皮肤科学基础

20023487他克莫司对角质形成细胞生长的抑制作用及其机制/唐玲(二军大长海医院皮肤科)…∥临床皮肤科杂志。-2002,31(7).-417-418他克莫司(FK506)是一种与环孢菌素A同类的免疫抑制剂。在不同时间段内用不同浓度的FK506处理人类角质形成细胞株HACAT,用MTT法检测FK506抑制HACAT增殖的有效剂量及时间;用流式细胞术(FACS)分析经FK506处理的HACAT表达     

他克莫司对人角质形成细胞蛋白酶活化受体2表达及功能的影响

【摘要】 目的 研究他克莫司对体外培养的人角质形成细胞蛋白酶活化受体2（PAR-2）表达及功能的影响。方法 10-9～10-5 mol/L他克莫司与人角质形成细胞共培养24 h后,采用半定量反转录-聚合酶链反应、免疫荧光和Western印迹分别检测人角质形成细胞PAR-2 mRNA和蛋白表达水平的变化,应用Fluo-4钙荧光探针检测不同浓度他克莫司对人角质形成细胞激活PAR-2后引起的细胞内钙离子浓度变化的影响,以不加他克莫司处理组为对照组。采用单因素方差分析比较各组人角质形成细胞PAR-2表达和细胞内钙离子浓度,LSD-t检验进行两两比较。结果 PAR-2在角质形成细胞的胞膜和胞质表达。角质形成细胞与10-9～10-5 mol/L他克莫司共培养24 h后,PAR-2 mRNA的表达水平与对照组比较均显著降低（均P < 0.05）,且与他克莫司浓度呈负相关（r = -0.962,P = 0.009）。免疫荧光和Western印迹显示,与对照组比较,10-5和10-6 mol/L他克莫司组PAR-2蛋白表达水平显著降低（均P < 0.05）,10-7 mol/L他克莫司组PAR-2蛋白表达水平亦降低（免疫荧光法P < 0.05;Western印迹法P > 0.05）,但10-8和10-9 mol/L他克莫司组PAR-2表达水平变化无统计学意义（均P > 0.05）。共培养24 h后,10-5、10-6和10-7 mol/L他克莫司组PAR-2激活后细胞内钙离子峰浓度（峰值吸光度分别为1 463 ± 283、1 455 ± 270、1 423 ± 291）较对照组（1 602 ± 407）显著降低（t值分别为2.582、2.821、2.923,P值分别为0.032、0.022、0.019）,10-8和10-9 mol/L他克莫司组（分别为1 649 ± 379、1 633 ± 415）变化无统计学意义（t值分别为0.846、0.462,P值分别为0.422、0.657）。结论 他克莫司可抑制人角质形成细胞PAR-2的表达,并抑制PAR-2激动剂所引起的钙离子动员。     

地塞米松和他克莫司对HaCaT细胞热休克蛋白90表达影响的研究

目的:比较地塞米松和他克莫司对HaCaT 细胞热休克蛋白90(HSP90)表达的影响,并探讨其潜在的临床意义.方法:以含10-6 mol/L 地塞米松或10-6 mol/L 他克莫司的DMEM(高糖)培养基培养细胞,在24 h 和48 h 的不同时相点,采用Real timePCR和Western blotting 检测HSP90 的表达.结果:地塞米松作用24 h 后,HSP90 mRNA和蛋白表达水平均升高,48 h 后进一步升高(P ＜ 0.05);而他克莫司作用于HaCaT 细胞后的不同时相点,HSP90 mRNA 和蛋白水平与未处理组相比差异均无统计学意义(P ＞ 0.05).结论:地塞米松可上调角质形成细胞中HSP90 的表达,他克莫司不影响角质形成细胞HSP90 的表达.     

他克莫司影响朗格汉斯细胞迁移机制的研究

目的探讨他克莫司影响朗格汉斯细胞迁移能力的原因。方法用不同浓度的他克莫司处理人角质形成细胞株HaCaT，24h后收集上清液，通过ELISA法检测上清液中的单核细胞化学吸引蛋白质1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP—1)浓度，并通过RT—PCR法检测细胞中MCP—1 mRNA水平。结果经质量浓度为625～5000ng／mL他克莫司处理过的HaCaT株，其分泌至上清液中的MCP-1水平明显受到抑制，细胞中MCP-1 mRNA的水平低于正常对照组。结论他克莫司通过抑制角质形成细胞中MCP-1的分泌、表达，进而影响了朗格汉斯细胞前体及朗格汉斯细胞趋化至皮损处。阻止或减弱了某些免疫反应。     

UVN对角质形成细胞生长的抑制作用及其机制研究

目的：观察UVN（混合紫外线）对角质形成细胞（keratinocytes,KC)生长的抑制作用并分析其机制。方法：将角质形成细胞株HACAT经生理剂量的UVN照射后,通过LEICA显微镜观察其形态,通过四甲基偶氮唑盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]法检测其增殖情况,通过流式细胞术（FACS）分析UVN照射后不同时间HACAT的趋化因子受体CXCR2表达的改变。结果：生理剂量UVN照射HACAT后,部分细胞变圆,少量细胞脱落。照射后24h细胞的增殖受到明显抑制,此时其CXCR2的表达也明显降低,但至48h开始其增殖能力和CXCR2的表达开始恢复,72h后其增殖能力及CXCR2的表达进一步恢复,但与正常对照组间仍见差异。结论：UVN的照射可降低银屑病角质形成细胞CXCR2的表达,这可能因抑制了白细胞介素8（linterleukin 8,IL-8)等细胞生长因子对KC的促增殖作用从而对银屑病表现出一定的治疗效果。     

他克莫司对银屑病皮损中蛋白酶活化受体2表达的影响

目的:明确他克莫司对寻常型银屑病皮损中蛋白酶活化受体2(PAR-2)的影响。方法:免疫组化法(SP法)检测30例寻常型银屑病皮损外用0.1%他克莫司软膏治疗前后及25名正常对照PAR-2的表达情况。结果:银屑病患者皮损内角质形成细胞PAR-2的表达明显高于正常对照;经0.1%他克莫司软膏外用治疗2周后表达明显下降。结论:PAR-2在皮损角质形成细胞内过度表达可被他克莫司软膏抑制。     

他克莫司对HaCaT细胞干细胞因子mRNA及小鼠B16黑素瘤细胞c-kit mRNA表达的影响

目的 探讨他克莫司对角质形成细胞干细胞因子（SCF）mRNA及黑素细胞c-kit mRNA表达水平的影响。方法 分别培养人永生化角质形成细胞（HaCaT）和小鼠B16黑素瘤细胞,经他克莫司作用48 h后,采用实时荧光定量PCR法检测SCF mRNA及c-kit mRNA的表达。结果 他克莫司作用后,HaCaT细胞SCF mRNA、B16黑素瘤细胞c-kit mRNA的相对表达量均升高,与空白对照组比较,差异均有统计学意义（P均 ＜ 0.05）。结论 他克莫司可以上调HaCaT细胞SCF mRNA及B16黑素瘤细胞c-kit mRNA的表达量。     

他克莫司对HaCaT细胞核因子-κB和糖皮质激素受体表达的影响

目的 探讨他克莫司对TNF-α刺激的HacaT细胞核因子-κB(NF-κB)表达的影响,以及对HaCaT细胞糖皮质激素受体(GR)α和β表达的影响.方法 采用Western印迹和免疫荧光-激光共聚焦显微镜技术观察:①以TNF-α(10μg/L)单独或TNF-α(10μg/L)与他克莫司(10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L)同时作用HaCaT细胞,在24h和48h分别观察胞核NF-κB的表达;②以他克莫司(10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L)作用HaCaT细胞,在12h、24h和36h分别观察GRα和GRβ的表达.结果 未处理组HaCaT细胞的胞核有NF-κB(p65)蛋白的表达,灰度值比值为0.4988±0.03506;TNF-α作用24h和48h后,HaCaT细胞胞核NF-κB(p65)表达随时间延长而增强,灰度值比值分别为0.73±0.0316和0.8925±0.0171,与未处理组相比较.差异均有统计学意义(P<0.05).TNF-α与10-8 mol/L、10-7 mol/L、10-6mol/L他克莫司同时作用组HaCaT细胞胞核NF-κB表达灰度值比值分别为0.6825±0.0263、0.6200±0.0163和0.5575±0.0299,NF-κB表达随他克莫司浓度增加而减弱,后两组与TNF-α单独作用组相比,差异均有统计学意义(P<0.05).各浓度他克莫司作用24h和48h的NF-κB表达差异均无统计学意义(P>0.05).与未处理组相比,不同浓度他克莫司作用HaCaT细胞后,各时相点GRα和GRβ的表达差异均无统计学意义(P>0.05).结论 他克莫司能以浓度依赖方式抑制TNF-α刺激的角质形成细胞胞核NF-κB的表达,不影响角质形成细胞GRα和GRβ的表达.     

他克莫司对人角质形成细胞增殖及干细胞因子分泌的影响

目的 探讨他克莫司对人角质形成细胞的增殖及干细胞因子（SCF）分泌的影响。方法 体外HaCaT细胞（人永生化角质形成细胞）培养,用MTT和ELISA分别测定他克莫司对HaCaT细胞增殖及SCF含量的影响。结果 103 nmol/L ~ 104 nmol/L的他克莫司对人HaCaT细胞增殖有抑制作用。10 nmol/L ~ 102 nmol/L的他克莫司可以促进HaCaT细胞SCF分泌量的增加;103 nmol/L的他克莫司对HaCaT细胞SCF的分泌无影响;高浓度104 nmol/L的他克莫司则可抑制HaCaT细胞SCF的分泌。结论 适当浓度的他克莫司能够促进角质形成细胞SCF的分泌。     

维生素D3抑制角质形成细胞CXCR2的表达

目的 观察维生素D3对角质形成细胞表面表达CXCR2的影响,探讨其在治疗银屑病中的作用机制。方法 用不同浓度的维生素D3处理人角质形成细胞株HaCaT,48h后通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测了维生素D3抑制HaCaT增殖的有效剂量;通过流式细胞仪(FACS)分析维生素D3处理的HaCaT表达趋化因子受体CXCR2的情况。结果 HaCaT经维生素D3在8.0×10^-8mol/L～5.12×10^-6mol/L浓度范围内处理48h后的A值较未处理组明显降低(P<0.05).HaCaT在5.12×10^-6mol/L维生素D3处理48h后CXCR2的表达明显低于正常对照组。结论 维生素D3治疗银屑病的作用机制部分是通过抑制角质形成细胞表达CXCR2,从而达到抑制角质形成细胞增殖的目的。     

The inhibitory effect of VitD3 on proliferation of keratinocyte cell line HACAT is mediated by down-regulation of CXCR2 expression

Psoriasis is a disease characterized by inflammation and increased population of hyperproliferative keratinocytes. It is well known that chemokines and chemokine receptors, such as interleukin-8 and its receptors (CXCR1 and CXCR2), play important roles in the pathogenesis of psoriasis. So far, examination of CXCR2 expression in psoriatic lesional keratinocytes by FACS calibur has not been reported and whether VitD3 inhibits psoriatic lesional keratinocyte proliferation through down-regulation of CXCR2 expression has not been elucidated. In the present study, CXCR2 expression in psoriatic lesional keratinocytes and HACAT treated with VitD3 was detected by flow cytometry. The proliferative capacity of HACAT treated with VitD3 was assayed by MTT assay. The results showed that CXCR2 expression in psoriatic lesional keratinocytes was higher than that in normal human keratinocytes. At the correct concentration VitD3 could inhibit human keratinocyte proliferation and down-regulate CXCR2 expression in HACAT. The data demonstrate that the inhibitory effect of VitD3 on keratinocyte proliferation might be mediated by down-regulation of CXCR2 expression.     

维生素D_3抑制角质形成细胞MCP-1的表达

目的　观察维生素D3 对角质形成细胞单核细胞化学吸引蛋白质 1(monocytechemoattractantprotein 1,MCP 1)的表达影响 ,探讨其在治疗银屑病中的作用机制。方法　培养角质形成细胞株HACAT ,并用不同浓度的维生素D3 处理 2 4h ,通过酶联免疫吸附 (ELISA)法检测上清液中MCP 1的表达 ;通过RT PCR法进一步检测细胞中MCP 1mRNA的水平。结果　经过浓度为 7.8× 10 -12 mol/L～ 6.2 5× 10 -11mol/L的维生素D3 处理过的角质形成细胞株HA CAT ,其分泌至上清中的MCP 1水平明显受到抑制 ,细胞中MCP 1mRNA的水平低于正常对照组。结论　维生素D3 在治疗银屑病过程中很有可能是通过抑制了角质形成细胞中MCP 1的表达 ,从而减弱了银屑病患者角质形成细胞趋化单核细胞及巨噬细胞的能力 ,阻止了银屑病皮损局部的炎症反应。     

烟酰胺对紫外线照射后角质形成细胞分泌TGF-β1和CXCR2表达的影响

目的观察烟酰胺对紫外线照射后角质形成细胞HaCaT分泌功能的影响。方法将细胞分为紫外线照射组和未照射两组,分别用浓度为0.1,0.5,1.0,2.0 mg/mL的烟酰胺干预细胞,根据需要选择作用时间为24,48和72 h。采用MTT法测定细胞的增殖,流式细胞仪分析HaCaT细胞CXCR2表达;ELESA测定细胞培养液中TGF-β1含量的变化。结果0.1-2.0 mg/mL的烟酰胺对HaCaT细胞的生长活性无明显影响。不加药物时,经紫外线照射的HaCaT细胞分泌TGF-β1和表达CXCR2均显著强于未照射组(P<0.05),加入0.1-2.0 mg/mL的烟酰胺后,TGF-β1的分泌受到抑制,呈浓度依赖性。而小于0.1 mg/mL的烟酰胺则促进TGF-β1的分泌。TGF-β1的分泌随药物浓度变化的曲线,照射组和未照射组一致。烟酰胺对未照射组细胞上CXCR2表达无明显影响,但0.5-1.0 mg/mL浓度时即显著抑制照射后HaCaT细胞上CXCR2的表达。结论烟酰胺对紫外线照射后角质形成细胞分泌TGF-β1和表达CXCR2有显著抑制作用。     

白介素8及其受体CXCR2在银屑病角质形成细胞中的表达

目的 观察白介素8（IL－8）及基受体CXCR2在银屑病角质形成细胞中的表达及在银屑病的临床及病理表现中的作用。方法 培养银屑病患者皮损处角质形成细胞，通过微孔小室实验检测其上清液的趋化功能，通过酶联免疫吸附法（ELISA）检测上清液中IL－8的表达，通过流式细胞仪分析银屑病患者皮损处角质形成细胞的趋化因子受体CXCR2的表达。结果 银屑病患者皮损处角质形成细胞分泌上清液对中性粒细胞的趋化能力明显强于正常对照组，其分泌的IL－8水平也高于正常人，皮损处角质形成细胞CXCR2的表达也明显强于正常对照组。结论 银屑病患者皮损局部表面出的角质形成细胞高度增殖与角质形成细胞高分泌、高表达具有促增殖作用的IL－8及其受体CXCR2有关，同时皮损局部大量的炎性细胞的浸润部分可能是由于角质形成细胞高分泌具有趋化能力的IL－8，它们可能在银屑病的发生、发展中起着重要作用。     

复方甘草酸苷对体外培养的角质形成细胞的作用

目的观察复方甘草酸苷(CG)对角质形成细胞表达CXCR2及分泌TGF-β1的影响。方法不同浓度CG处理人角质形成细胞株HaCat,MTT法检测CG对HaCat的增殖抑制作用,流式细胞仪分析CG处理后的HaCat细胞的CXCR2表达。培养正常人表皮角质形成细胞,观察CG处理后,培养液中TGF-β1含量的变化。结果50~200μl/m l的CG抑制HaCat细胞的增殖,干预24 h即可见到明显的抑制作用,CXCR2的表达明显低于正常对照组。正常原代角质形成细胞的培养上清中TGF-β1分泌增加。结论50~200μl/m l CG促进素角质形成细胞表达CXCR2和TGF-β1分泌,抑制角质形成细胞的增殖。