复合探针荧光定量PCR检测土拉弗朗西斯菌

目的:建立检测土拉弗朗西斯菌复合探针荧光定量PCR方法。方法:对土拉弗朗西斯菌的FopA基因设计引物和探针,用荧光定量PCR检测,并对特异性、灵敏度和重复性进行评价。结果:本方法对所试验的土拉弗朗西斯菌纯培养物的最低检测浓度为100 CFU/ml,定量的检测变异系数小于5%。在模拟的污染血液样品中的检出限为1×103 CFU/ml。结论:本文建立的复合探针荧光定量PCR方法能高效、敏感、特异地检测土拉弗朗西斯菌。     

土拉菌套式PCR检测技术的研究

[目的]为快速诊断土拉菌病拟建立套式PCR技术。[方法]设计出2对特异引物,取1986年1月收集的13名土拉菌病患者的抗凝血及对照组细菌,提取DNA并进行套式PCR扩增。[结果]套式PCR检测到患者血液中土拉菌阳性率为84.6%,对照组细菌均为阴性。用直接PCR能观察到10条位于900 bp的暗带。而行套式PCR后能观察到11条亮度较高为于550 bp处的条带。[结论]套式PCR方法检测土拉菌具有特异性强、敏感性高,简便快速的特点。     

土拉弗朗西斯菌病的特征与防治

土拉弗朗西斯菌病为一种自然疫源性急性传染病,分布广泛.本文较系统地阐述了土拉弗朗西斯菌病的病原学和流行病学特征、发病机理与病理改变、临床表现与分型、实验室检测技术、临床诊断与治疗和预防控制措施,为我国深入研究与防治提供了参考依据.     

检测土拉弗朗西斯菌的生物素—亲和素ELISA法的建立

〔目的〕建立一种快速、敏感、特异检测土拉弗朗西斯菌的免疫学方法。〔方法〕应用生物素-亲和素标记系统,建立双抗体夹心ELISA方法,检测土拉弗朗西斯菌,并进行"模拟样品"的检测判定其定量检测能力。〔结果〕建立的生物素—亲和素ELISA检测土拉弗朗西斯菌的方法具有很好的敏感性和特异性,检测FopA蛋白的灵敏度达到6ng/ml;批内变异系数1.96%～6.64%,批间变异系数8.94%～10.02%,重复性好;检测不同浓度马秋波GP2蛋白、天花M1R蛋白、黄热YF-E-D3蛋白、禽流感NP蛋白、登革病毒Deng-E-D3蛋白和普氏立克次体120N蛋白,未发现交叉反应;对"模拟样品"中土拉弗朗西斯菌FopA蛋白的检测回收率为91.7%～125.0%。〔结论〕应用生物化的FopA多抗与酶标亲合素结合,建立了检测土拉弗朗西斯菌的生物素—亲和素放大酶联免疫吸附法(BSA-ELISA),具有较好的灵敏度和特异性,在病原菌的识别、快速检测、应对生物恐怖威胁中具有广阔的应用前景。     

初步研究我国土拉菌的亚种及遗传进化关系

目的研究我国土拉弗朗西斯菌（土拉菌）亚种类型及各菌株之间的遗传进化关系。方法对于来源于我国北方地区的10株土拉菌,采用2种型特异引物C1C4和RD1进行PCR,根据扩增产物片段长度来判断所属亚种;同时,使用fopA、tul4和16SrRNA引物,进行3种特异基因的PCR,然后测序;这10株土拉菌及网上已公布基因组序列的3株B型土拉菌、1株subsp.novicida,应用MEGA4软件,进行3种特异基因为基础的系统进化分析。结果采用2种型特异引物C1C4和RD1,鉴定10株土拉菌均为B型亚种;根据MEGA4构建的进化树,我国10株土拉菌可以分为2种基因型,410108、410109和410111为B1型,另外7株土拉菌为B2型;而国外的3株B型土拉菌归为B3型。结论我国北方地区分离的土拉菌可能以B型为主,对于土拉菌B型亚种的起源,我国土拉菌可能早于欧美国家。3种基因为基础的系统进化分析可作为土拉菌基因分型的一种可靠方法。     

中国土拉弗朗西斯菌holarctica亚种的遗传多样性

目的 研究国内外土拉弗朗西斯菌的遗传进化关系。方法 选择17个单核苷酸多态性、4个插入/缺失和12个可变数目串联重复,采用单核苷酸多态性和插入/缺失、多位点可变数目串联重复分析方法单独和组合起来对39株土拉菌(10株中国土拉菌和29株已公布测序的土拉菌)进行系统进化分析。结果 组合分析显示,3株中国土拉菌和日本的FSC022被分配到B5;剩余3株中国土拉菌和瑞典的FSC200被分配到B1;3株和美国的OSU18被分配到B2;1株和法国的FTNF002-00、德国的F92与美国的OR96246一起被分配到B4。10株中国土拉菌分为4种亚型,研究表明中国土拉菌具有广泛的遗传多样性。结论 本研究针对土拉菌B型建立了一套简易高效的分型方法,并以此为基础得出土拉菌B型的起源可能是亚洲地区。     

聚合酶链反应和平板计数检测土拉弗氏菌气溶胶稳定性的比较

为了提高检测生物气溶胶的特异性和敏感性，分别用平板计数和聚合酶链反应（ＰＣＲ）对土拉弗氏菌气溶胶的稳定性进行了研究。结果表明ＰＣＲ对细菌数目的估计高于平板计数结果，并且ＰＣＲ在采样后的３ｈ就可以得出定性结果，而土拉弗氏菌平板计数则需要３～７天。     

PCR法检测食品中的致病性小肠耶尔森氏菌

目的：快速准确地检测致病性小肠耶尔森氏菌（YE）。方法：根据该菌染色体上ail基因顺序设计一对引物、通过聚合酶链反应直接检测食品中的致病性YE，扩增产物经电泳，出现与已知阳性对照细菌条带大小一致的170bp的ail基因片断的条带，即判定该样品为阳性，结论：本法特异性强，灵敏度高，能在60小时内出结果，可适用于食品中的YE的快速检验。     

土拉弗氏菌病的研究进展

土拉弗氏菌病(Tularaemia,或称野兔热、鹿蝇热)是一种急性、感染性人兽共患疾病,发生在北半球的多数国家,流行于北纬30°~71°地区。其致病菌是土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis,简称土拉弗氏菌)。1912年McCoy从美国土拉县的黄鼠中分离出一株新菌种,根据该地地名命名为土拉菌。1919年,美国首都华盛顿的一名公共卫生官员E·Francis被派到犹他州调查鹿蝇热病,做了大量研究工作,鉴于E·Francis的贡献,该菌重命名为土拉弗朗西斯菌[1]。1病原学土拉弗氏菌为需氧球杆状小杆菌(0·2μm×0·2~0·7μm),无芽孢,无动力;革兰氏染色阴性,染色…     

应用PCR法检测沙门菌

目的 研究沙门菌的PCR检测方法.方法 引物选择沙门菌的hilA基因,应用PCR法检测沙门菌.结果 PCR能检测经选择性增菌液培养的沙门菌,扩增片段在497 bp.结论 应用PCR检测沙门菌,具有快速、特异、灵敏和简便的特点.     

应用聚合酶链反应（PCR）快速检测和鉴定小肠结肠炎耶尔森氏菌

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）快速检测和鉴定小肠结肠炎耶尔森氏菌北京市卫生防疫站（１０００１３）刘园王斌任保国近年来，小肠结肠炎耶氏森氏菌（以下简称耶氏菌），在急性感染性腹泻病中所占的比例不断升高，因而越来越受到人们的重视。目前，检测耶氏菌的方法仍应用细...     

三基因PCR检测产毒性大肠杆菌和志贺菌的研究

三基因ＰＣＲ检测产毒性大肠杆菌和志贺菌的研究赵敏俞守义王红王雅贤吴敏在发展中国家，每年大约有五百万左右的儿童和婴儿死于急性腹泻［１］。这种疾病的致病因素主要是产毒性大肠杆菌（ＥＴＥＣ）和志贺菌。ＥＴＥＣ在生长繁殖过程中释放出耐热肠毒素（ＳＴ）和不耐热...     

单核细胞增生李斯特菌PCR鉴定技术的研究

目的建立单核细胞增生李斯特菌PCR鉴定技术.方法选择Hly Inl基因设计扩展片段分别为300～400bp、600～700bp的二对特异性引物,进行PCR扩增.结果单增李斯特菌标准菌株及本实验室分离保存的单增李斯特菌均扩增出两条明显条带,其它食品中常见致病菌及非单核细胞增生李斯特菌均不见扩增条带.52株李斯特菌生化符合菌中,有30株菌同时扩增出两条明显条带,与Mini-VIDSA测定法比较,两者符合率达92.31%.结论本实验建立的PCR鉴定技术为一种简便、快速、敏感、特异的单增李斯特菌鉴定方法.     

直接酶联免疫吸附法和聚合酶链反应联合检测沙门菌的应用

目的　通过比较试验 ,得到准确、快速的沙门菌检测方法。方法　 2 2 8株沙门菌经过前增菌、选择性增菌后 ,采用在聚合酶链反应 (PCR)和酶联免疫吸附法 (ELISA)同时检测 ,并将 2种快速检测方法进行比较研究。结果　PCR法的敏感性优于直接ELISA法 ,2种方法的检测符合率达 99%以上。直接ELISA结合PCR法对饮食行业工作人员健康检查的 15 4 6份人粪便样品进行检测 ,同时以国家标准方法为参照 ,直接ELISA法的敏感性和特异性达 10 0 %和 97 14 % ,PCR法的敏感性和特异性均为 10 0 %。结论　优化的沙门菌检测程序是对大量样品采用直接ELISA筛检 ,除去大量阴性样品 ,阳性样品用PCR法作进一步鉴定 ;血清型的确定用国家标准方法。     

多重实时PCR快速同时检测沙门菌和志贺菌

目的 建立改良分子信标，多重实时PCR同时检测沙门菌和志贺菌的快速方法，应用于食源性致病菌的快速诊断。方法 根据GenBank公布的沙门菌侵袭性基因invA和ssaR基因，分别设计一对引物和改良分子信标探针，用同色荧光标记，用于同体系检测沙门菌。志贺菌根据ipaH基因的保守序列，设计引物和改良分子信标探针，加入沙门菌检测体系中，建立三重实时PCR一改良分子信标检测体系，应用于同时对沙门菌、志贺菌食物中毒的快速诊断和门诊肠道致病菌的检测。结果 改良分子信标一多重实时PCR反应体系DNA灵敏度为69～93fg/μl。菌液灵敏度为32～64CFU／ml或1～2CFu／PCR反应体系，无交叉反应。该反应体系同时检测134株沙门菌和67株志贺菌，均出现特异的荧光信号，两种细菌检测互不干扰。对细菌性食物中毒样本等共1100份同时进行沙门菌和志贺菌检测，569份沙门菌实时PCR阳性，其中551份沙门菌培养阳性；42份志贺菌实时PCR阳性，其中41份志贺菌培养阳性。从样品处理到检测结果仅需时间2h至1d。结论 改良分子信标-多重实时PCR检测体系快速、灵敏度高，特异性强，可用于沙门菌和志贺菌食物中毒的快速诊断，伤寒、痢疾等肠道传染病的初筛及预防医学门诊的健康人群体检，为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

荧光定量PCR技术在乙型肝炎诊断与治疗上的应用价值

目的 评价荧光定量PCR(FQ-PCR)技术在乙型肝炎(乙肝)的诊断与治疗上的应用价值.方法 采用FQ-RCR和ELISA法,检测258份血清及100例乙肝免疫指标全阴性的对照血清的HBV DNA拷贝数和免疫学指标.结果 123份HBsAg、HBeAg和抗-HBc均阳性的样本中FQ-PCR检测HBV DNA阳性120份,阳性率为97．6％.在108份HBsAg、抗-HBe和抗-HBc均阳性的样本中,FQ-PCR阳性43份,阳性率为39．8％,高于普通PCR 19．8％的阳性率.在100例阴性对照血清中,FQ-PCR全部阴性.结论 FQ-PCR在乙肝诊断、治疗方案选择和疗效观察方面具有广泛的应用前景.     

抗-HGV抗体酶联免疫试验法(EIA)与HGV PCR法检测结果比较

用抗－ＨＧＶ抗体酶联免疫试验法（ＥＩＡ）和ＨＧＶＲＴ－ｎＰＣＲ方法分别检测１００例正常献血员血清和４９例非甲～戊型肝炎患者血清。结果：在１００例健康献血员中,两法的符合率为９４％,但在４９例非甲～戊型肝炎患者中,两法的符合率仅为６３．３％。提示抗－ＨＧＶＥＩＡ法可用于献血员的筛查,但诊断ＨＧＶ感染应同时应用抗ＨＧＶＥＩＡ和ＨＧＶＲＮＡＲＴ－ｎＰＣＲ法。     

实时荧光定量PCR法与常规PCR法检测沙门菌的比较

目的:比较实时荧光定量PCR法、常规PCR法检测沙门菌的灵敏度与特异性。方法:采用建立的实时荧光定量PCR、常规PCR方法,同时对沙门菌等细菌进行检测。结果:实时荧光定量PCR检测的灵敏度可达33 cfu/m l,且有很高的特异性,对金黄色葡萄球菌等10种相关细菌均无交叉反应,从细菌核酸提取至完成检测仅需3 h左右。结论:实时荧光定量PCR检测由于在密封环境中进行,避免了产物与环境间的交叉污染,且是2种方法中最为快速敏感的方法,适用于临床实验室的快速诊断。     

262例HBV感染者PCR与ELISA检测结果分析

对２６２例确诊的乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）感染者用聚合酶链反应检测血清ＨＢＶ－ＤＮＡ,用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）检测血清ＨＢＶ的五项标志。结果显示,ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、抗－ＨＢＣ同时阳性者,ＨＢＶ－ＤＮＡ的阳性率为９７．０６％,ＨＢｓＡｇ、抗－ＨＢｅ、抗－ＨＢｃ同时阳性者,ＨＢＶ－ＤＮＡ的阳性率为８９．４７％,ＨＢｓＡｇ、抗－ＨＢｃ同时阳性者,ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性率为８１．８２％。提示：ＰＣＲ对ＨＢＶ及其传染者的检测更敏感、直接。     

食品中单核细胞增生李斯特菌PCR快速检测方法

[目的]建立食品中单核细胞增生李斯特菌的快速、敏感、特异的PCR检测方法。[方法]选择Hly基因作为靶序列设计一对引物，用该引物对单增李斯特菌和10株非单增李斯特菌进行PCR扩增，并且用此方法对30份食品进行检测。[结果]扩增片断表现出极好的单增李斯特菌特异性，最低检出限为190cfu/ml。[结论]本实验建立的PCR检测方法为一种简便、快速、敏感、特异的单增李斯特菌检测方法。