携带HuIL—3基因的人肝癌特异性逆转录病毒转体的构建

构建携带人白细胞介素ｃＤＮＡ的人肝癌特异性闻生转录病毒载体。将ＨｕＩＬ－３ｃＤＮＡ克隆到逆转录病毒载体ｐＭＮＳＭ的ＰＬ位点，构建ＳＶ４０早期启动子驱动的载体ｐＭＮＳ－ＩＬ－３；从质粒ｐＧＥＭ，７Ｚｆ－ＡＦＰｅ中游离人甲胎蛋白增强子核心序列，先克隆 到ｐＭＮＳＭ的ＰＬ位点上，     

体外检测近交系小鼠HBsAg特异性细胞毒T淋巴细胞方法的建立

通过磷酸钙法用含ＨＢＶＳ基因的质粒ｐＲｃ／ＣＭＶＳ与含筛选标记基因－ｎｅｏ基因的质粒ｐＳＶ２－ｎｅｏ对ＢＡＬＢ／Ｃ近交系小鼠肥大细胞瘤细胞株Ｐ８１５细胞进行了质粒共转染，并经Ｇ４１８筛选得到了Ｇ４１８抗性细胞，即Ｐ８１５－Ｓ细胞，斑点杂交和免疫组化实验分别证实Ｐ８１５－Ｓ细胞内有ＨＢＶＳ基因的存在；Ｐ８１５－Ｓ细胞浆内和膜上有ＨＢｓＡｇ的表达。表明了Ｐ８１５－Ｓ细胞要作为体外检测ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠Ｈ     

人白细胞介素—2基因真核表达载体pDORIL—2的构建

构建逆转录病毒载体介导的人白细胞介素－２（ＩＬ－２）基因真核细胞表达载体。方法：合成带有和表达载体克隆位点相匹配酶切位点的聚合酶链式反应（ＰＣＲ）引物，用ＰＣＲ方法从质粒ｐＨＩＧ５３中扩增出人的ＩＬ－２ｃＤＮＡ，将其定向克隆入表达载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ。结果：ＰＣＲ扩增出的ＩＬ－２ｃＤＮＡ片段约４７５ｂｐ，酶切鉴定该片段已被克隆入ｐＤＯＲ－ｎｅｏ的多克隆位点，构建成人ＩＬ－２基因真核表达载体ｐＤＯＲ     

携带HSV—tk基因的人肝癌特异性逆转录病毒载体的构建

构建携带单纯疱疹病毒ｔｋ基因的人肝癌特异性逆转录病毒载体。切除逆转录病毒病毒载体ｐＭＮＳＭ内部的ＳＶ４０启动子使之成为ＰＭＮＭ；从真核表达载体ＰＢＰＧＫ－ｔｋ质粒中游离带有磷酸甘油酸激酶基因启动子调控的ＨＳＶ－ｔｋ片段，克隆到ＰＭＮＭ的ＰＬ位点上，构建成普通型ＰＭＮＰ－ｔｋ逆转录病毒载体；从ＰＧＥＭ，７Ｚ－ＡＦＰｅ质粒中游离人甲胎蛋白基因增强子核心序列，克隆到ＰＭＮＰ－ｔｋ的ｐｇｋ启动子上游，构建     

携带HSV－tk基因的人肝癌特异性逆转录病毒载体的构建

构建携带单纯疱疹病毒ｔｋ基因（ＨＳＶ－ｔｋ）的人肝癌特异性逆转录病毒载体。方法和结果：切除逆转录病毒载体ｐＭＮＳＭ内部的ＳＶ４０启动子使之成为ｐＭＮＭ；从真核表达载体ｐＢＰＧＫ－ｔｋ质粒中游离带有磷酸甘油酸激酶基因（ｐｇｋ）启动子调控的ＨＳＶ－ｔｋ片段，克隆到ｐＭＮＭ的ＰＬ位点上，构建成普通型ＰＭＮｐ－ｔｋ逆转录病毒载体；从ｐＧＥＭ．７Ｚ－ＡＦＰｅ质粒中游离人甲胎蛋白基因增强子核心序列，克隆到ｐＭＮｐ－ｔｋ的ｐｇｋ启动子上游，构建成人肝癌特异型ｐＭＮＡＰ－ｔｋ逆转录病毒载体。结论：该载体对肝癌特异性前药转换基因治疗有重要意义。     

白细胞介素—2—乙肝病毒前S抗原融合蛋白在真核细胞中的分泌…

为了协同人白细胞介素－２与乙型肝炎病毒前Ｓ抗原的生物学功能，探索能打破持续性感染者对ＨＢＶ表面抗原的免疫耐受，诱导机体对ＨＢｓ－Ａｇ和ｐｒｅＳＡｇ产生体液和细胞免疫应签的基因免疫与治疗药物，用基因重组方法构建了ＩＬ－０２和ＨＢＶ完整ｐｒｅＳＡｇ的真核表达合基因及表达质粒ｐＣＷＩＩＰ。ｐＣＷＩＩＰ转染的Ｃｏｓ－７细胞能分泌表达ＩＬ－２－ｐｒｅＳ融合蛋白，其表达效率与ｐＣＩＩＬ－２转染的细胞表达ＩＬ－     

谷胱甘肽巯基转移酶pi参与肿瘤细胞耐药性的产生

目的建立携带大鼠谷胱甘肽巯基转移酶ｐｉ（ＧＳＴ－ｐｉ）ＣＤＮＡ的细胞表达体系。方法用磷酸钙沉淀法将重组质粒ｐＳＶ－ＧＴ和载体质粒ｐＳＶ－ｎｅｏ分别转染ＨｅＬａ细胞,Ｇ４１８筛选得两株转染阳性细胞ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ＧＴ和ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ｎｅｏ;采用细胞原位杂交法,以地高辛标记的ＧＳＴ－ｐｉ　ｃＤＮＡ为探针,检测两细胞株ＧＳＴ－ｐｉｍＲＮＡ的表达水平;用ＭＴＴ法检测不同抗癌药物对细胞株的毒性作用。结果ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ＧＴ的ＧＳＴ－ｐｉｍＲＮＡ表达明显升高,而ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ｎｅｏ和ＨｅＬａ细胞的表达水平很低。阿霉素、丝裂霉素Ｃ和顺铂对ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ＧＴ的ＩＣ５０分别为７０．１３、１０．９５和１６．５２ｕｇ／ｍｌ,对ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ｎｅｏ的ＩＣ５０分别为１０．３４、７．４８和１３．７０ｕｇ／ｍｌ,长春新碱对两细胞株的毒性无明显差别。结论ＨｅＬａ／ｐＳＶ－ＧＴ细胞具有较高的耐药性。ＧＳＴ－ｐｉｍＲＮＡ的大量表达可能是产生多药耐药的原因,此细胞株可作为一个稳定的遗传学系统在ＧＳＴ－ｐｉ与肿瘤细胞耐药的研究中广泛应用。     

白细胞介素-2基因对丙型肝炎病毒E2基因免疫效果的调节作用

目的 研究白细胞介素２（ＩＬ－２）基因对丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｅ２基因免疫小鼠后效果的调节作用。方法 构建Ⅱ型ＨＣＶ Ｅ２基因的真核表达载体ｐ３Ｅ２，免疫组化法检测其在哺乳动物细胞中的表达情况。用ｐ３Ｅ２单独或连同ＩＬ－２真核表达质粒一起对ＢＡＬＢ／ｓ小鼠进行尾部皮下注射，酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）法检测Ｅ２抗体的产生情况。结果 Ｅ２蛋白在哺乳动物细胞中得到瞬时表达。应用ｐ３Ｅ２单独或连同ＩＬ     

切割bcl─2RNA核酶的逆转录病毒载体的构建与鉴定

目的：构建逆转录病毒载体介导的切割ｂｃｌ－２ＲＮＡ的核酶（ＲＺ）基因真核细胞表达载体．方法：合成带有和表达载体克隆位点相匹配酶切位点的ＲＺ基因，先克隆于ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（－）的ＨｉｎｃⅡ位点，命名为３ＺＲＺ（＋）／（－），用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法进行测序，体外转录，进行体外切割反应．ＲＺ基因酶切回收后，定向克隆于逆转录病毒载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ中．结果：ＲＺ基因序列正确，具有切割活性，经酶切鉴定ＲＺ基因已被克隆于ｐＤＯＲ－ｎｅｏ的ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ位点，重组逆转录病毒载体命名为ｐＤＲＺ－ＲＺ．结论：体外合成ＲＺ基因后，可定向克隆逆转录病毒载体，为细胞内合成ＲＺ提供了手段     

腺病毒和腺伴随病毒基因元件提高白细胞介素6在真核细胞中的表达效率

目的：构建高效真核表达载体以提高细胞因子在真核细胞中的表达效率。方法：利用基因克隆技术构建了两个新的白细胞介素６（ＩＬ６）真核表达载体ｐＡｄＣＩＩＬ６和ｐ３３５ＣＩＬ６。将它们瞬时转染ＣＯＳ７细胞后，利用ＩＬ６依赖株７ＴＤ１对上清中的ＩＬ６进行检测。结果：两种新建载体分别能提高ＩＬ６在真核细胞中的表达效率５．５和３．４倍。结论：腺病毒的病毒相关Ⅰ和ⅡＲＮＡ（ｖｉｒｕｓａｓｏｃｉａｔｅｄⅠａｎｄⅡＲＮＡ，ＶＡⅠａｎｄＶＡⅡ）和腺伴随病毒（ａｄｅｎｏａｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ，ＡＡＶ）的倒转末端重复序列（ｉｎｖｅｒｔｅｄｔｅｒｍｉｎａｌｒｅｐｅａｔ，ＩＴＲ）能提高细胞因子在真核细胞中的表达     

人分泌型白细胞介素2受体α链基因的克隆及其在真核细胞中的表达

删除人白细胞介素－２受体α链ｃＤＮＡ中编码胞质内１３个氨基酸及跨膜区１９个氨基酸残基的ＤＮＡ片段后，接上人工合成的终止寡核苷酸片段，改建后的ｃＤＮＡ与真核表达载体ｐＲｃ／ＣＭＶ重组成质粒ｐＣＭＶ／ｒｓＩＬ２Ｒ。用电打孔及磷酸钙法将此质粒转染ＣＨＯ细胞，经Ｇ４１８筛出表达Ｎｅｏ基因的克隆２０株，通过ｍＲＮＡ狭缝杂交及ＥＬＩＳＡ检测，有５株能稳定表达分泌型α链ｍＲＮＡ及蛋白，其中４株细胞培养上清中的ＩＬ２Ｒα链的含量达１４００Ｕ／ｍｌ以上。     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白—2基因克隆及其在大肠杆菌中 …

目的：克隆恶性疟原虫裂殖子表面蛋白２全基因,并在大肠杆菌中进行表达。方法：采用ＰＣＲ扩增恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株ＭＳＰ２基因,克隆插入ｐＵＣ１９,并重组人表达质粒载体中,转化大肠杆菌,诱导重组质粒ｐＢＫ－ＣＭＶ／ｍｓｐ２表达ＭＳＰ２蛋白抗原,对表达产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｗｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定。结果：ＰＣＲ扩增出８２４ｂｐＤＮＡ片段,经酶切鉴定和部分序列测定证实为Ｍ     

切割bcl—2RNA核酶的逆转录病毒载体的构建与鉴定

构建逆转录病毒载体介导的切割ｂｃｌ－２ＲＮＡ的核酶（ＲＺ）基因真核细胞表达载体，方法：合成带有和表达载体克隆位点相匹配酶切位上的ＲＺ基因，先克隆于ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（－）的ＨｉｎｃⅡ位点，命名为３ＺＲＺ（＋）／（－），用Ｓ ａｎｇｅｒ以脱氧链终止法进行测序，体外转录，进行体外切割反应，ＲＺ基因酶切回收后，定向克隆于逆转录病毒载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ中，结果：ＲＺ基因序列正确，具有切割活性，经酶切鉴定ＲＺ     

人白细胞介素－2基因真核表达载体pDORIL－2的构建

目的：构建逆转录病毒载体介导的人白细胞介素－２（ＩＬ－２）基因真核细胞表达载体．方法：合成带有和表达载体克隆位点相匹配酶切位点的聚合酶链式反应（ＰＣＲ）引物，用ＰＣＲ方法从质粒ｐＨＩＧ５３中扩增出人的ＩＬ－２ｃＤＮＡ，将其定向克隆人表达载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ．结果：ＰＣＲ扩增出的ＩＬ－２ｃＤＮＡ片段约４７５ｂｐ，酶切鉴定该片段已被克隆人ｐＤＯＲ－ｎｅｏ的多克隆位点，构建成人ＩＬ－２基因真核表达载体ｐＤＯＲＩＬ－２．结论：用ＰＣＲ扩增目的基因片断，有快速、获得量大、可改变酶切位点等优点；ｐＤＯＲＩＬ－２的构建成功，为开展基因治疗的研究打下了基础。     

人分泌型白细胞介素2受体α链基因的克隆及其在真核细胞…

删除人白细胞介素－２受体α链ｃＤＮＡ中编码胞质内１３个氨基酸及跨膜区１９个氨基酸残基的ＤＮＡ片段后，接上人工合成的终止寡核苷酸片段，改建后的ｃＤＮＡ与真核表达载体ｐＲｃ／ＣＭＶ重组成质粒ｐＣＭＶ／ｒｓＩＬ２Ｒ。用电打孔及磷酸钙法将此质粒转染ＣＨＯ细胞，经Ｇ４１８筛出表达Ｎｅｏ基因的克隆２０株，通过ｍＲＮＡ狭缝杂交及ＥＬＩＳＡ检测，有５株能稳定表达分泌型α链ｍＲＮＡ及蛋白，其中４株细胞培养上清中的Ｉ     

HIV—1p24pag与hIL—2基因在重且痘苗病毒中的共表达研究

研究ＨＩＶ－１ｐ２４ｇａｇ与ｈＩＬ－２基因在重组痘苗病毒中的共表达。方法：以痘苗病毒复制非必需区血凝素基因为侧翼，将编码人白细胞介素的基因片段克隆到真核表达质粒ｐ１６ＱＦ２４－ＩＬ２，经同源重组和血凝素阴性空斑筛选，获得了重组痘 苗病毒ｖ１６ＱＦ２４－ＩＬ２。     

质粒单独转染与共转染哺乳动物培养细胞的对比研究

我们对ＢＡＬＢ／Ｃ近交系小鼠肥大细胞瘤细胞株Ｐ８１５细胞通过鳞酸钙围染技术，用含ＨＢＶＳ基因的质粒ｐＲｃ／ＣＭＶＳ与含筛选标记基因ｎｅｏ’基因的质粒ｐＳＶ２－ｎｅｏ进行了共转染，用含ＨＣＶＣ，Ｅ１，Ｅ２以及ｎｅｏ基因的质粒ｐＲｃ／ＣＥ２进行了单独转染，经Ｇ４１８筛选，分别获得了Ｇ４１８抗性细胞；Ｐ８１５－Ｓ和Ｐ８１５－ＣＥ２细胞，提示单独转染与共转染的获成功，进一步证实的质粒单独转染与共转染哺乳支     

丙肝病毒非结构蛋白基因3的克隆及其体外诱导表达

目的：研究丙型病毒非结构蛋白基因３（ｎｓ３基因）在体外真核细胞中的诱导表达。方法：以ＰＣＲ方法从含ＨＣＶｎｓ３基因的重组载体ｐＢｎｓ３中扩增出ｎｓ３基因，并将其插入到克隆载体ｐＧＥＭ－Ｔ中，再与表达载体ｐＭＳＧ重组，以利到重组表达载体ｐＭＳＧ－ｎｓ３。然后采用磷酸钙沉淀法将其转染哺乳动物ＣＨＯ细胞，经地塞米松（ＤＭ）诱导，采用ＥＬＩＳＡ及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ技术检测ＮＳ３蛋白的表达水平。结果：     

人白细胞介素2基因转移表达及抗乙型肝炎病毒和诱导LAK细胞活性的研究

为了探讨白细胞介素（ＩＬ）－２转基因表达抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的作用，应用逆转录病毒载体ｐＺＩＰＳｖ（Ｘ）－包装细胞系ＰＡ３１７基因转移系统，研究了人ＩＬ－２ｃＤＮＡ转移和表达，以及抗ＨＢＶ和诱导淋巴因子激活的杀伤细胞（ＬＡＫ细胞）的作用。所构建的人ＩＬ－２重组表达载体ｐＺＩＰｈｕＩＬ－２，以ＤＮＡ－磷酸钙共沉淀技术转染ＰＡ３１７细胞，筛选到Ｇ４１８抗性克隆，分泌假病毒颗粒达１０６ＣＦＵ／ｍｌ。以假病毒颗粒感染２．２．１５细胞系及正常人外周血单个核细胞，分泌ＩＬ－２水平可达６ＩＵ／ｍｌ，明显抑制２．２．１５细胞ＨＢｓＡｇ的分泌表达，与１００ＩＵ／ｍｌ重组的ＩＬ－２一样可诱导出相似的ＬＡＫ细胞活性。而不含ＩＬ－２ｃＤＮＡ的ｐＺＩＰＳＶ（Ｘ）的假病毒颗粒则无此作用。提示逆转录病毒载体。包装细胞系可以成功地实现人ＩＬ－２ｃＤＮＡ的转移和低水平的分泌和表达，并可明显抑制２．２．１５细胞分泌ＨＢｓＡｇ及诱导ＬＡＫ细胞活性。     

HIV-1 p24 gag 与hIL-2基因在重组痘苗病毒中的共表达研究

目的：研究 Ｈ Ｉ Ｖ １ｐ２４ ｇａｇ 与 ｈ Ｉ Ｌ ２基因在重组痘苗病毒中的共表达。方法：以痘苗病毒复制非必需区血凝素（ Ｈ Ａ）基因为侧翼,将编码人白细胞介素２（ｈ Ｉ Ｌ ２）的基因片段克隆到真核表达质粒ｐ１６ Ｑ Ｆ２４ Ｉ Ｌ２,经同源重组和血凝素阴性空斑筛选,获得了重组痘苗病毒ｖ１６ Ｑ Ｆ２４ Ｉ Ｌ２。结果：经间接免疫荧光试验、 Ｄｏｔ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 和 Ｗ ｅｓｔｅｒｎ ｂｏｌｔ 等检测证明,重组病毒能同时表达ｐ２４ ｇａｇ 蛋白和 Ｉ Ｌ ２蛋白,表达产物分子量分别为２４ ０００、１６ ０００。结论：这种重组痘苗病毒人表达外源蛋白的成功,为获得更强的免疫效果,研制 Ｈ Ｉ Ｖ 重组病毒活疫苗提供一种安全的新途径。