自恶性肿瘤相关基因。反向SSH产物中有5个片段为未知新序列,提示它们可能来自于在甲状腺癌中特异性低表达的新基因。结论：通过抑制性消减杂交技术,构建了人甲状腺癌cDNA消减文库,为下一步筛选鉴定甲状腺癌特异性基因及其全长克隆、功能研究等工作打下了基础。     

肾癌差异表达基因克隆的研究

目的 克隆并鉴定肾癌与正常肾之间差异表达的基因。方法 应用抑制性消减杂交技术构建人肾癌组织与正常肾组织差异表达的cDNA消减文库,并从中克隆鉴定出肾癌差异表达的基因。结果 构建成功了高消减效率的人肾癌cDNA消减文库,对其中5个克隆插入的cDNA片段进行测序后经Genbank检索表明,5个片段均为未知新序列,其中GYIZ-RCC18为3个拷贝,提示以上5个cDNA征段可能来自3个新基因。Northern杂交分析显示,GYIZ-RCC18在肾癌组织中有明显表达,而在正常肾组织中无表达,这证明GYIZ-RCC18是肾癌相关的新基因。结论 人肾癌cDNA消减文库的建立为进一步筛选,克隆肾癌特异性表达的新基因奠定了基础。     

家族性急性髓系白血病差异表达基因的筛选与鉴定

目的分离家族性急性髓系白血病患者骨髓中差异表达的基因,在基因水平上探讨急性白血病发生发展的分子机制。方法应用Super SMART和抑制性消减杂交（SSH）技术,构建家族性急性髓系白血病cDNA消减文库;应用差异筛选技术进行差异表达片段的筛选与鉴定;测序结果进行BLAST同源性比对分析。结果成功构建了家族性急性髓系白血病cDNA消减文库;克隆、筛选并鉴定了17条基因片段,与已知基因同源,11条为未知基因片段。结论SSH技术是筛选差异表达基因的有效方法;获得多个与细胞增殖和分化相关的已知基因;获得11条新基因EST片段,并被GenBank收录。     

应用抑制消减杂交（SSH）克隆肺腺癌多药耐药细胞特异表达基因

目的 克隆和筛选肺腺癌多药耐药细胞特异性表达基因。方法 将肺腺癌多药耐药细胞（SPC-A-1/CDDP）作为实验组。肺腺癌细胞（SPC-A-1）作为对照组,应用抑制消减杂交技术,构建实验组特异表达cDNA消减文件;用斑点杂交初步筛选cDNA消减文库后,将获得的阳性克隆进行测序序和同源性分析（Genebank）。结果 建立了一个肺腺癌多药耐药细胞（SPC-A-1/CDPP）特异表达cDNA消减文库,斑点杂交初步筛选显示23个克隆中有SPC-A-1/CDPP特异表达cDNA片断,测序和同源性分析表明2个cDNA片断为新序列,其余cDNA片断与已知基因有96%～100%的同源性。结论 2个新的cDNA序列可能为未知肺腺癌多药耐药相关基因序列;抑制消减杂交是克隆特异表达基因的有效方法。     

SSH法获取大鼠小脑特异表达cDNA片段

目的获取大鼠小脑特异表达的cDNA序列,比较SSH方法的特点。方法以大鼠大脑和脑干mRNA逆转录cDNA作为driver(驱动)cDNA,大鼠小脑mRNA逆转录cDNA作为Tester(测试)cDNA,经抑制性消减杂交法,去除与大脑及脑干相同的cDNA,从而获得大鼠小脑特异表达基因.然后克隆制备成大鼠小脑特异表达cDNA文库.结果经消减杂交、克隆,挑选出32个阳性质粒.最后用反Northern杂交去除假阳性,筛选出8个有意义的差异表达cDNA基因片段.同时,将测序结果进行同源性比较,发现其中6个cDNA是新EST序列.结论用SSH方法筛选差异表达序列非常有效,特异表达序列分析有助于从分子水平探讨小脑功能.     

甲状腺癌特异性低表达基因的筛选与克隆

目的 筛选并克隆在甲状腺癌组织中特异性低表达的基因。方法 (1)应用抑制性消减杂交(SSH)进行基因差异表达分析，构建人甲状腺癌组织与正常甲状腺组织之间差异表达的cDNA消减文库。(2)克隆、鉴定甲状腺癌组织特异性低表达的基因。(3)登录Genbank，运用Blastn程序进行同源性分析。(4)应用cDNA末端快速扩增法(RACE)获取目的基因TCRS30的cDNA全长。(5)Northem blot验证TCRS30号基因的差异表达。结果 构建了高消减效率的人甲状腺癌cDNA消减文库，通过筛选阳性克隆，获得一个在甲状腺癌组织中低表达的基因片段，经检索Genbank表明，在已知的人类EST数据库中找不到高度同源的序列，提示它可能来自于在甲状腺癌中特异性低表达的新基因。以RACE法获知TCRS30的cDNA全长约为4．5kb，通过Northem blot初步验证了TCRS30号基因在甲状腺癌和正常甲状腺组织中存在差异表达。结论 通过SSH和RACE技术，获得了一个在甲状腺癌和正常甲状腺组织中差异表达的未知基因片段TCRS30，它可能代表着一条对甲状腺癌有抑制作用的新基因。     

人小细胞肺癌多药耐药细胞差异表达基因的克隆研究

目的 构建小细胞肺癌多药耐药细胞(H446/CDDP)差异表达消减cDNA文库.方法 ①以H446/CDDPcDNA为实验方(Tester),小细胞肺癌细胞H446 cDNA为对照方(Driver),应用抑制消减杂交(SSH)技术结合T/A克隆技术构建小细胞肺癌多药耐药细胞差异表达消减cDNA文库.②通过斑点杂交筛选、测序及同源性分析获取H446/CDDP细胞差异表达cDNA片段.结果 成功构建了小细胞肺癌多药耐药细胞H446/CDDP差异表达消减cDNA文库,获得21个H446/CDDP细胞差异表达cDNA片段,经测序及同源性分析表明它们分别代表6个已知基因(同源性为96%～100%).结论 SSH技术是筛选新的功能基因的有效方法;获取的6个差异表达基因可能参与了小细胞肺癌多药耐药细胞H446/CDDP的耐药形成,进一步的功能研究有利于了解它们在小细胞肺癌多药耐药机制中所发挥的作用.     

白血病原代骨髓基质细胞诱导Jurkat细胞基因差异表达研究

目的研究白血病骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)诱导Jurkat细胞相关基因表达的变化.方法采用Percoll体外分离正常人、初治急性白血病患者BMSCs;采用抑制性消减杂交技术建立白血病BMSCs诱导Jur-kat细胞差异表达基因的cDNA文库;并对差异表达的基因进行初步鉴定与分析.结果成功地建立了白血病BMSCs诱导的Jurkat细胞上调和下调差异表达基因的cDNA文库;初步筛选克隆到30个上调差异表达基因和22个下调差异表达基因cDNA片段;这些基因功能主要与细胞周期调控、细胞凋亡、细胞能量代谢有关.结论白血病BMSCs能诱导Jurkat细胞基因发生差异表达.     

Identification of differentially expressed genes in anagen dermal papilla by suppression subtractive hybridization

Background We constructed a cDNA subtractive library of dermal papilla cells (DPCs) in anagen with suppression subtractive hybridization (SSH) technique and clone differentially expressed genes related to DPCs in anagen. Methods Total mRNA was isolated from DPCs of anagen and telogen follicles. Moreover, singlestrand (ss) and double-strand (ds) cDNAs were synthesized in turn using SMART PCR cDNA synthesis technology, ds cDNAs then were digested with Rsa I and divided into two groups, and ligated to the specific adaptor 1 and adaptor 2R, respectively. After cDNAs were hybridized with each other twice and underwent two rounds of nested PCR. PCR products were ligated with arms of T/A plasmid vectors to set up the subtractive library. Selected clones were demonstrated by reverse Northern blot and sequenced. The acquired sequence data were aligned against the Genbank nucleotide database. Results cDNA subtractive library of DPCs in anagen follicles was set up successfully with high subtractive efficiency, Thirty-five genes were identified in this study with 22 known functional genesand 13 unknown functional genes. Conclusions All results confirm the effectiveness and sensitivity of SSH in detecting differentially expressed genes from a small amount of clinical samples. Information about such alterations in gene expression could be useful for elucidating the genetic events in hair follicle growth regulation.     

Screening and analysis of differentially expressed genes of dermal papillae cells with aggregative behavior

Objective: To screen and clone differentially expressed genes of dermal papillae cells (DPC) with aggregative behavior, and to explore the molecular mechanism of their aggregation. Methods: Total RNAs were extracted from DPC with and without aggregative behavior and double strand cDNAs were synthesized by using SMART cDNA synthesis, respectively.The cDNA fragments of differentially expressed genes in DPCs with aggregative behavior were isolated by suppression subtractive hybridization. Positive clones were screened by PCR method and verified by cDNA dot blot, Northern blot and then analyzed through homologous retrieving. Results: A subtractive cDNA library of DPC with aggregative behavior has been successfully constructed. The result of screening and cloniog of the library showed that, DPC with aggregative behavior could expresse genes related to homologous aggregation, proliferation and cycle control, including known genes (capping protein,paladin, vascular endothelial growth factor), hematopoietic stem/progenitor cells (HSPC) related clone ( HSPC011 and HSPC016) and a new gene. Conclusion: The construction of subtracted library of DPC lays solid foundation for screening and cloning new and specific genes related to aggregative behavior of DPC. Several genes might be cooperatively involved in the homologous aggregation, proliferation and cycle control of DPC.Among these genes, capping protein and palladin might be closely related to the aggregative behavior of dermal papilla cells, and VEGF and HSPC related clone would be responsible for the status of higher proliferation of dermal papilla cells.     

高凝状态大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库的构建与初筛

目的构建高凝状态(prothrom botic states,PTS)大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库并进行初步筛选。方法从PTS模型大鼠和对照大鼠肝脏提取po ly A mRNA,分别以po ly A mRNA为模板,依次合成单链和双链cDNA,经酶切成400~600 bp大小的片段。以PTS大鼠cDNA作为T ester,对照大鼠cDNA为D river,进行抑制性消减杂交。将消减杂交第二次PCR产物cDNA克隆至pM D 18-T载体上,然后转化细菌,获得PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库。用巢式PCR扩增法制备“正向”和“反向”消减cDNA探针;采用差异筛选方法,用这两种探针对PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库进行筛选;将获得的阳性克隆cDNA进行序列分析;并与G enB ank DNA数据库中的DNA序列进行同源性分析。结果成功构建了PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库,初步筛选发现两条PTS差异表达cDNA片段。结论成功构建了PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库。     

人脐静脉内皮细胞脂多糖刺激后上调基因表达谱的分析

目的 对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)受脂多糖(LPS)刺激后上调基因表达谱进行筛选及分析。方法 以受LPS刺激HUVEC为实验方，末刺激别HUVEC为驱使方，进行抑制消减杂交(SSH)建立消减cDNA文库，经菌落原位斑点杂交筛选文库后将阳性克隆测序和同源性分析，并用RT-PCR验证新的cDNA序列。结果 共获得25条上调表达的基因，分别与炎症反应、细胞骨架重构、细胞生长和凋亡、胞内信号转导相关，并克隆到3条新基因表达序列标签(EST)，RT-PCR验证了这些新EST序列只在LPS刺激的内皮细胞中表达。结论 抑制消减杂交有效地克隆了人脐静脉内皮细胞LPS刺激后上调表达基因，有助于阐明LPS直接激活血管内皮细胞的分子机制。